專利名稱：介孔納米粉體羥基磷灰石的微生物催化合成方法
介孑lift微體羥基磷灰石的微生物催化合成方法駄領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種介孑li內(nèi)，體羥基磷灰石(HAp)的微生物催化合成方法。 背景駄近年來，關(guān)于納米羥基磷灰石的制備方法的報導(dǎo)很多，主要有干齢成和濕齢成。而實驗 室合成方法中 泛的是濕^"成，主要包括沉淀法、溶膠; 法、7jC熱反應(yīng)法、■,。但是現(xiàn)有方法制備的顆粒團聚嚴(yán)重，活性低，制備工藝鋭且成本高，應(yīng)用效果糖，難于推廣應(yīng)用。HAP超細(xì)粉體的合成方法巳在國際上取得了一些進展，但多數(shù)方法還處于實驗室階段，如何選軒同的制備斜牛，控制HAp粉體的形態(tài)和粒徑,進行大批量生產(chǎn)，以滿足生物醫(yī)學(xué)對羥M灰石超細(xì)粉體的需求，仍是一個需要大穀斗學(xué)工作者努力的方向。納米結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究是納米生物技術(shù)的基礎(chǔ)和依托核心，以復(fù)雜介孔結(jié)構(gòu)納米微粒作為抗癌藥物和基因轉(zhuǎn)移載體，比表面積大、生物活性高、表面活性中心多，可以進行納米組裝復(fù) 合，離癌藥物、DNA和RNA難因治療針鍵在納米顆粒的介孔之中或吸附在其表面，可以 調(diào)節(jié)控制釋藥鵬、增加生物膜的艦性、改變在體內(nèi)的分布，提高生物禾傭度、難溶藥物的溶 解率、吸收率和藥物療效。研究表明，以微生物活體細(xì)胞為反應(yīng)器，合成的介 LHAp/prctein納米 復(fù)鎖體藥物載體具有開放的生物骨架螺旋結(jié)構(gòu)和蠕蟲狀狹縫 Ut有棘孔結(jié)構(gòu)，介 L L徑分布 范圍寬240nm,HAp的顆粒平均尺寸為5-20nm，蛋白質(zhì)含量高恐0.85%，不需要除去模板，顆粒表 面帶正電荷，會旨魏紫紅熒光，具有S^光性能和較強的il7K性，并具有良好的細(xì)胞親和性、生 物,性和生物相容性，易于在其表面耦微寺異性的靶向分子，實現(xiàn)基因治療的特異性，M成 分控制和結(jié)構(gòu)設(shè)計及結(jié)晶度的控制調(diào)節(jié)，生物(W的速率可以控制，并可,孕M體細(xì)胞正常代 謝物質(zhì)，無毒副作用。應(yīng)用微生物技術(shù)研究開發(fā)新型納米無機載^W才料，,、割戈傳統(tǒng)化學(xué)制 備技術(shù)，加快醫(yī)用納米生物材料產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化是當(dāng)代醫(yī)用生t/t才料工業(yè)的一個重要發(fā)展方向。 模擬生物礦化也是近幾年最前沿的研究領(lǐng)域，微生物催化綠色合成新技術(shù)是以微生物學(xué)和納
米^相結(jié)合*^^合成納米生物材料的新興 學(xué)科，Nature和Science ^頂級國際期刊上近 年，續(xù)i^tmm。微生物是地球生物中最具多樣性和最具皿能力的生物形式，微生物活體細(xì) 胞本身具有特殊精美的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和組裝方式，由于微生物活體細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙和細(xì)胞導(dǎo)管內(nèi)有各種親水介質(zhì)存在，如細(xì)胞膜親7jC表面、細(xì)胞壁纖維素多糖羥基體系及各種糖蛋白親 水基團，均可誘導(dǎo)許多人體所需或能夠代謝的無機元素(如磷、韓、硅、鐵、鋅、鎂、錳、鈦、 鍶、硒、銅等)，在微生物活體細(xì)MJ^a行生物礦化，自組裝形賂種復(fù)雜納米結(jié)構(gòu)體，M3l3fe擇 不同微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)條件能精確調(diào)控?zé)o機物的納米結(jié)構(gòu)形態(tài)，利用微生物細(xì)M上關(guān)鍵酶 的高效催化反應(yīng)，可在常溫常壓下用無機物來復(fù)制刻錄微生物細(xì)胞的精美納米結(jié)構(gòu)，生物對無機 晶體的成核、形貌及結(jié)晶學(xué)定向等具有較好的控制。由于微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)形貌的多樣性、傳代生 長速度快、培養(yǎng)可控性、生產(chǎn)成本低，微生物細(xì)胞上有許多納米微孔和生物性質(zhì)的表面功能區(qū)域 (親脂性)，易進行基因突變、克隆重組及高效親，并易與藥物鵬因結(jié)合，是合成有應(yīng)用價值 的無機介 li^ltl立藥物載體有效的模板劑。微生物催化雜合成新技術(shù)為發(fā)展高效、安全、無毒 的新型納米無機載術(shù)才料掛共了新的途徑，它不但可以衝共大量廉價的納米材料合成的模板劑， 革新納^+才料合成的傳統(tǒng)工藝，合成目前不能生產(chǎn)的，^ffl化學(xué)法生產(chǎn)較困難的，性能優(yōu)異的新 型納米結(jié)構(gòu)材料；而且反應(yīng)剝牛溫和易控制，工藝簡單，多為常溫、常壓、低會辦、專一性強、 選擇'斷、重復(fù) 、效率高；生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品質(zhì)量高；無環(huán)境污染；投資較小易產(chǎn)業(yè)化。 發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有財存在的戰(zhàn)問題，本發(fā)明衝共一種介 lifi微ffi^繊灰石(HAp)的微 生物催化合成方法，以較低的成本制得高生物活性的介 LHAp納米微粉。本發(fā)明的介 lifl^m體HAp的微生物催化合成力法步驟如下 (1)在100-200m7jC中加A20-50g/L天然微生物表面活性劑及糖助齊U30-60g/L，室溫攪拌20-50 射中，然后婦5-35°0培養(yǎng)0.5-1小時，形成發(fā)酵乳化、m;(2) 在步驟(1)得到的發(fā)辭L化、贏中加入0.3-0.6moI/L含鈣無機鹽溶液40-80ml，常溫下攪 #0.5-1個小時后，得到溶^B;(3) 在步驟(2)得到的溶細(xì)中按10-20滴/^H中的速度在室溫下滴加03-0.6mol/L含磷無機鹽
溶液，并使鈣磷的摩爾比為1.6-1.8，調(diào)節(jié)pH為9-12，攪御.5-111，得到乳濁液C;
(4) 將步驟(3)得到的乳濁液C靜置15-20h，得到乳濁柳，以5000-10000轉(zhuǎn)/分離心3-10分 鐘，得到的沉淀物水啦-3次^7K乙麟l-2次；或者將離心得到的分離液按步驟(2) _ (4)操作;
(5) 將步驟(4)得到的沉淀物在70-9(TCTi敷0-30h,顆每其以《10。C/iHt的速度升溫到 600-800°C，保溫14h后，得到介 li內(nèi)米羥基磷灰石粉體。
所述的微生物表面活性劑是糖脂系、磷脂系、月旨肪,表面活性劑中的一種或多種。 糊旨系微生物表面活性劑為鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂之一，槐糖脂是球絲酵母或假絲酵 母在葡萄糖和正構(gòu)烷烴或長御旨肪酸中培養(yǎng)時產(chǎn)生的。
磷脂系微生物表面活性劑為卵磷脂或磷脂酶，卿旨酶是由硫磺細(xì)菌發(fā)辭咅養(yǎng)的。 月旨肪麟微生物表面活性劑為覆蓋霉菌酸或青霉孢子酸。
皿含轉(zhuǎn)無機鹽為硫酸朽、氯酸鈣、硝酸鈣、擰檬酸鈣、氫氧化轉(zhuǎn)、氧化轉(zhuǎn)、碳酸鈣中的一 種或多種。
所述含磷無機鹽為磷酸二氫銨、磷酸、磷酸鈉、偏磷酸鈉、六偏磷酸鈉中的一種或多種。 采用本發(fā)明方法，關(guān)鍵技術(shù)是在細(xì)胞培養(yǎng)、礦化時間、細(xì)胞破碎和除去微生物模板時，所形 成的介孔結(jié)構(gòu)的塌陷，反應(yīng)物濃度越高，介 LM厚，反之亦然。除去生ttf莫板的熱處理升溫速 鵬控制在《l(TC/min。另外，生物表面活性劑的種類和用量，對介孔結(jié)構(gòu)的形成和孔的尺寸微 有重要的影響。
與現(xiàn)有技糊比，本發(fā)明方法的優(yōu)良效果就在于4細(xì)廉價的天然微生物表面活性劑，利用微 生物的納米多層泡囊結(jié)構(gòu)、細(xì)鵬上關(guān)鍵酶的催化作用和礦化沉積過程，在溫初的餅下合成介 孑LHAp納米微粉，顆粒為蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)，有序蠕蟲狀狹縫孑Lit的孔徑分布為240nm,HAp的顆 粒平均尺寸為5-20nm,結(jié)晶度為3n/。左右，晶格畸變量為6.8xl0、nm)， BET高于100m2/g， 70(TC煅燒 2"4小時后仍就可以得到粒徑為25-100nm范圍的HAp顆粒，結(jié)晶度為12%左右，晶格畸變量為 4.3xlO"Vn)，無論是低溫還是高溫制備的HAp顆粒上都有結(jié)構(gòu)孔，但7(KTC煅燒后有序介孔塌陷，
使孔徑變大。微生物綠色催化合成方法制備的介 湖^er分體羥M灰石具有開放的生物骨架結(jié)構(gòu)，
對人體無有害成分，顆粒表面帶正電，具有左旋光性能和較強的疏水性及生物親和性，并能發(fā)射
紫紅熒光，活性高，希恪工藝簡單，無需排除有機摸板，成本低，無污染，赫約為其他方法的
50%以下。


圖l是實施例2中得到的介 LHAp納微條品的謝線衍射圖譜。 節(jié)是實施例2中得到的介 LHAp納微儲品的 L徑分布曲線和吸附平衡等溫曲線。 節(jié)是實施例2中得到的介 LHAp納微儲品的高^M電子顯微鏡照片(a.)、晶格條紋像(b) 和HAp/protein納米復(fù)合顆粒的形成示意圖(c)。
圖4是實施例2中得到的介 LHAp納微,品的原子力顯微鏡照片。
郞是實施例2中得到的介子LHAp納微儲品的翻電子顯微鏡照片和電子衍射照片。
圖6是實施例2中得到的介 LHAp納微儲品的紫外吸收光譜圖。
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步地詳細(xì)說明，但是本發(fā)明要求保護的范圍并不局限 于實施例,的范圍。
實施例l:將150ml的25g/L的糖脂系生物表面活性劑槐糖脂球絲酵母7jC溶液在室溫下加糖助劑 6g，室溫攪拌20倂中，25'C乳化培養(yǎng)50辦中，得到發(fā)麟L化船，然后，將50ml的0.5mol/L的CaCb 溶働倒乳化淑中，繼繊力攪拌30倂中，讓Ca2+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。 以^H中10滴繊緩慢滴加0.5mol/L磷酸溶液，并使Ca/P(摩爾比H.67，用5mol/L的NaOH溶液調(diào) 節(jié)pH-10，繼續(xù)磁力攪荊.5h讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜S20b以5000轉(zhuǎn)/分高速離心5分鐘， 水洗兩次im—次，除去C1' 、 Na+和H20。最后將沉淀物在千燥箱中70'C烘干20h后，得到介孔 HAp/protein納米復(fù)，##品，其顆粒尺寸為18-37nm,其介孔尺寸為2-50nm, BET大于100m2/g。 以3'C/min的升鵬度，在60(TC熱處理3h得到介孑LHAp納M儲品，其顆粒尺寸為36-70nm ， 孔尺寸為12-90nm， BE，6m2/g0
實施例2:將150ml的50g/L的糖脂系生物表面活性劑鼠李糖脂水溶液在室溫下加糖助劑4.5g， 室溫攪拌50射中，35'C乳化培養(yǎng)30辦中，得到發(fā)辭L化、^A，然后將1.65gCa(OH)2粉體加到乳化液 A中，繼繊力攪拌50溯，讓Ca、統(tǒng)分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以每射中20滴速度緩慢滴加0.3mol/L磷酸二氫銨溶液，并使Ca/P(摩爾比"1.67，繼，力攪拌lh^讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部 分礦化沉積，然后靜置15h以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心3分鐘，7jC船次齢fe2次，除去0H"禾PNH4+以及 H20。最后將沉淀物在千燥箱中80。C烘干24h后，得到介 LHAp/protein納米復(fù)鎖鵬品，其顆粒 尺寸為10-17nm,其介孑L尺寸為240nm， BET大于100m2/g。以5'C/min的升溫速度，在700'C熱處 您h得到介 LHAp納^H^品，其顆粒尺寸為1640nm，介孔孔尺寸為840nm, BET高于86m2/g。 圖l是實施例2中8(rC烘干24小時后和煅燒到700'C后，樣品的X射線衍射圖譜，縱坐標(biāo)為衍射 強度，橫坐標(biāo)為衍射角，樣品煅燒前后的廣角衍射峰與均與標(biāo)準(zhǔn)的羥M灰5HAp (JCPDS No.09432) —致，并且衍射峰都有不同程度的寬化現(xiàn)象，表明 前后的樣品都有納米尺寸效應(yīng)， 由(002)晶面計算的沒有煅燒樣品的結(jié)晶度為3%，晶粒尺寸為10.9^,晶格畸變量為6.8xl0^nm; 700卩煅燒后樣品的結(jié)晶度為12%，晶粒尺寸為17.2nm，晶格畸變量為43xl(rtim;煅燒前樣品的 小角衍射圖婦0=1.31°出現(xiàn)了強衍射峰，表明樣品含棘靴孔結(jié)構(gòu)，其有積1^徑為6.7411111， {鵬 燒后的樣品沒有出現(xiàn)小角衍射峰，表明有序介 L結(jié)構(gòu)在煅燒過程中已經(jīng)塌陷。
圖2是實施例2中80'C烘干24小時后和70(TC煅您小時后，樣品的孔徑分布曲線和吸附平衡等 溫曲線。煅燒前樣品呈現(xiàn)IV型吸附平,溫線和H4遲滯環(huán)，表明樣品具有皿和尺寸均勻的狹縫 狀介孔 L3t (見原子力顯微鏡圖4) ， BJH L徑分布婦40nm范圍。煅燒后樣品呈5則型吸附平衡 等溫線,沒有出現(xiàn)遲滯環(huán)，表明樣品在煅燒過程中有靴孔 Ut結(jié)構(gòu)己經(jīng)塌陷，介孔孔體積明顯降 低，BJH介孑L孔徑分布在840nm范圍，由于蛋白質(zhì)摸板的排除而出現(xiàn)了大孔結(jié)構(gòu)(〉50nm)。
節(jié)是實施例2中8(TC烘干24小時后介孑LHAp/prctein納米復(fù)合粉體樣品的高分辨電子顯微鏡 照片(a)、晶格條紋像(b)和HAp/protein納米復(fù)合顆粒的形成示意圖(c)。圖3 (a)呈現(xiàn)出蛋白質(zhì) 的二級左螺旋納米骨架結(jié)構(gòu)，并且在顆粒上呈現(xiàn)出HAp (211)晶面的晶格條紋像，(211)晶面 的晶面間距為0,281nm，其旋轉(zhuǎn)角為7()0 (見圖3b)，這表明HAp沉積在了蛋白質(zhì)的表面上并復(fù)制 了蛋白質(zhì)的二,螺旋納米結(jié)構(gòu)(見圖3c)。
圖4是實施例2中8(TC烘干24小時后介 LHAp/protein納米復(fù)合粉條品的原子力顯微鏡照片， 圖中顯示出樣品的表面納米結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)開放生物骨架螺旋結(jié)構(gòu)和蠕蟲狀狹縫孔道有序介孔結(jié)構(gòu)，這 也進一步證明了HAp對蛋白質(zhì)的二級納米結(jié)構(gòu)進行了復(fù)制刻錄
圖5是實施例2中80'C烘干24小時后和70(TC煅傲小時后，樣品的翻電子顯微鏡照片和電子 衍射照片(圖中左上角)，'m前樣品平均顆粒尺寸為16.8nm，較大的顆粒上可見到結(jié)構(gòu)孔，其 電子衍射圖呈鵬內(nèi)米級晶粒的衍射環(huán)。70(TC煅燒后樣品的晶粒長大，平均晶粒尺寸變?yōu)?1.21!111， 但其電子衍射圖仍然呈現(xiàn)納米級晶粒的衍射環(huán)。圖6是實施例2中80'C烘干24小時后和70(TC纟鵬小時后，樣品的紫外吸收光譜圖。在圖6a中 純的微生物表面活性劑的蛋白質(zhì)含量為45.99(wt0/。)，波長婦60nm為DNA的特征吸收峰，婦80nm 為蛋白質(zhì)的特征吸收峰。在圖6b中8(TC烘干24小時后介 LHAp/protein納米復(fù)，體的蛋白質(zhì)含量 為30.85(wt0/。)，波長在260nm為DNA的特征吸收峰，在280nm為蛋白質(zhì)的特征吸收峰，并且在 200-250nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)了HAp的兩個吸收峰。在700'C煅傲小時后的樣品的紫外吸收光譜圖 (圖6c)中，DNA和蛋白質(zhì)的特征吸收峰都消失，蛋白質(zhì)含量為00.00(wt"/。)，.表明微生鵬板已 經(jīng)完全被排除掉，得到純介 LHAp納皿體。實施例3:將150ml的20g/L的糖脂系生物表面活性齊嗨藻糖脂7jC溶液在室溫下加糖助劑9g攪 拌、室溫攪拌30射中，20。C乳化培養(yǎng)l小時，得到乳化贏，再)^40ml的0.6mol/L的Ca (N03) 2溶 液加到乳化m中，繼繊力攪拌l小時，讓C^+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。 以^H中15滴艦緩漫滴加0.6mol/L磷酸鈉溶液，并使Ca/P(摩爾比;H.8，用5mol/L的NaOH溶液調(diào) 節(jié)pH-12，繼繊力攪淋5頒,讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜置181^高速離心分離(5000轉(zhuǎn)/分， IO射中)，7K洗兩次,一次，除去N03-禾附a+以^H20。最后將沉淀鵬干燥箱中90。C烘干30h后， 得到介孑LHAp/protein納米復(fù)鎖體樣品，其顆粒尺寸為25-37nm，其介孔尺寸為2-50nm， BET大 于9(W/g。。以9'C/min的升鵬度，在80(TC熱處理1.5h^得到介孑LHAp納M解品，其顆粒尺 寸為56-79nm ，孑L尺寸為6-80nm， BET高達76m2/g。實施例4:將150ml的25g/L的糖脂系生物表面活性劑卵磷脂在室溫下加糖助齊U6g，室溫攪拌20 辦中，25'C乳化培養(yǎng)50辦中，得到發(fā)辭L化、)tA,然后，將60ml的0.3mol/L的CaS04溶液加到乳化 ^A中，繼續(xù)磁力攪拌30餅，讓Ca2+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以鄉(xiāng)中IO 滴速度緩慢滴加0.3mol/L偏磷,溶液，并使Ca/P(摩爾比^1.67，用511101/1的^011溶液調(diào)1^11= 10，繼續(xù)磁力攪荊.5h讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜置20h^000轉(zhuǎn)/分離心5射中，水洗兩次醇
洗一次，除去SO厶Na+和H20。最后將沉淀物在千燥箱中7(TC烘干20h后。升M3I度為10'C/mi^熱 處理溫度為750。C。煅燒前介孑LHAp/protein納米復(fù)合粉體樣品，其顆粒尺寸為18-37nm，其介孔尺 寸為2-50nm， BET大于100m2/g。煅燒后介孑LHAp納M,品，其顆粒尺寸為46^90nm，孑L尺寸 為22-90nm， BET高達77m2/g。實施例5:將150!!11的50^的糖脂系生物表面活性劑磷脂酶在室溫下加糖助劑4.58，室溫攪拌 50併中，35'C乳化培養(yǎng)30^H中，得到發(fā)酵乳化^，然后將70ml的0.4mol/L的擰檬酸鈣溶働口到乳 化、贏中，繼繊力攪拌50^H中，讓Ca2+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡奪結(jié)構(gòu)中。以每倂中 20滴鵬緩漫滴加0.4mol/L六偏磷酸鈉溶敝4ml，并使Ca/P(摩爾比戶1.6，用5mol/L的NaOH溶液調(diào) 節(jié)pH4，繼纟繊力攪拌化讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，靜置15h以10000轉(zhuǎn)/分的速度離心3^Ht， 水啦次,次，除去Na+、 ^t酸根離子以及H20。最后將沉淀t/^干燥箱中80。C烘干24h后， 得到介孑LHAp/protein納米復(fù)，體樣品，升溫速度為10。C/mi^熱處理溫度為750。C。煅燒前介孔 HAp/protein納米復(fù)^###品，其顆粒尺寸為18-35nm，其介孔尺寸為2-60nm， BET大于100m2/g。 煅燒后介孑LHAp納微儲品，其顆粒尺寸為29-65nm ，孔尺寸為26-85nm， BET高達89m2/g。實施例6:將100ml的50g/L的糖脂系生物表面活性劑霉菌^7K溶液在室溫下加糖助劑3g，室溫 攪拌50，， 35"C孚L化培養(yǎng)30辦中，得到發(fā)酉轉(zhuǎn)L化狼，然后將80ml的0.4mol/i:的CaO溶液加到乳 化、g中，繼續(xù)磁力攪拌50，，讓Ca"能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以每射中 20滴鵬緩廈滴加0.4mol/L磷酸二氫銨和磷酸鈉溶淑4m1,并使Ca/P(摩爾比戶1.8，用5mol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH,,繼續(xù)磁力攪拌lh讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜置15h,以5000轉(zhuǎn)/分的速 度離心3射中，7K舶次1I^2次，除去Na+、 OH-禾UNH4+以^SH20。最后將沉淀物在干燥箱中8(TC烘 干24h后，得到介 LHAp/protein納米復(fù)合粉體樣品，以5'C/min的升M3l度，在70(TC熱處a^得 到介孑LHAp納^iH^品，其顆粒尺寸為26"40nm，介孔孔尺寸為18-70nm， BET高于76m2/g。實施例7:將200ml的50g/L的糖脂系生物表面活性劑青霉孢子M7K溶液在室溫下加糖助劑6g, 室溫攪拌50射中，35'C孚L化培養(yǎng)30辦中，得到發(fā)酵乳化m，然后將1.76g的CaC03粉體加到乳化液 A中，繼纟繊力攪拌50辦中，讓C +能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以20滴/她 度滴加0.4mol/L磷酸二氫銨、磷酸和磷酸鈉的混合溶淑4ml，并使Ca/P(摩爾比)^.66，用5mol/L的 NaOH溶液調(diào)節(jié)pH,,繼續(xù)磁力攪拌11^讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜置15比以6000轉(zhuǎn)/分的速 度離心5iHt, 7K齠次^t2次，除去C(V 、 Na+、 OH"WV以^H20。將分離液中加入1.76g的 CaC03粉體，繼續(xù)磁力攪拌50射中，讓Ca2+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以20 滴/^IS滴加0.4mol/L磷酸二氫銨、磷酸和磷酸鈉的混合溶敝4ml，并使Ca/P(摩爾比^1.6，用 5mol/L^NaOH溶液調(diào)節(jié)pH-9，磁力攪拌lh，讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，靜置15辻以5000轉(zhuǎn)/分的 鵬離心3頒，7jC婦次醇淑次，再次除去OH"禾PNH4+以^H20。最后將沉淀物在千燥箱中80。C 烘干24h后，得到介 LHAp/protein納米復(fù)合粉體樣品，以5"/min的升,度，在700'C熱處S2h^ 得到介孑LHAp納^m,品，其顆粒尺寸為36-50nm，介孔孔尺寸為18-60nm，. BET高于69m2/g。實施例8:將200ml的50g/L的表面活性劑霉菌酸和卵磷月旨的7K溶液在室溫下加糖助齊ij6g，室溫 攪拌50併中，35'C孚L化培養(yǎng)30^H中，得到發(fā)辭L化^A，然后將30ml的0.4mol/L的CaCl2溶液和1.08g 的Ca(OH)2粉體加到乳化^A中，繼續(xù)磁力攪拌50射中，讓C +能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米 泡囊結(jié)構(gòu)中。以^H校0滴速度緩漫滴加0.4mol/L六偏磷酸鈉溶慰4ml，并使Ca/P(摩爾比)^.6, 繼續(xù)磁力攪拌lh讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，然后靜置15h以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心3辦巾，水、舶 次,次，除去OIT、 CI— 、 Na+以及H20。最后將沉淀物在千燥箱中8CTC烘干24h后，得到介孔 HAp/protein納米復(fù)，,品，以5'C/min的升溫速度，在70(rC熱處S2h得到介孑LHAp納， ##品，其顆粒尺寸為16-50nm，介孔孔尺寸為9-70nm， BET高于73m2/g。實施例9:將150ml的50g/L的表面活性劑鼠李糖脂、磷脂和霉菌斷]0溶液在室溫下加糖助劑 5.5g，室溫攪拌50射中，35'C乳化培養(yǎng)30分鐘，得到發(fā)辭L化液A，然后將20ml的0.4mol/L的CaO 和20ml的0.4mol/L的CaSO4溶液及1.08g的Ca(OH)2粉體加到乳化軀中，繼續(xù)磁力攪拌50分鐘， 讓Ca2+能充分的吸附在微生物細(xì)胞的納米泡囊結(jié)構(gòu)中。以每^Ht20滴速度緩侵滴加0.4mol/L磷酸二 氣銨、六偏磷酸鈉和磷酸鈉的混合溶液44ml，并使Ca/P(摩爾比"1.6，用5mol/L^!NaOH溶液調(diào)節(jié) pH=9，繼鄉(xiāng)繊力攪拌lh讓細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分礦化沉積，靜置15h,以5000轉(zhuǎn)/分的速度離心3併中，水洗 3次醇、啦次，除去OH" 、 Na+、 S(V禾DNH4+以朋20。最后將沉淀物在千燥箱中80。C烘干24h后， 得到介子LHAp/protein納米復(fù)^體樣品，以5'C/min的升溫速度，在700'C熱處S2b得到介孔 HAp納，Wf品，其顆粒尺寸為19-59nm，介孔孔尺寸為6-610nm， BET高于74m2/g。
權(quán)利要求
1.一種介孔納米粉體羥基磷灰石的微生物催化合成方法，其特征在于包括如下步驟(1)在100-200ml水中加入20-50g/L天然微生物表面活性劑以及糖助劑30-60g/L，攪拌20-50分鐘，然后在25-35℃培養(yǎng)0.5-1小時，形成發(fā)酵乳化液A；(2)在步驟(1)得到的發(fā)酵乳化液A中加入0.3-0.6mol/L含鈣無機鹽溶液40-80ml，攪拌0.5-1個小時后，得到溶液B；(3)在步驟(2)得到的溶液B中按10-20滴/分鐘的速度滴加0.3-0.6mol/L含磷無機鹽溶液，并使鈣與磷的摩爾比為1.6-1.8，調(diào)節(jié)pH為9-12，攪拌0.5-1h，得到乳濁液C；(4)將步驟(3)得到的乳濁液C靜置15-20h，得到乳濁液D，以5000-10000轉(zhuǎn)/分離心3-10分鐘，得到的沉淀物水洗2-3次，無水乙醇洗1-2次；或者將離心得到的分離液再按步驟(2)-(4)操作；(5)將步驟(4)得到的沉淀物在70-90℃干燥20-30h，再將其以≤10℃/分鐘的速度升溫到600-800℃，保溫1-4h后，得到介孔納米羥基磷灰石粉體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l臓的合成方法，其特征在于臓的微生物表面活性劑是糖脂系、磷脂系、 脂肪麟表面活性劑中的一種或多種。
3. 根據(jù)權(quán)利要^2,的合成方法，其特征在于戶，糖脂系微生物表面活性劑為鼠李糖脂、 海藻糖脂或槐糖脂。
4. 根據(jù)權(quán)利要救戶腿的合成方法，其特征在于戶腐磷脂系微生物表面活銖劑為卵磷脂或磷 脂酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要彩臓的合成方法，其特征在于戶;M脂肪縣微生物表面活性劑為覆蓋霉菌酸或青霉孢子酸。
6.淑據(jù)權(quán)禾頓求1戶脫的合成方法，其特征在于臓含轉(zhuǎn)無機鹽為硫,、氯酸鈣、硝酸鈣、 檸檬酸鈣、氫氧化鈣、氧化鈣、碳酸鈣中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1戶脫的合成方法，其特征在于戶誠含紙機鹽為磷酸二氫銨、磷酸、磷酸鈉、 偏磷酸鈉、六偏磷酸鈉中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種介孔納米粉體羥基磷灰石的微生物催化合成方法，在水中加入天然微生物表面活性劑及糖助劑，攪拌，培養(yǎng)形成發(fā)酵乳化液；再加入含鈣無機鹽溶液，攪拌后滴加含磷無機鹽溶液，并使鈣與磷的摩爾比為1.6-1.8，調(diào)節(jié)pH為9-12，攪拌、靜置、離心，將離心得到的沉淀物水洗醇洗；或者將離心得到的分離液按前述步驟重復(fù)操作一次；將得到的沉淀物干燥，升溫，保溫后得到介孔納米羥基磷灰石粉體。本發(fā)明的合成方法工藝簡單、成本低、無污染，所制備的納米復(fù)合粉體樣品具有開放的生物骨架螺旋結(jié)構(gòu)和蠕蟲狀狹縫孔道有序介孔結(jié)構(gòu)，不需要除去模板，顆粒表面帶正電荷，具有左旋光性能和較強的疏水性及生物細(xì)胞親和性，無毒副作用。
文檔編號C12P3/00GK101153288SQ20071003065
公開日2008年4月2日 申請日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者文 何, 尹詩衡, 王迎軍, 鄭華德, 陳曉峰, 陳景帝, 坤 魏 申請人:華南理工大學(xué)