基于AuNPsAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于AuNPsAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用方法。用石墨烯固定Ab1，PSA作為目標(biāo)分析物，鏈霉親和素標(biāo)記的SA-AuNPsAgNCs容易與生物素修飾的單克隆抗體Ab2(biotin-Ab2)結(jié)合,通過抗原抗體的特異反應(yīng)，用“三明治”夾心法制備PSA免疫傳感器，分別將該傳感器電催化還原沉積銀和H2O2，可用于快速、靈敏、特異性好的檢測乳腺癌患者血清中超低含量的PSA濃度，以及前列腺癌和前列腺增生患者血清中f-PSA和t-PSA的值，將對于前列腺癌診斷灰色區(qū)域中的識別和診斷具有重要意義。
【專利說明】基于AuNPS@AgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器及其 構(gòu)建與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于電化學(xué)免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合 材料的免疫電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 免疫分析通過結(jié)合高親和性的抗原抗體，是特異性檢測臨床樣本中癌癥標(biāo)記物的 一種強(qiáng)大的分析工具。電化學(xué)免疫傳感器因其使用儀器簡單、快速響應(yīng)和輕便而受到特別 關(guān)注，信號放大方法已經(jīng)廣泛用于發(fā)展超靈敏的免疫傳感器檢測腫瘤標(biāo)志物。基于納米材 料的多酶探針是最受歡迎的放大檢測信號的方法，以過氧化物酶為最常見，但是酶易受溫 度、濕度和環(huán)境的影響，且容易失活、費(fèi)時，制備和純化過程昂貴，由于這些因素的影響，酶 探針的實(shí)際應(yīng)用受到限制。因此，開發(fā)穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)和制備簡單的探針對免疫傳感器的實(shí)際應(yīng) 用非常重要。越來越大的研究者致力于模擬酶的研究，模擬酶比蛋白質(zhì)穩(wěn)定，制備更加經(jīng)濟(jì) 劃算，具有巨大的潛在應(yīng)用價值，能夠用作日常護(hù)理和一般體檢的診斷試劑盒。磁性納米粒 子、氧化石墨烯、二氧化鈰納米粒子等許多納米材料都具有類過氧化物酶的催化活性，已有 文獻(xiàn)報道一些免疫方法基于磁性納米粒子或氧化石墨烯的過氧化物酶活性。然而，其動力 學(xué)檢測范圍（〇. 1-100 μ g mr1)并不能滿足大多數(shù)蛋白質(zhì)的檢測，因為很多血清蛋白質(zhì)的濃 度小于lng mL'因此，發(fā)展更靈敏的放大信號策略需要用模擬酶的方法并應(yīng)用到實(shí)際樣 品中。最近，一些研究報道了寡聚核苷酸穩(wěn)定的銀納米簇具有模擬過氧化物酶的活性，且能 夠催化過氧化氫（氏〇 2)還原。然而，該放大信號的方法因一個探針上僅僅只有一個銀納米 簇而受到許多限制，如果能夠獲得一個納米探針上有很多個銀納米簇，既能維持其固有的 催化還原氏〇 2的類過氧化物酶活性，又能提高放大效率，將會大大提升該探針的應(yīng)用效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種新的高靈敏度的、特異性好的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù) 合材料的免疫電化學(xué)傳感器及其構(gòu)建與應(yīng)用方法。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0005] -種基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備方法，以單鏈寡 聚核苷酸為模板，合成寡聚核苷酸穩(wěn)定的銀納米簇；帶巰基的互補(bǔ)DNA單鏈通過Au-S鍵結(jié) 合到金納米粒子表面，再兩條互補(bǔ)單鏈雜交，得到AuNPsOAgNCs復(fù)合納米雜化物；然后以石 墨烯為基底固定PSA抗體1 (AbJ，PSA作為分析物，AuNPsOAgNCs標(biāo)記抗體2 (Ab2)，由于抗 原抗體之間的特異性結(jié)合，得到用于檢測乳腺癌患者血清PSA的免疫傳感器；
[0006] 或者以石墨烯為基底固定PSA抗體1 (Ab^，free-PSA和total-PSA分別作為分析 物，AuNPsOAgNCs標(biāo)記抗體2(Ab2)，由于抗原抗體之間的特異性結(jié)合，得到用于檢測前列腺 癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫傳感器。
[0007] 所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備方法具體包 括以下步驟：
[0008] (1) DNA-AgNCs的制備：模板鏈S2和AgN03溶液加入到磷酸緩沖液中，然后， NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液震蕩，然后放在4°C冰箱中于暗處過夜，得到S2/ AgNCs ；
[0009] (2)AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料的制備：DNA單鏈S1和鏈霉親和素標(biāo)記的金納米 粒子混合，震蕩后，靜置，得到的混合物離心，移去上層清液，加 PBS (磷酸緩沖液）分散沉淀 物，得到Sl/SA-AuNPs ;然后，將步驟（1)得到的S2/AgNCs加入到Sl/SA-AuNPs溶液中加熱， 冷卻至室溫，即制得；
[0010] (3)AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記Ab2 :AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料與生物素修 飾的單克隆抗體Ab2混合反應(yīng)，得到的AuNPs@AgNCs/Ab 2納米復(fù)合材料溶液離心，用PBS緩 沖溶液洗滌，備用；
[0011] (4)免疫傳感器的制備：將裸玻碳電極拋光打磨至鏡面，超聲洗滌，吹干，用于電 極修飾；將殼聚糖修飾的石墨烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干；再將 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)的混合 液滴于裸玻碳電極表面，沖洗；然后，抗體Ah滴于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)后，沖洗；為 了阻塞多余的活性基團(tuán)及抗原與電極之間的非特異性結(jié)合，將電極進(jìn)一步在BSA中于37°C 下培養(yǎng)后，沖洗，不同濃度的PSA溶液分布滴加到電極表面，37°C下培養(yǎng)，沖洗掉未結(jié)合的 PSA分子，將制備的AuNPs@AgNCs/Ab2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可制得用于檢測 乳腺癌患者血清PSA的電極；
[0012] 制備用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫 傳感器時，將2支同樣經(jīng)過上述處理的裸玻碳電極表面分別滴加不同濃度的free-PSA和 total-PSA溶液，37°C下培養(yǎng)，沖洗掉未結(jié)合的free-PSA和total-PSA分子，將制備的 AuNPs@AgNCs/Ab2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可。
[0013] DNA-AgNCs 的制備具體過程：40-60 μ L 100 μ Μ 的模板鏈 S2 :3'-ACG CAT GCC GGC CCC TAA CTC CCC-5'和 0· 6-1. 0 μ L 50mM AgN03 溶液加入到 pH = 7· 0-8. 0 磷酸緩沖液中， 使得Ag+ :S2 = 7-9,然后0. 6-1. 0μ L 50mM新制的似8氏溶液加入到上述溶液中，得到的溶 液強(qiáng)烈震蕩至少lmin，得到的S2/AgNCs放在4°C冰箱中于暗處過夜。
[0014] AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的制備具體過程：20-30 μ L 40 μ M DNA單鏈S1 : 3'-SH-TTT TT GCC GGC ATG CGT-5'和20-30yL鏈霉親和素標(biāo)記的金納米粒子混合，震蕩 至少lh后，靜置至少24h，得到的混合物以6000-8000r/min離心至少lOmin，移去上層清 液，加 PBS分散沉淀物，再次離心，如此重復(fù)至少兩次，最后將沉淀物分散在PBS中，得到S1/ 5八-六11咿8;然后，40-6(^1^2(^]\152/^8從：8加入到40-6(^1^2(^]\151/5六-六11咿8溶液中， 混合液在85-95°C下加熱至少5min，慢慢冷卻至室溫，即可。
[0015] AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記Ab2的制備具體過程：20-30 μ L 10 μ M AuNPsO AgNCs納米復(fù)合材料與20-30 μ L 25 μ g ml/1生物素修飾的單克隆抗體Ab2混合，混合物在 室溫下反應(yīng)至少4h，得到的AuNPs@AgNCs/Ab 2納米復(fù)合材料以10000-14000r/min離心至少 10min，再分散于PH = 7. 5的PBS中，重復(fù)洗滌至少三次，儲存在4°C冰箱中，備用。
[0016] 免疫傳感器的制備的具體過程：將裸玻碳電極用0. 4-0. 6 μ m A1203粉拋光打磨至 鏡面，分別用乙醇和蒸餾水超聲洗滌至少3min，再用N 2吹干，用于電極修飾；將殼聚糖修飾 的石墨烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干；將新制的EDC和NHS混合液滴 于裸玻碳電極上，沖洗；然后再將Abjf于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)至少lh，沖洗；為了阻 塞多余的活性基團(tuán)及抗原與電極之間的非特異性結(jié)合，將電極進(jìn)一步用BSA(牛血清蛋白） 封閉，沖洗之后，不同濃度的PSA溶液分別滴加到電極表面，37°C下培養(yǎng)至少lh，沖洗掉未 結(jié)合的PSA分子，將制備的AuNP S@AgNCs/Ab2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可制得用 于檢測乳腺癌患者血清PSA的電極；
[0017] 制備用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫 傳感器時，將2支同樣經(jīng)過上述處理的裸玻碳電極表面分別滴加不同濃度的free-PSA和 total-PSA溶液，37°C下培養(yǎng)至少lh，沖洗掉未結(jié)合的free-PSA和total-PSA分子，將制 備的AuNPs@AgNCs/Ab 2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可。
[0018] 上述免疫傳感器的制備的具體過程中：將5-10mL0. 5mg/mL的殼聚糖修飾的石墨 烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干；將10-20 μ L新制的400mM EDC和 100mM NHS滴于裸玻碳電極上，30min后沖洗；然后，5-10 μ L 25 μ g mL-1的滴于電極表 面，37°C下密封培養(yǎng)至少lh，沖洗；將電極進(jìn)一步用BSA封閉，沖洗之后，不同濃度的PSA溶 液，或者free-PSA和total-PSA溶液，沖洗掉未結(jié)合的PSA分子或者未結(jié)合的free-PSA和 total-PSA分子后，滴加濃度為10 μ Μ的AuNPs@AgNCs/Ab2到電極表面，37°C培養(yǎng)至少lh。
[0019] 本發(fā)明石墨烯納米片（GS)通過熱剝脫的方法制得，取4mL 0. 5mg/mL氧化石墨烯 (G0)加入到燒杯中，然后加入30 μ L濃氨水。攪拌均勻后，加入20 μ L水合肼，于60°C水浴 下加熱反應(yīng)3. 5小時。冷卻至室溫，離心得到石墨烯納米片（GS)。在超聲輔助下，該納米片 能重新分散于水中。將lmL lmg/mL的石墨烯溶液與lmL 1%的殼聚糖（Chi)溶液混合，超 聲分散1小時，得到殼聚糖修飾的石墨烯納米雜化片（Chi-GS)。
[0020] 一種基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器，是由上述的方法制備 而成的。
[0021] 所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的應(yīng)用方法，
[0022] 用于檢測乳腺癌患者血清PSA時，用陽極溶出伏安法檢測AuNPsOAgNCs對銀離子 的催化效果，通過Ag+的還原信號值反應(yīng)PSA的濃度變化；
[0023] 用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA時，利用AuNPsO AgNCs對H 202的電化學(xué)催化，通過雙通道同時檢測出free-PSA和total-PSA，得到f/t-PSA 的值。
[0024] 所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的應(yīng)用方法具體為：
[0025] 用于檢測乳腺癌患者血清PSA時，包含AgN03和抗壞血酸的銀沉積溶液滴到所制 備的電極上，避光培養(yǎng)3-10分鐘，待銀沉積后，用PBS沖洗電極，將修飾電極用線性掃描伏 安法在1. 0M的KC1溶液中掃出Ag+的還原峰，掃描范圍是-0. 15到0. 25V，掃速為50mV s'
[0026] 用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA時，兩支分別用 free-PSA和total-PSA修飾的電極放入裝有4mL 0· 1M，pH為7. 5的N2飽和的PBS，同時含 有5mM的H202的電解池中，電化學(xué)測試通過雙通道線性掃描伏安法從0V到-0. 6V完成，掃 速為 100mV s'
[0027] 本發(fā)明采用不同濃度的PSA溶液，或者free-PSA和total-PSA溶液進(jìn)行上述電化 學(xué)測試制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后電化學(xué)測試待測樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品的數(shù)據(jù)。
[0028] 本發(fā)明所用的PSA抗體UAbJ指針對分析物抗原的抗體，抗體2(Ab2)是指針對分 析物抗原的二抗。由于抗原抗體的特異性結(jié)合構(gòu)成Abf分析物-Ab 2的夾心結(jié)構(gòu)。
[0029] 本發(fā)明的S2/AgNCs與Sl/SA-AuNPs通過DNA雜交連接在一起，從而AgNCs均勻地 分布在AuNPs表面，得到的AuNPsOAgNCs納米雜化材料尺寸均勻，穩(wěn)定性好。由于鏈霉親和 素與生物素的特異性結(jié)合,AuNPsOAgNCs容易與生物素修飾的單克隆抗體2(biotin-Ab 2)結(jié) 合，得到AuNPsOAgNCs標(biāo)記的Ab2。
[0030] 本發(fā)明的免疫傳感器以石墨烯作為免疫反應(yīng)的平臺固定Abp PSA作為分析物，通 過抗原抗體的特異性反應(yīng)，AuNPS@AgNCs-Ab2作為電化學(xué)標(biāo)簽?zāi)軌蜉p易地結(jié)合PSA。殼聚糖 修飾的石墨烯固定在電極表面，不僅加速了電子傳遞，而且提供了生物相容的微環(huán)境固定 ，在三明治形式的免疫反應(yīng)之后，AuNPS@AgNCs-Ab2納米雜化材料能夠組裝到電極表面， 目標(biāo)分析物PSA能夠通過AgNCs的電化學(xué)溶出伏安法被檢測出來。為了進(jìn)一步提高該方法 的靈敏度，發(fā)展了一種超靈敏的方法，即AuNPsOAgNCs催化銀沉積。該電化學(xué)免疫傳感器對 PSA的響應(yīng)展示出寬的線性范圍（lfg ml^-lng ml/1)和低的檢出限（0. 2fg ml/1)，并成功用 于乳腺癌患者血清的PSA的檢測，得到滿意的結(jié)果。
[0031] 而且，由于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料對H202表現(xiàn)出有效的催化還原性能，本發(fā) 明分別制備了 f-PSA和t-PSA免疫傳感器，能夠同時檢測出f-PSA和t-PSA的值，結(jié)果表 明，展示了寬的線性范圍（lpg mP-lOng ml/1)，得到f-PSA和t-PSA的檢出限分別為0. 2pg ml/1和0. 3pg mL'計算出的f/t-PSA比值，得到的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的ELISA -致，這將對于前 列腺癌診斷灰色區(qū)域中的識別和診斷具有重要意義。
[0032] 總之，本發(fā)明具有高度識別能力、高靈敏度、好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為f-PSA和f-PSA免疫傳感器的構(gòu)建原理圖；
[0034] 圖 2 為 AuNPs (a)、AgNCs (b)和 AuNPsOAgNCs (c)的紫外-可見光譜圖；
[0035] 圖3 (A) AgNCs的最大激發(fā)和發(fā)射光譜；(B) AgNCs在紫外燈照射下的照片；(C) AgNCs和AuNPsOAgNCs的熒光光譜圖；
[0036] 圖4AuNPs@AgNCs納米雜化物的TEM圖；
[0037] 圖5AuNPs@AgNCs納米雜化物中Au元素（左）和Ag元素（右）的XPS圖；
[0038] 圖6AuNPs@AgNCs (a)和AuNPs (b)在N2飽和的0. 1M H2S04中的循環(huán)伏安圖；掃速 為 100mV s 1 ;
[0039] 圖 iAbi/GN/GCE (a)、Ab2-AuNPs@AgNCs/Abl/GN/GCE (b)和 GN/GCE (c)的阻抗譜圖；
[0040] 圖8不同濃度PSA(lfg mP-lng ml/1)的LSV圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0041] 圖9(A)AuNPs修飾的免疫傳感器對不同濃度PSA(10fg mL-Llng ml/1)的LSV 圖；(B)AuNPs@AgNCs和AuNPs修飾的免疫傳感器對不同濃度PSA的響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；（C) AuNPs (a)和AuNPsOAgNCs (b)修飾的免疫傳感器在PSA濃度為10fg ml/1時的LSV比較；
[0042] 圖10正常人和乳腺癌病人血清中PSA的表達(dá)水平；
[0043] 圖11㈧不同濃度PSA免疫傳感器在不含H202的N 2飽和的PBS (a)和含5mM H202 的 N2 飽和的 PBS 中的 CV 圖：（b) 0· Olng mL 1, (c) 0. 05ng mL 1, (d) 0. lng mL 1, (e) 0. 5ng mL' (f) lng mLlSA，掃速為 50mV ; (B)AuNPs(a)和 AuNPsOAgNCs(b)作為探針在 5mM H202的N2飽和的PBS中的CV圖；（C)AuNPs@AgNCs (a)和AuNPs (b)作為探針在ΗΝ03中溶解 后的陽極溶出方波伏安圖（SWV)
[0044] 圖 12 免疫傳感器對 f-PSA(A)和 t-PSA ⑶的 LSV 圖：從 lpg ml/1 到 10ng ml/1 ; 該免疫傳感器對不同f-PSA(C)和t-PSA(D)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0045] 圖13(A)AuNPs修飾的免疫傳感器對不同濃度PSA(10pg ml^-lOng ml/1)的LSV 圖；(B)AuNPs@AgNCs(b)和AuNPs(a)修飾的免疫傳感器對不同濃度PSA的響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲 線；（C) AuNPs (a)和AuNPsOAgNCs (b)修飾的免疫傳感器在PSA濃度為10fg ml/1時的LSV 比較；
[0046] 圖 14f-PSA 與 f-PSA Abl 結(jié)合（a)和 t-PSA 與 f-PSA Abl 結(jié)合（b)的 LSV 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合具有實(shí)施方式旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0048] 本發(fā)明免疫電化學(xué)傳感器的構(gòu)建及免疫分析示意如圖1 :
[0049] (1)0嫩-六8從：8的制備：5(^1^10(^]\1的模板鏈52 :3'-六〇6〇六了60：66(：〇0：丁八八 CTC CCC-5'和 0· 8 μ L 50mM 的 AgN03 溶液加入到 50 μ L 20mM 的磷酸緩沖液（PBS，pH = 7. 0) 中，使得Ag+:S2 = 8。然后，0.8yL 50mM新制的NaBH4溶液在0°C下加入到上述溶液中，得 到的溶液強(qiáng)烈震蕩lmin，將S2/AgNCs放在4°C冰箱中于暗處過夜。
[0050] (2)AuNPs@AgNCs 納米復(fù)合材料的制備：25 μ L 40 μ Μ 的 DNA 單鏈 S1 :3' -SH-TTT TT GCC GGC ATG CGT-5'和25yL鏈霉親和素標(biāo)記的金納米粒子（SA-AuNPs，sigma購買） 混合，震蕩lh后，靜置24h，得到的混合物以7000r/min離心lOmin，移去上層清液，加 PBS 分散沉淀物，再次離心，如此重復(fù)兩次，最后將沉淀物分散在PBS中，得到Sl/SA-AuNPs。然 后，50 μ L 20 μ Μ 的 S2/AgNCs 加入到 50 μ L 20 μ M Sl/SA-AuNPs 溶液中，混合液在 90°C下 加熱5min，慢慢冷卻至室溫。制得AuNPsOAgNCs納米雜化材料。
[0051] (3)八11咿8_8從：8標(biāo)記六132的制備：25 4 1^1(^]\1的5八-八11咿8_8從：8與25 4 1^25 48 ml/1的biotin-Ab2混合，混合物在室溫下反應(yīng)4h，得到的AuNPs@AgNCs/Ab 2納米雜化材料以 12000r/min離心lOmin，再分散于PBS中，重復(fù)洗漆三次。AuNPs@AgNCs/Ab 2納米雜化材料 儲存在4 °C冰箱中，備用。
[0052] (4)石墨烯納米片（GS)通過熱剝脫的方法制得，取4mL 0· 5mg/mL氧化石墨烯 (GO)加入到燒杯中，然后加入30 μ L濃氨水。攪拌均勻后，加入20 μ L水合肼，于60°C水浴 下加熱反應(yīng)3. 5小時。冷卻至室溫，離心得到石墨烯納米片（GS)。在超聲輔助下，該納米片 能重新分散于水中。將lmL lmg/mL的石墨烯溶液與lmL 1%的殼聚糖（Chi)溶液混合，超 聲分散1小時，得到殼聚糖修飾的石墨烯納米雜化片（Chi-GS)。
[0053] (5)免疫傳感器的制備：將裸玻碳電極（GCE，直徑為3mm)用0· 5 μ m A1203粉拋光 打磨至鏡面，分別用乙醇和蒸饋水超聲洗漆3min，再用N 2吹干，用于電極修飾。將5mL殼聚 糖修飾的石墨烯納米雜化片Chi-GS(0. 5mg/mL)分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干。將 10 μ L新制的400mM EDC和100mM NHS混合液滴于GN-Chi/GCE上，30min后沖洗。然后， 5 μ L 25 μ g ml/1的滴于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)lh，沖洗；為了阻塞多余的活性基團(tuán) 及抗原與電極之間的非特異性結(jié)合，將電極進(jìn)一步在lwt%的BSA中于37°C下培養(yǎng)40min, 沖洗之后，不同濃度的PSA溶液滴加到電極表面，37°C下培養(yǎng)lh，沖洗掉未結(jié)合的PSA分子； 最后，將制備的AuNPs@AgNCs/Ab2 (10 μ Μ)滴到電極表面，37°C中培養(yǎng)lh，沖洗之后，制備的 電極可用于電化學(xué)測試。
[0054] 用于檢測前列腺癌患者血清PSA時：將2支同樣經(jīng)過上述處理的裸玻碳電極表 面分別滴加不同濃度的free-PSA和total-PSA溶液，37°C下培養(yǎng)lh，沖洗掉未結(jié)合的 free-PSA和total-PSA分子；最后，制備的AuNPs@AgNCs/Ab2 (10 μ M)滴到電極表面，37°C中 培養(yǎng)1小時，沖洗之后，制備的電極可用于電化學(xué)測試。
[0055] (6)檢測乳腺癌患者血清PSA時，15 μ L銀沉積溶液（包含0· 50mM的AgN03和 0. 25mM的抗壞血酸AA)滴到所制備的電極上，避光培養(yǎng)4分鐘，待銀沉積后，用PBS沖洗 電極。將修飾電極用線性掃描伏安法在1. 0M的KC1溶液中掃出Ag+的還原峰，掃描范圍 是-0· 15 到 0· 25V 掃速為 50mV s'
[0056] 檢測前列腺癌患者血清PSA時，兩支分別用free-PSA和total-PSA修飾的電極放 入一個電解池中，該電解池裝有4mL 0. 1M pH為7. 0的N2飽和的PBS，同時含有5mM的H202。 電化學(xué)測試通過雙通道線性掃描伏安法（LSV)從0V到-0.6V完成，掃速為100mV s' LSV 信號響應(yīng)與分析物的濃度成正比，電流強(qiáng)度隨f-PSA和t-PSA濃度的增大而增大。
[0057] 本實(shí)施例采用的抗體均購于上海領(lǐng)潮生物有限公司。
[0058] 本發(fā)明的試驗結(jié)果：
[0059] 本發(fā)明得到的AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的表征和分析
[0060] 1、紫外-可見分光光譜和熒光光譜表征
[0061] 由于銀納米簇和金納米粒子在紫外可見光區(qū)都有特征吸收峰，因此紫外可見吸收 光譜可用于監(jiān)控該復(fù)合物的合成情況。將所得到的AgNCs、AuNPs和AuNPsOAgNCs分別用 紫外分光光度計表征，如圖2所示。AuNPs在521nm左右有吸收峰（如圖2中的曲線a所 示）。如圖2中的曲線b所示，銀納米簇在518nm處有很強(qiáng)的特征吸收峰，而在420左右沒 有吸收，表明銀納米簇成功合成出來。AuNPsOAgNCs納米復(fù)合物在520nm左右有一個很大的 寬峰，由于厚度的增加，銀納米簇的吸收峰發(fā)生紅移（如圖2中的曲線c所示），表明銀納米 簇作為殼成功地包裹著AuNPs。
[0062] 由于銀納米簇具有熒光性，因此熒光光譜可用來監(jiān)控AgNCs和AuNPsOAgNCs的合 成情況。如圖3(A)所示，AgNCs的最大激發(fā)波長為570nm ;在570nm的激發(fā)下，AgNCs的最 大吸收波長為640nm。在紫外燈的照射下，銀納米簇發(fā)強(qiáng)列的紅光，如圖3(B)。圖3(C)是 AgNCs和AuNPsOAgNCs的熒光光譜圖，在最大激發(fā)波長570nm的激發(fā)下，AuNPsOAgNCs的最 大吸收波長為640nm，表明AuNPsOAgNCs的成功合成。
[0063] 2、透射電子顯微鏡表征
[0064] 為了表征AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的形貌，對其進(jìn)行透射電子顯微鏡分析。如 圖4所示，AuNPsOAgNCs納米雜化物均勻地分布在碳膜上，AuNPs周圍有一層黑色的環(huán)包圍 著，這可能是由于AgNCs均勻地分布在AuNPs表面。在組裝過程中，Au核和AgNCs是通過 DNA雙鏈連接起來的，DNA雙鏈為AgNCs和AuNPs提供一個支架，空間上允許AgNCs能夠很 好的分散在AuNPs表面。
[0065] 3、X射線光電子能譜表征
[0066] 為了進(jìn)一步表征AuNPsOAgNCs的組成元素，對其進(jìn)行X射線光電子能譜（XPS)分 析，圖5為納米雜化物中Au元素和Ag元素的XPS譜圖，由圖可知Au元素的4f峰分別位于 83. 6eV和87. 2eV處，374eV和368eV處的峰分別由Ag元素3d3/2和3d5/2軌道激發(fā)。由此可 知，AgNCs已經(jīng)成功固定在AuNPs上。
[0067] 4、電化學(xué)性能
[0068] AuNPsOAgNCs納米雜化物和AuNPs分別修飾在裸玻碳電極上，電極浸沒與N2飽和 的0. 1M的H2S04中，電位在-0. 2-1. 4V以100mV s-1的掃速掃描，得到循環(huán)伏安圖。如圖6 所示，AuNPs表現(xiàn)出一定的活性；與AuNPs相比較，AuNPsOAgNCs的循環(huán)伏安圖既展示出與 AuNPs相類似的特征，又展示出銀的氧化峰，表明AgNCs成功地包覆著AuNPs。析氫區(qū)域反 映電化學(xué)活性位點(diǎn)的存在，AuNPsOAgNCs在0. 65V左右有析氫反應(yīng)發(fā)生，表明該納米復(fù)合材 料表面存在電化學(xué)活性位點(diǎn)，是一種電催化應(yīng)用方面有潛力的納米材料。
[0069] 本發(fā)明制備的用于檢測乳腺癌患者血清PSA的免疫傳感器的表征
[0070] 1、阻抗譜監(jiān)控免疫傳感器的制備
[0071] 阻抗譜圖包括一段半圓形的部分和一段線性部分，在較高頻率下的半圓形部分對 應(yīng)于電子轉(zhuǎn)移限定過程，在較低頻率下的線性部分對應(yīng)于傳質(zhì)過程，半圓直徑對應(yīng)于電子 轉(zhuǎn)移阻力。圖7表示GN/GCE'AIVGN/GCE和AbfAuNPsOAgNCs/AlVGN/GCE的電子阻抗譜圖。 石墨烯修飾的電極表現(xiàn)出較低的電阻，表明高導(dǎo)電性的石墨烯能夠在電極和分析物之間形 成良好的電子和離子傳導(dǎo)途徑。此外，Ab/GN/GC電極表面具有最大的半圓直徑，表明1抗 層形成了障礙，進(jìn)而阻礙氧化還原探針的電子傳遞到電極表面。Ab 2-AuNPS@AgNCS鍵合到電 極表面之后,直徑比Ah/GN/GCE的減小很多，這是由于AuNPsOAgNCs的導(dǎo)電性所致。結(jié)果 與AFM表征的結(jié)果一致。
[0072] 2、免疫傳感器的性能
[0073] 在最優(yōu)的條件下，PSA免疫傳感器用電化學(xué)方法表征。圖8表示線性掃描伏安法測 定不同濃度PSA的信號，免疫傳感器上的AgNCs通過陽極溶出伏安分析法能夠輕易被測定， 而且在+0. 057V處展示出明顯的陽極溶出峰。沉積在免疫傳感器上的AgNPs的溶出峰電流 與分析物（PSA)的量成正比例，PSA濃度在lfg ml^-lng ml/1范圍內(nèi)，峰電流與PSA濃度呈 線性關(guān)系（R = 〇. 999)，基于信噪比為3, PSA的檢出限為0. 2fg mL'得到的動力學(xué)范圍 比基于AuNPs的免疫傳感器測定PSA的線性范圍（0.05ng mdOng ml/1)和基于碳納米管 的PSA免疫傳感器的線性范圍（0. 2ng mdOng ml/1)寬，檢出限也低于碳納米管放大信號 的免疫反應(yīng)測定PSA的檢出限（20pg ml/1)、基于金納米粒子的免疫傳感器檢測PSA的檢出 限（10ng ml/1)、基于EIS微流體的免疫傳感器檢測PSA的檢出限（lng ml/1)和酶聯(lián)免疫法 檢測PSA的檢出限（3. 2ng ml/1)。優(yōu)異的電化學(xué)性能包括非常低的檢出限和跨越3個數(shù)量 級的寬的線性范圍，這對于該免疫傳感器的實(shí)際應(yīng)用具有重要的意義。在該傳感器中，石墨 烯提供一種與蛋白質(zhì)在其固有系統(tǒng)中相似的微環(huán)境，且允許蛋白質(zhì)分子更自由取向，這為1 抗的固定提供空間結(jié)合位點(diǎn)和一個理想而有效的平臺。與此同時，石墨烯和金納米粒子能 夠加速電子傳遞，有效地加強(qiáng)溶出峰的電流，提高檢測的靈敏度。高比表面積的AuNPs允許 大量的AgNCs固載在AuNPs表面上，因此，AuNPs也對催化沉積的銀有一定的貢獻(xiàn)，這進(jìn)一 步增大溶出信號和提高檢測靈敏度。
[0074] 電化學(xué)信號比較實(shí)驗通過分別基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合物和單獨(dú)AuNPs的免疫 傳感器實(shí)現(xiàn)，AuNPsOAgNCs納米復(fù)合物的LSV圖在+0. 057V的催化電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)AuNPs 催化電流。如圖9A所示，用AuNPs作為探針標(biāo)記Ab2構(gòu)建免疫傳感器，得到PSA的檢測下限 為lOfg πι?Λ比AuNPsOAgNCs作為信號標(biāo)簽的檢測下限大10倍；線性范圍為lOfg πι?Λ比 AuNPsOAgNCs的窄，比較了兩者的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9Β)，可以明顯看出AuNPsOAgNCs的線性和 催化活性均比AuNPs的好。同時還進(jìn)一步比較了 AuNPsOAgNCs和AuNPs對沉積銀的電催化 性能，如圖9C所示，當(dāng)PSA濃度為10fg ml/1時，AuNPs和AuNPsOAgNCs均對沉積銀便顯出明 顯的催化活性，但是AuNPsOAgNCs對沉積銀的催化電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于AuNPs,從而證實(shí)了 AuNPsO AgNCs對沉積銀的電催化效應(yīng)是AuNPs和AgNCs的協(xié)同效應(yīng)所引起的，表明AuNPsOAgNCs納 米復(fù)合材料對沉積銀具有更好的電催化活性。小尺寸的AgNCs作為殼、AuNPs作為核，通過 DNA雜交形成核-殼結(jié)構(gòu)，AuNPs作為一種高導(dǎo)電性能的優(yōu)質(zhì)納米材料，AgNCs大的比表面 積和高的電子傳遞效率，可以為沉積銀在電極表面的還原提供電子傳遞的能力。由于電子 導(dǎo)體AuNPsOAgNCs均勻分散在傳感膜中，以及導(dǎo)電性優(yōu)良的石墨烯作為基質(zhì)而形成了三維 電子導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)，從而加速了膜中的電荷傳遞，使得銀離子在電極表面的還原得到增強(qiáng)。同時 這些納米探針AuNPsOAgNCs能夠進(jìn)一步有效地提供電子傳遞路徑，并在電極與分析物之間 加速電子傳遞時起到納米微電極的作用，從而使得AuNPsOAgNCs修飾的電極上時，對銀離 子的電催化還原能力比AuNPs顯著增大。
[0075] 為了測定該P(yáng)SA免疫傳感器的重現(xiàn)性，制備5個平行包含lng ml/1的PSA免疫傳 感器，5個新制的PSA免疫傳感的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是7. 6%，表明該免疫傳感器具有良好的精 密度和重現(xiàn)性。此外，當(dāng)免疫傳感器儲存在4°C的干燥條件下兩周后，響應(yīng)信號減少為開始 信號的92%，這些結(jié)果表明該免疫傳感器具有好的可靠性和穩(wěn)定性，適合于蛋白質(zhì)標(biāo)志物 的臨床診斷。
[0076] 3、免疫傳感器的應(yīng)用
[0077] 為了證明該傳感器能夠用于臨床樣本，將其用于健康女性質(zhì)控樣本和乳腺癌患者 血清中t-PSA的檢測。健康女性中的血清PSA濃度約為lpg mL'用目前已有的方法無法 檢測，因此，不同濃度的PSA加入到健康女性質(zhì)控樣本中并分析檢測，由該免疫傳感器測定 上述血清樣本中的PSA，得到的回收率在99. 2%到106. 9%之間（表1所示），表明該免疫 傳感器在血清樣本中的分析精確性和可靠性是可以接受的。進(jìn)而，用該免疫傳感器檢測三 個乳腺癌患者中t-PSA的表達(dá)水平。圖10為乳腺癌患者血清中PSA的表達(dá)水平，可以明顯 看出健康女性和乳腺癌患者的區(qū)別，乳腺癌患者血清中的溶出信號值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于健康女性質(zhì) 控樣本中的溶出信號，與文獻(xiàn)報道相符合。如表2所示，乳腺癌患者中PSA的表達(dá)水平大約 在0.04ng ml/1左右，與熒光免疫分析法和電致化學(xué)發(fā)光免疫分析法的結(jié)果相似。這些結(jié)果 表明該制備的免疫傳感器能夠識別乳腺癌患者中血清PSA的微小改變，有望應(yīng)用到乳腺癌 的早期識別和診斷。
[0078] 表1 PSA回收率的測定
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 一種基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在 于，以單鏈寡聚核苷酸為模板，合成寡聚核苷酸穩(wěn)定的銀納米簇；帶巰基的互補(bǔ)DNA單鏈通 過Au-S鍵結(jié)合到金納米粒子表面，再兩條互補(bǔ)單鏈雜交，得到AuNPsOAgNCs復(fù)合納米雜化 物；然后以石墨烯為基底固定PSA抗體1，PSA作為分析物，AuNPsOAgNCs標(biāo)記抗體2,由于 抗原抗體之間的特異性結(jié)合，得到用于檢測乳腺癌患者血清PSA的免疫傳感器； 或者以石墨烯為基底固定PSA抗體l，free-PSA和total-PSA分別作為分析物，AuNPsO AgNCs標(biāo)記抗體2,由于抗原抗體之間的特異性結(jié)合，得到用于檢測前列腺癌或前列腺增生 患者血清free-PSA和total-PSA的免疫傳感器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， (1) DNA-AgNCs的制備：模板鏈S2和AgN03溶液加入到磷酸緩沖液中，然后，NaBH4溶液 加入到上述溶液中，得到的溶液震蕩，然后放在4°C冰箱中于暗處過夜； (2) AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料的制備：DNA單鏈S1和鏈霉親和素標(biāo)記的金納米粒 子混合，震蕩后，靜置，得到的混合物離心，移去上層清液，加 PBS分散沉淀物，得到S1/ SA-AuNPs ;然后，將步驟（1)得到的S2/AgNCs加入到Sl/SA-AuNPs溶液中加熱，冷卻至室 溫，即制得； (3) AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記Ab2 :AuNPs@AgNCs納米復(fù)合材料與生物素修飾的 單克隆抗體Ab2混合反應(yīng)，得到的AuNPS@AgNCs/Ab 2納米復(fù)合材料溶液離心，用PBS緩沖溶 液洗滌，備用； (4) 免疫傳感器的制備：將裸玻碳電極拋光打磨至鏡面，超聲洗滌，吹干，用于電極修 飾；將殼聚糖修飾的石墨烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干；再將1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的混合液滴于裸玻碳電極 表面，沖洗；然后，抗體Abjf于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)后，沖洗；為了阻塞多余的活性 基團(tuán)及抗原與電極之間的非特異性結(jié)合，將電極進(jìn)一步在BSA中于37°C下培養(yǎng)后，沖洗，不 同濃度的PSA溶液分別滴加到電極表面，37°C下培養(yǎng)，沖洗掉未結(jié)合的PSA分子，將制備的 AuNPs@AgNCs/Ab2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可制得用于檢測乳腺癌患者血清PSA 的電極； 制備用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫傳 感器時，將2支同樣經(jīng)過上述處理的裸玻碳電極表面分別滴加不同濃度的free-PSA和 total-PSA溶液，37 °C下培養(yǎng)，沖洗掉未結(jié)合的free-PSA和total-PSA分子，將制備的 AuNPs@AgNCs/Ab2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， 0嫩-六8從：8的制備具體過程：40-6(^1^10(^]\1的模板鏈52:3'-六〇6〇六了6〇：66(：〇〇： TAA CTC CCC-5'和0· 6-1. 0 μ L 50mM AgN03溶液加入到pH = 7. 0-8. 0磷酸緩沖液中，使得 Ag+ :S2 = 7-9,然后，0. 6-1. 0μ L 50mM新制的NaBH4溶液加入到上述溶液中，得到的溶液強(qiáng) 烈震蕩至少lmin，得到的S2/AgNCs放在4°C冰箱中于暗處過夜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的制備具體過程：20-30yL 40μΜ DNA單鏈SI :3'-SH-TTT 17 6〇：660 416 061'-5'和20-3(^1^鏈霉親和素標(biāo)記的金納米粒子混合，震蕩至少111后， 靜置至少24h，得到的混合物以6000-8000r/min離心至少lOmin，移去上層清液，加 PBS分 散沉淀物，再次離心，如此重復(fù)至少兩次，最后將沉淀物分散在PBS中，得到Sl/SA-AuNPs ; 然后，40-6(^1^2(^]?52/^8從：8加入到40-6(^1^2(^]\131/54-411咿8溶液中，混合液在 85-95°C下加熱至少5min，慢慢冷卻至室溫，即可。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料標(biāo)記Ab2的制備具體過程：20-30 μ L 10 μ M AuNPsOAgNCs 納米復(fù)合材料與20-30 μ L 25 μ g ml/1生物素修飾的單克隆抗體Ab2混合，混合物在室溫下 反應(yīng)至少4h，得到的AuNPs@AgNCs/Ab 2納米復(fù)合材料以10000-14000r/min離心至少10min， 再分散于pH = 7. 5的PBS中，重復(fù)洗滌至少三次，儲存在4°C冰箱中，備用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， 免疫傳感器的制備的具體過程：將裸玻碳電極用〇. 4-0. 6 μ m A1203粉拋光打磨至鏡 面，分別用乙醇和蒸餾水超聲洗滌至少3min，再用N2吹干，用于電極修飾；將殼聚糖修飾的 石墨烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面，自然烘干；將新制的1-乙基-(3-二甲基氨 基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺混合液滴于裸玻碳電極上，沖洗；然后再將 Ah滴于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)至少lh，沖洗；為了阻塞多余的活性基團(tuán)及抗原與電極 之間的非特異性結(jié)合，將電極進(jìn)一步用BSA封閉，沖洗之后，不同濃度的PSA溶液分別滴加 到電極表面，37°C下培養(yǎng)至少lh，沖洗掉未結(jié)合的PSA分子，將制備的AuNPs@AgNCs/Ab 2滴 到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可制得用于檢測乳腺癌患者血清PSA的電極； 制備用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA的免疫傳 感器時，將2支同樣經(jīng)過上述處理的裸玻碳電極表面分別滴加不同濃度的free-PSA和 total-PSA溶液，37°C下培養(yǎng)至少lh，沖洗掉未結(jié)合的free-PSA和total-PSA分子，將制 備的AuNPs@AgNCs/Ab 2滴到電極表面，37°C培養(yǎng)后，沖洗，即可。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的制備 方法，其特征在于， 將5-10mL0. 5mg/mL的殼聚糖修飾的石墨烯納米雜化片分散液滴于裸玻碳電極表面， 自然烘干；將l〇_2〇yL新制的400mMl-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽和 100mM N-羥基琥珀酰亞胺混合液滴于裸玻碳電極上，30min后沖洗；然后，5-10 μ L 25 μ g ml/1的Ah滴于電極表面，37°C下密封培養(yǎng)至少lh，沖洗；將電極進(jìn)一步用BSA封閉，沖洗 之后，不同濃度的PSA溶液，或者free-PSA和total-PSA溶液，沖洗掉未結(jié)合的PSA分子或 者未結(jié)合的free-PSA和total-PSA分子后，滴加濃度為10 μ Μ的AuNPs@AgNCs/Ab2到電極 表面，37°C培養(yǎng)至少lh。
8. -種基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器，其特征在于，是由權(quán)利 要求1-7任一項所述的方法制備而成的。
9. 權(quán)利要求8所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的應(yīng)用方 法，其特征在于， 用于檢測乳腺癌患者血清PSA時，用陽極溶出伏安法檢測AuNPsOAgNCs對銀離子的催 化效果，通過Ag+的還原信號值反應(yīng)PSA的濃度變化； 用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA時，利用AuNPsO AgNCs對H202的電化學(xué)催化，通過雙通道同時檢測出free-PSA和total-PSA，得到f/t-PSA 的值。
10.權(quán)利要求8所述的基于AuNPsOAgNCs納米復(fù)合材料的免疫電化學(xué)傳感器的應(yīng)用方 法，其特征在于， 用于檢測乳腺癌患者血清PSA時，包含AgN03和抗壞血酸的銀沉積溶液滴到所制備的 電極上，避光培養(yǎng)3-10分鐘，待銀沉積后，用PBS沖洗電極，將修飾電極用線性掃描伏安法 在1. 0M的KC1溶液中掃出Ag+的還原峰，掃描范圍是-0. 15到0. 25V，掃速為50mV s' 用于檢測前列腺癌或前列腺增生患者血清free-PSA和total-PSA時，兩支分別用 free-PSA和total-PSA修飾的電極放入裝有4mL 0· 1Μ，ρΗ為7. 0的N2飽和的PBS，同時含 有5mM的H202的電解池中，電化學(xué)測試通過雙通道線性掃描伏安法從0V到-0. 6V完成，掃 速為 100mV s'
【文檔編號】G01N33/577GK104267184SQ201410430543
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】鄧留, 韓雅靜, 李理, 劉又年, 盧紅梅 申請人:中南大學(xué)