專利名稱：一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
技術(shù)背景藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin )通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670mn的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB ) ; PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號放大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和醫(yī)療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對目標(biāo)的標(biāo)記。PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ, Glazer AN.Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptidephycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J" Bacteriol. 2002;184(17) : 4666 4671)。 PCB生物合成基因由力o7和pc州組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)PCB (F. T. Undgraf, C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome inEcherichia coli [J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)力/7aZ^e/7a sp. PCC7120中aA^339基因編碼betal55裂合酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的betal55裂合酶。這些betal55裂合酶能催化PCB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的155位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)
的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫 輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋 白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連 接，而不需要通過化學(xué)交聯(lián)等方法來實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過直接實(shí)現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白亞基脫輔基 蛋白的連接，可用于生物學(xué)檢測以及醫(yī)療檢測領(lǐng)域。本發(fā)明為藻紅藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功 能材料應(yīng)用于醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域，特別是檢測領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供分子設(shè)計制備新型鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法。它是應(yīng)用betal55裂合酶催化PCB與鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，從而制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。將含有betal55裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接的基因、PCB生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過如此設(shè)計的基因工程菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得 到beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和鏈霉親和素基 因拼接后克隆于第二個表達(dá)載體中，可以表達(dá)鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白的融合蛋白，得到 鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和；x^4或其同源基因同時克隆于第 三個表達(dá)載體中或分別克隆于第三、第四個表達(dá)載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(4) 將betal55裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、PCB生 物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程 菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻 紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。上述的制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法中所述的宿主菌為大 腸桿菌。所述的betal55裂合酶基因是指與^7aZ^e/ a sp. PCC7120中a7J5"J，效基因同源 的基因。所述的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^a6ae/73 sp. PCC7120或 M.laminosus sp. PCC7603中/pecB基因同源的基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；4、 方便進(jìn)行藻膽蛋白分子設(shè)計，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料。


圖1為本發(fā)明中A115339催化下生成的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的 吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施方式
下面以實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。 實(shí)施例1(1) 從GeneBank中可以査到，藻種/l朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， ^ 7a/z i/7os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋Z ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必^T j'/7o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋tee;73 sp.PCC7120中的 aL^ 滯基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a〃M滯，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^7a6a朋a sp. PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-sa-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o/和pc//0克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。
即鏈霉親和素基因幼在pET30中在A>/7l和^^1I兩個酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基 因/ ec;9是在fcoRV和i w I兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，處 于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是5g7II和/力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc州)， 它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力W處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和,"I之間， pcj^在第二個多克隆位點(diǎn)，在M/e I和J/ o I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-a^5JJ久pET30-sa^eM和pACYCDuet-力o7-轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0a。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-{3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集 菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。其吸收與熒 光光譜見附圖l所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜；取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)至 0D6。。=0. 3 0.4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4'C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的O.lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心 30s(10000g， 4。C)去上清，菌體沉淀用100nL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上， 加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入 300)aLLB培養(yǎng)基，37。C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平 板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37"振蕩培養(yǎng)至006。。=0. 5-0. 7時，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、20°C、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時。離心
收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn) 行大量表達(dá)。 實(shí)施例2G)從GeneBank中可以查到，藻種力朋力朋/73 sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7柳i;7asiAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^/7a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，傲^3/w'77oms"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6ae/73 sp.PCC7120中的 W^5J^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775JJA在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將力朋力朋朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5 (C84A)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-sa-pec5(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo) 記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-/ cW，在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因sa在pET30中在A>7l和《^n兩個酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基 因/ ecMC84A)是在AcoRV和J力o I兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a"5^J9在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^^II和; PCB合成酶基因是2個(力o/和 pc/力)，它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力W處于第一個多克隆位點(diǎn)，在；Vco I和尸" I之間，/ c^在第二個多克隆位點(diǎn)，在yWel和之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-aJ75"風(fēng)pET30-i; ec5 (C84A)和pACYCDuet-力o7-p一轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0Ds。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l隱ol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^aAse朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M〗a/w'/ os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M 7a/M7 os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋6朋y7a sp.PCC7120中的 a775J，效基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-s775^J^，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將必Z3/w'/7M^ sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec^和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-幼-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pcy/I)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-p《W，在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因^在pET30中在A>/71和力WII兩個酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因pec5是在^boRV和兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a"5^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是5《711和Wo I ; PCB合成酶基因是2個(力W和pc/"，它們在同一個載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和尸st I之間，pc/力在第二個多克隆位點(diǎn)，在AWe I和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-a^5JJ義pET30-sa""/ e^和pACYCDuet-力o7-p《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37X:振蕩培養(yǎng)至0D咖為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1國1/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集 菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種」朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7a7 j'y osiAs sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^/Ja6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，脫2a奶'/7os^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7s/^ez^ sp.PCC7120中的 a^5"J3^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7753J51，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將M 7a歷i/7o幼s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因(C84A) 和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì) 粒叫pET30-^-pec萬(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后， 在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親 和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o/和pooO克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l
中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-/5C7A在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因^在pET30中在j/wi和《^n兩個酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因pec5(C84A)是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^5"J^^在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^"7II和^力o1 ; PCB合成酶基因是2個(力o7和 pc州)，它們在同一個載體pACYCDuet-l中，力o/處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和尸" I之間，pc/力在第二個多克隆位點(diǎn)，在AWel和i7wI之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-a"5息pET30-sa~pec"C84A)和pACYCDuet-力o7-/ 一轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5(1) 從GeneBank中可以査到，藻種」朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， yK 7柳y/ o犯s sp. PCC7603部分序列己經(jīng)測定。^ a力ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，;)/. J柳i; awssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋力a朋a sp.PCC7120中的 a775"J^^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-3W533A在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^7aA朋朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒叫 pCOLADuet-sa-pec5，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記 的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pcj^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/w/-/7C/A在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pec^拼接后連接到pCOLADuet的￡boR I和 /^tl之間；裂合酶基因sW53，效在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是 i^7II禾n J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o7和/ c州)，它們在同一個載體pACYCDuet-1 中，力o7處于第一個多克隆位點(diǎn)，在；VcoI和尸Wl之間，pc^在第二個多克隆位點(diǎn)，在 AWeI和iT oI之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet-3"5^3義pCOLADuet-s^"pecS和pACYCDuet-Zzo7-pc;^轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB 培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37'C振蕩表達(dá)約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集 菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例6(1)從GeneBank中可以查到，藻種」朋6朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，yK 7a/z/i/70OTs sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必7柳iy o幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254，可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7s/^朋a sp.PCC7120中的 a7J5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5^^A在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^朋力se朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因； ec^ (C84A)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì) 粒叫pCOLADuet-sa-peM (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接 后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈 霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893,通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和pc州)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Z o7-;x^A在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pec沃C84A)拼接后連接到pC0LADuet的￡coR I和尸sH之間；裂合酶基因W^^39在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是和X力o I ; PCB合成酶基因是2個(/ o/和pcW)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點(diǎn)，在7fcoI和尸stl之間，pc^在第二個多克隆位點(diǎn)，在 腸I禾口勘I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet—a775^3久pC0LADuet-stpec5 (C84A)禾卩pACYCDuet-/ o7—轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8,加入異丙基硫代-f3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lramol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例7(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Ja/zu'/7ows印.PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨J柳j'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將如a6a朋s sp.PCC7120中的 W^5^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W75JJ"在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將必Ja啦'/7oms sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pCOLADuet-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記 的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和pcW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ o/-/ c/A在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pec^拼接后連接到pC0LADuet的v5boR I和 尸"I之間；裂合酶基因aW5JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是 ^g^n禾卩J力ol ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcW)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點(diǎn)，在AfcoI和尸Wl之間，pc^在第二個多克隆位點(diǎn)，在 脅I和勘I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a^5J朋、pC0LADuet-sa^pec^和pACYCDuet-/ o7-pc_M轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB 培養(yǎng)基中，37"C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-13-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集 菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8(1) 從GeneBank中可以査到，藻種J"a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Ja肌'/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力"a6ae77a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必7a/w'/7osi/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7Wae朋sp.PCC7120中的 s7i5"JJ5"基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-s775J3義在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將尨h歷2'/70SM sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因(C84A) 和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所 得質(zhì)粒叫pC0LADuet-sa-pec^ (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得 到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(/w/和； cW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l 中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7了《W,在大腸桿菌中能同時表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因pec漢C84A)拼接后連接到pC0LADuet的fcoR I和尸stl之間；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(/ o7和pcW)，它們在同一個載體pACYCDuet-l 中，力o7處于第一個多克隆位點(diǎn)，在vVcoI和尸WI之間，pc州在第二個多克隆位點(diǎn)，在 她I禾口 J/ 。I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分
別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-aLZM激、pC0LADuet-st; ecS (C84A)和pACYCDuet-力o/-pc/力轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例9(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力朋/7a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必J柳i/ as"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力/7a&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，尨Ja/w'/w幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^ s6朋朋sp.PCC7120中的 W75^39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7753JA在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^73&e朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-幼-pe^，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/w/，在大腸桿菌中能表達(dá)H01 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pc;^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-;5c州，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即脫輔基蛋白基因peM在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因m在1和《^n兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a^5^J^在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^^/II和lol ;PCB合成酶基因是2個(力W和pc/"， Z o7在pACYCDuet-l中，處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afcol和尸W I之間，pcy/1在pETDuet-1 中第二個多克隆位點(diǎn)，在M/e I和/力01之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-aL 5JJ久pET30-sa"pec5和pACYCDuet-力o厶pETDuet-; c州轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0 的LB培養(yǎng)基中，37"振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例10(1)從GeneBank中可以査到，藻種j/7afee朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7柳眾os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。J朋&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，yf/. 7a啦'"osiASsp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將」朋&e朋sp.PCC7120中的 a7753J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a775339，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^7s6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5 (C84A)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-幼-/7M^(C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo) 記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 Zw7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即脫輔基蛋白基因pe^(C84A)在pET30中是在fcoRV和I力o I兩個酶切位點(diǎn)之間， 鏈霉親和素基因sa在和^WII兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W75^J9在pCDFDuet 中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^5^n和; PCB合成酶基因是2個(力W和 pc/力)，Z o7在pACYCDuet-1中，處于第一個多克隆位點(diǎn)，在〃co I禾Q尸"I之間，pc州在 pETDuet-1中第二個多克隆位點(diǎn)，在AWe I和J力o I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a^5^JR pET30-s^/ ec5(C84A)和pACYCDuet-力o7、 pETDuet-pc/Z 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 20。C至37。C振 蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例11(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ s力ae"a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，7a肌V os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/I朋tee/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，必7a肌'"osi/s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^7stee"s sp.PCC7120中的 a^5^c^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^^^"在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將必Ja肌'/7oms sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-幼-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中 能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫 輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達(dá)H01 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcy/l克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pcj^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即脫輔基蛋白基因pe"在pET30中是在fcoRV和J力oI兩個酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因sa在tT/m I和萬^HI兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a775JJ9在pCDFDuet中， 處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是SWII和/力o1 ;PCB合成酶基因是2個(力o7和pcW), /w/在pACYCDuet-l中，處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和At I之間，pc州在pETDuet-1 中第二個多克隆位點(diǎn)，在;Wel和/力oI之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a^5^J久pET30-sa"/ ecS和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc/力轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH7.0
的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L, 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可 提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例12(1) 從GeneBank中可以查到，藻種細(xì)6細(xì)a sp, PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必7柳i/7os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/l朋Z^e/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M JaTM'/70^ys sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋力朋朋sp.PCC7120中的 a^5^3^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-3刃M滯，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^/w'加幼s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^ (C84A) 和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì) 粒叫pET30-幼-pec5 (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后， 在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親 和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcj^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc7A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即脫輔基蛋白基因pec^(C84A)在pET30中是在fcoRV和J/ o I兩個酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素基因sa在,p/ I和5^1I兩個酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因W7^^9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^WII和io1 ; PCB合成酶基因是2個(力o7和pcyyO，力o7在pACYCDuet-l中，處于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和At I之間，pcj^在pETDuet-l中第二個多克隆位點(diǎn)，在I和/力o I之間。 基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-aWMJA pET30-sa"pec5(C84A)和pACYCDuet-力o厶pETDuet—pc州 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振 蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例13(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^"steena sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， h/w'/ o犯s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必/a肌V ow5"sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將^朋6se朋sp.PCC7120中的 a775^J9基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a^5^Jft在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將^7a&e朋sp. PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5和鏈霉親和素 基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pCOLADuet-鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記 的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，
所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)HOI 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 z c/力克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-/7cW，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因5"s和脫輔基蛋白基因^M拼接后連接到pCOLADuet的^bdU和 戶"I之間；裂合酶基因aW5JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是 A《7II和J力o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和pc^)，力o/在pACYCDuet-1中，處于第 一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和At I之間，pc/力在pETDuet-1中第二個多克隆位點(diǎn)，在AW I和之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet-a^5^滯、pCOLADuet-和pACYCDuet-力o厶pETDuet-pc/力 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖 苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振 蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例14(1)從GeneBank中可以査到，藻種J/7a/ ae/7a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，^ h/772'/7asiAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?！古?ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，必h/M'/ osi/ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254，可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將/I朋tee/7a sp. PCC7120中的a^MJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-aW5MA在大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將A7a&e朋sp.PCC7120中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5 (C84A)和鏈 霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì) 粒叫pCOLADuet-幼-pec5 (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接 后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈 霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 7 o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力W，在大腸桿菌中能表達(dá)HOl。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc_M，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因W"(C84A)拼接后連接到pCOLADuet的iboR I和之間；裂合酶基因a^5JJ^在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是^7II和J/wI; PCB合成酶基因是2個(力o7和pc/"，力o7在pACYCDuet-1中，處 于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afco I和尸"I之間，pcj^在pETDuet-1中第二個多克隆位點(diǎn)， 在AWeI和之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pCDFDuet-a775^J9、 pC0LADuet-sa~pec5 ( C84A )和pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-pc^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫 代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽 素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通 過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素 -藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例15(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^7aAae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7a/w'"os〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。//朋6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，M 7柳i加s〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力朋6朋朋sp.PCC7120中的 a^5JJ^基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a77^^A在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目^^片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將必^/w'/ osY^ sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec5和鏈霉親 和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-幼-pecA鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿 菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記 的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-Zw7，在大腸桿菌中能表達(dá)HOI 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因pe"拼接后連接到pC0LADuet的I和 尸"I之間；裂合酶基因a"5JJ9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是 萬Wn和I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和/ c^)，力o7在pACYCDuet-l中，處于第 一個多克隆位點(diǎn)，在Afcol和尸W I之間，； cW在pETDuet-1中第二個多克隆位點(diǎn)，在M/e I禾口 之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到^f需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。 (4)將pCDFDuet-a^5"微pCOLADuet-^pecS禾口 pACYCDuet-力o厶pETDuet-p一 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振 蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析， 可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例16(1) 從GeneBank中可以查到，藻種細(xì)6a函sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， ^ 7ayz j'/70s"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。如a&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號 為BA000019，/K 7a邁/770s"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將力"W朋朋sp.PCC7120中的 aL 5J39基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a"MM，在 大腸桿菌中能表達(dá)betal55裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計的酶切位點(diǎn)，把目^Ut段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2) 將#. h/z/i加s"s sp. PCC7603中的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因pec^ (C84A) 和鏈霉親和素基因(簡稱sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所 得質(zhì)粒叫pCOLADuet-幼-pec5 (C84A)，鏈霉親和素基因和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白的融合蛋白，得 到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號為AF283893，通過全基因合成得到。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcyj克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因pec^(C84A)拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之間；裂合酶基因aL 5"9在pCDFDuet中，處于第二個多克隆位點(diǎn)'酶切位 點(diǎn)是和i7 o I ; PCB合成酶基因是2個(力o/和pc;^)，力o7在pACYCDuet-1中'處
于第一個多克隆位點(diǎn)，在Afcol和尸"I之間，pc/Z在pETDuet-1中第二個多克隆位點(diǎn)， 在WeI和i7wl之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pCDFDuet—aWMW、 pCOLADuet-s^pecS ( C84A )禾D pACYCDuet-力o7 、 pETDuet-/ c^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此 工程菌接種于pH 7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫 代-卩-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37"C振蕩表達(dá)約12小時，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽 素-藻紅藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通 過Nr親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素 -藻紅藍(lán)蛋白B。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的betal55裂合酶、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白、 藻藍(lán)膽素生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因及其同源基因來制備鏈霉親 和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻勘a&e朋sp. PCC7120和已經(jīng)部分測序的^ Ja肌'/70s"s sp. PCC7603為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其 它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta155裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和鏈霉親和素基因拼接后克隆于第二個表達(dá)載體中，可以表達(dá)鏈霉親和素和藻紅藍(lán)蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法將PCB生物合成酶基因hol和pcyA或其同源基因同時克隆于第三個表達(dá)載體中或分別克隆于第三、第四個表達(dá)載體中，得到PCB合成質(zhì)粒；(4)將beta155裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的betal55裂合酶基因是指與 爿朋/ 犯朋sp. PCC7120中a"MW基因同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與力朋/ 朋朋sp. PCC7120或M sp. PCC7603中/ ec5基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，通過應(yīng)用藻膽蛋白betal55裂合酶催化藻藍(lán)膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/09GK101397557SQ20071003060
公開日2009年4月1日 申請日期2007年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月28日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司