專利名稱：人乳頭狀瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒及其基因芯片制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有與人乳頭狀瘤病毒HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序 列的探針，和含有該探針的檢測(cè)HPV具體亞型的基因分型檢測(cè)試劑盒 及其基因芯片制備方法。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一。全世界每年約有50萬(wàn) 新發(fā)子宮頸癌病例，亞洲約38萬(wàn)，中國(guó)約15萬(wàn)例，全世界每年約23 萬(wàn)婦女死于宮頸癌，亞洲約19萬(wàn)，中國(guó)約8萬(wàn)。宮頸癌是女性第二 大常見惡性腫瘤，特別是人乳頭狀瘤病毒感染導(dǎo)致當(dāng)代子宮頸癌及癌 前病變發(fā)生率曰益增高并趨向年輕化，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的身心健 康。所以預(yù)防、診斷和治療宮頸癌對(duì)于廣大的婦女來說，是一個(gè)亟待 解決的問題。
從1995年的IARC專題討論會(huì)上通過HPV感染是宮頸癌的主要原 因，即HPV感染是宮頸癌發(fā)生的先決必要引發(fā)條件，到目前為止已鑒 定出100多種的HPV基因亞型，約40種與肛門生殖道感染有關(guān)。根 據(jù)在宮頸癌發(fā)生中的危險(xiǎn)性不同，分為(高危)HR-HPV和(低危)LR-HPV 兩大類，高危型的HPV與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系比較密切，而且不同HPV
亞型的感染其致病性和后果也有差異。基于以上所述，檢測(cè)出樣本中 的具體HPV亞型對(duì)于子宮頸癌的防治具有重要的指導(dǎo)意義。
早期對(duì)宮頸癌的篩查和診斷，主要是采用形態(tài)學(xué)的檢查，包括巴
氏圖片(Pap smear)和液基細(xì)胞學(xué)(LCT、 TCT )。感染HPV的宮頸上 皮細(xì)胞可產(chǎn)生形態(tài)學(xué)的改變。但是無(wú)論怎樣，這樣的方法總會(huì)出現(xiàn)一 種未確定意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASCIIS),?？裳谏w一部分有意 義的組織病理學(xué)異常而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè) HPV感染。
分子生物學(xué)包含幾種常用的方法。核酸分子雜交，如Southern 雜交、原位雜交等，方法比較靈敏，但操作煩瑣，不適合臨床操作。 PCR檢測(cè)方法操作雖然簡(jiǎn)單，但是由于其高靈敏性，容易導(dǎo)致非特異 性擴(kuò)增而出現(xiàn)假陽(yáng)性。商業(yè)化雜交捕獲(Hybrid Capture II, HCII ) 試劑盒不用經(jīng)過PCR擴(kuò)增，通過特定的探針直接檢測(cè)出臨床樣本中是 否存在HPV病毒。但是該方法使用的探針是RNA,可能會(huì)影響試劑盒 的穩(wěn)定性。最為關(guān)鍵的是該方法只能檢測(cè)出樣本中是否有HPV病毒的 感染，不能鑒定出具體的HPV病毒亞型，不利于臨床跟蹤檢測(cè)和治療。
而且，在巿面上銷售的基因試劑盒所采用的探針大多缺少中國(guó)人 群常見亞型(53/66/CP83(M),涵蓋的亞型少，并不適合國(guó)人的情況，
往往容易造成檢測(cè)的疏漏。因此，研制和開發(fā)一種適于中國(guó)人、簡(jiǎn)單、 快速和準(zhǔn)確的HPV分型檢測(cè)方法顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有相近的Tm值、涵蓋亞型多、更適 合中國(guó)人的與人乳頭狀瘤病毒HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針。
本發(fā)明的主要目的是提供一種能簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確檢測(cè)HPV具體 亞型的基因分型檢測(cè)試劑盒及其基因芯片制備方法。
本發(fā)明的一種具有與人乳頭狀瘤病毒HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序列 的探針，其中探針選自SEQ ID Nos: 1-21和與SEQ ID Nos: 1-21互
補(bǔ)的序列，每一種探針的核苷酸排列順序如下
HPV65z-cataagaagatacct taggacUg-.3'(SEQ ID No. 1 )
HPV115,一acUagcagtaacgtctcagatgt-(SEQ ID No. 2 )
HPV165r-ctatacaagtacgtcgtcgatatg-(SEQ ID No. 3)
HPV185,-gtatcactaagtactcgtcgaatg—3'(SEQ ID No. 4 )
HPV 3157一gacttcaatag tactagteatcgg-3'(SEQ ID No. 5 )
HPV335z-ctgatcatgaactacgteatggat-3'(SEQ ID No. 6 )
HPV355z一ctagtgtcatgacacgtatcatag-3'(SEQ ID No. 7 )
HPV395,一cctaagtgtagacacgtatcagtt-3'(SEQ ID No. 8)
HPV4257一gctatcgtcatgaactatgctaga-.3'(SEQ ID No. 9 )
HPV435z一actgtgtcatgacacgtatcaagt-^(SEQ ID No. 10)
HPV445'-tagtgctcgagacacgtatcatat- 3'(SEQ ID No. 11 )
HPV455z-atgtgtcatgacacgtatcatagc-.3'(SEQ ID No. 12)
HPV CP83045' -gcactaatagttcagttgcag--3'(SEQ ID No. 13)
HPV535'一ttctatcatgacacgtatcactgg-3'(SEQ ID No. 14)
HPV525'-cagagctcgagacacgtatcaact-3'(SEQ ID No. 15)
HPV56■ 5'—aatggtcatgacacgtatcaagga一3'(SEQ ID No. 16)
(SEQ ID No. 17) (SEQ ID No. 18) (SEQ ID No. 19) (SEQ ID No. 20) (SEQ ID No. 21 ) 種高危亞型
HPV58 5' -agcaaatgaaacagttgcagga-3'
HPV59 5' -gcctaatgaaacagttgcaccc-3'
HPV61 5' —tctgaatgaaacagttgctaca-3'
HPV66 5' -gcatctatagtatcagttagacg-3'
HPV68 5' -atgtgtcatgagtatcatagc-3' 上述的 21 種亞型 HPV , 包括 13
(6/11/42/43/44 )和3種中國(guó)人群常見亞型(53/66/CP8304 )。本發(fā) 明針對(duì)每一種HPV亞型設(shè)計(jì)的探針有著合理的堿基成分，探針的Tm 值在44. 5。C到47。C之間，相對(duì)比較均一，即21種亞型探針和對(duì)應(yīng)的 PCR產(chǎn)物雜交時(shí)最適宜的溫度條件基本一致，有利于在同一雜交溫度 下的同步性，不會(huì)因?yàn)闇囟鹊膯栴}而影響雜交的結(jié)果，使檢查的準(zhǔn)確 性大大增加。
本發(fā)明的一種人乳頭狀瘤病毒HPV基因分型檢測(cè)試劑盒，包括 (1) 一個(gè)基因芯片，其上帶有
(i) 不同HPV型別的核苷酸探針，其中探針至少是一個(gè)選自SEQ ID Nos: 1-21和與SEQ ID Nos: 1-21互補(bǔ)的序列；
(ii) 標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列(Bio)，用于監(jiān)控雜交是否成 功，序列為SEQ ID No. 22:
Bio 5' -cgtccaaggggaaactgatct-3' (SEQ ID No. 22 );
(iii) 帶有編碼P-球蛋白部分的DNA序列(IC),作為內(nèi)控點(diǎn)，
用于監(jiān)控PCR體系是否成功，序列為SEQ ID No. 23:
IC 5' -ccagggttagcatgtcaattcct-3'( SEQ ID No. 23 );
U)各種引物，用于擴(kuò)增臨床樣本中的DNA序列，該引物選自
MY09/MY11,其序列分別為SEQ ID No. 24、 SEQ ID No. 25:
MY09 5' -cgtccmarrggawactgatc-3'(SEQ ID No. 24)
MY11 5' -gcmcagggwcataayaatgg-3'(SEQ ID No. 25)
其中m表示a或c, r表示a或g, w表示a或t， y表示c或t。 選用MY引物對(duì)在于該類引物對(duì)HPV的檢測(cè)比較敏感，特別是對(duì)
多亞型感染的檢測(cè)，增加了 HPV檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
本發(fā)明上述的試劑盒，所述基因芯片包括用于定位探針的位置標(biāo)記。
本發(fā)明上述的試劑盒，所述基因芯片的探針是固定在尼龍膜上。 本發(fā)明上述的試劑盒，所述引物的5'端標(biāo)記有生物素。 本發(fā)明所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟 (1 ) DM探針的制備合成與HPV DNA互補(bǔ)的5'末端經(jīng)過胺基 化的DNA片段
從HPV DNA的LI區(qū)中挑選出特定的序列，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)特 點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成出5'末端經(jīng)過胺基化的DNA片段；
(2)固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上
先對(duì)尼龍膜進(jìn)行活化處理，然后將探針點(diǎn)到膜上，通過探針末端 的胺基與活化膜上的羧基形成共價(jià)結(jié)合，牢固地將探針固定在膜上；
(3)制備基因芯片利用氫氧化鈉停止反應(yīng)，制得基因芯片。
利用本發(fā)明所述的HPV基因分型檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HPV感染的方法 包括以下步驟利用HPV基因分型檢測(cè)試劑盒中含特定序列的引物 PCR擴(kuò)增臨床樣本中的DNA;對(duì)擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行雜交；檢測(cè)基因芯 片表面上結(jié)合的DNA。
具體步驟如下
第一步擴(kuò)增樣品
將臨床樣本中提取的DNA通過HPV基因分型檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò) 增，所用引物的5'端標(biāo)記有生物素，擴(kuò)增得到5'端帶有生物素標(biāo) 記的DNA產(chǎn)物；
第二步雜交
使用導(dǎo)流雜交技術(shù)，將上述擴(kuò)增得到的DNA與基因芯片上面分布 的DNA探針、Bio和IC進(jìn)行反應(yīng)； 第三步顯色
在堿性磷酸酶AP酶的作用下，利用NBT/BCIT系統(tǒng)顯色，肉眼直 接觀察結(jié)果。
在基因檢測(cè)中，由于操作步驟繁瑣，操作失誤難以避免，本發(fā)明 在試劑盒中使用了標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列和帶有編碼p-球蛋白 部分的DNA序列，分別用于監(jiān)控雜交和PCR體系是否成功，便于操作 人員在檢測(cè)過程出錯(cuò)時(shí),快速區(qū)分是在PCR時(shí)出錯(cuò)還是在雜交時(shí)出錯(cuò)， 以便迅速找出發(fā)生錯(cuò)誤的原因，縮短檢測(cè)時(shí)間。另外，在現(xiàn)有技術(shù)中，
由于探針載體多采用玻璃等，通透性差， 一般只能使用傳統(tǒng)雜交方法 進(jìn)行雜交，操作起來較為麻煩，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)， 一般至少都在6個(gè)小時(shí)
以上，而且顯色結(jié)果的背景不干凈；本發(fā)明使用尼龍膜做為探針載體, 由于尼龍膜較其它固體支持物(如玻璃等)具有良好的通透性，不但 利于導(dǎo)流雜交技術(shù)的應(yīng)用，且具有很好的彈性，便于生產(chǎn)和操作，縮 短了檢測(cè)時(shí)間，只需要3.5小時(shí)左右，顯色結(jié)果的背景干凈。
本發(fā)明所述HPV基因分型檢測(cè)試劑盒能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出HPV
感染及鑒定具體的亞型，對(duì)于子宮頸癌的早期診斷，預(yù)防、治療和手
術(shù)后的跟蹤具有重大的意義。


以下是附圖的說明，便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。 圖l是表示基因芯片上探針和監(jiān)控點(diǎn)的類型和具體的分布位置的 圖片，數(shù)字代表不同的HPV亞型，"Bio"代表標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DM 序列，"IC"代表帶有編碼(3-球蛋白部分的DNA序列，"+ "代表位 置標(biāo)記。
圖2a是表示HPV6 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖2b是表示HPV11 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖2c是表示HPV42 DM分析結(jié)果的圖片。 圖2d是表示HPV43 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖2e是表示HPV44 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3a是表示HPV16 DNA分析結(jié)果的圖片。
圖3b是表示HPV18 DM分析結(jié)果的圖片。 圖3c是表示HPV31 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3d是表示HPV33 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3e是表示HPV35 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3f是表示HPV39 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3g是表示HPV45 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3h是表示HPV51 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3i是表示HPV52DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3j是表示HPV56 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3k是表示HPV58 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖31是表示HPV59 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖3m是表示HPV68 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖4a是表示HPV53 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖4b是表示HPV66 DNA分析結(jié)果的圖片。 圖4c是表示HPVCP8304 DNA分析結(jié)果的圖片。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。
實(shí)施例中，20。/。的EDAC溶液、0. 1%SDS、 0. 25%脫脂奶粉、0.05% 硫柳汞、0.05%疊氮鈉均是指質(zhì)量比，0.1% Tween 20是指體積比。 實(shí)施例1 基因芯片的制備
根據(jù)世界范圍內(nèi)的HPV感染研究結(jié)果和國(guó)內(nèi)的實(shí)際HPV感染情
況，選擇出21種亞型HPV,包括13種高危亞型(16/18/31/33/35/3 9/45/51/52/56/58/59/68 ),五種低危亞型(6/11/42/43/44 )和3種 中國(guó)人群常見亞型(53/66/CP8304 )。針對(duì)每一種HPV亞型，設(shè)計(jì)和 合成5'端帶有胺基的特異性基因探針，并制備IC和Bio,用于HPV 的檢測(cè)。
DNA基因芯片的制作步驟如下將制備的探針、IC和Bio首先溶 解在超純水中，制成濃度為200uM的母液，然后溶解在pH-8.4的 0. 5麗a2C。3和0. 5M NaHC03的溶液中,使其最終濃度為2 uM。
對(duì)尼龍膜進(jìn)行處理，首先放入O. 1MHC1溶液中浸泡30秒鐘，然 后把已除去殘余溶液的膜放進(jìn)2 0%的EDAC溶液中浸泡15分鐘，最后 放在洗膜盤中用200ml的純化水沖洗IO秒鐘，此步驟重復(fù)3次，再 放到吸水紙上除去多余的殘液。轉(zhuǎn)入溫度為2(TC、濕度為45%的烘干 箱內(nèi)烘干12小時(shí)。將已烘干的尼龍膜用Ki歸ipes紙隔開，裝入封口 薄膜袋中，放進(jìn)點(diǎn)膜間的冰箱中，貯藏在4匸的溫度下，備用。
通過微量移液設(shè)備將上述制備好的探針、IC和Bio分別點(diǎn)在上述 處理過的尼龍膜上，每滴0.4ul。點(diǎn)膜完成后，將膜放置于室溫15 分鐘，進(jìn)行反應(yīng)。然后將膜轉(zhuǎn)入0.1M NaOH溶液中浸泡IO分鐘，停 止反應(yīng)。將洗好的膜轉(zhuǎn)入溫度為2(TC、濕度為45%的烘干箱內(nèi)放置12 小時(shí)，即制得基因芯片。
實(shí)施例2 樣品制備
實(shí)施例2-1陽(yáng)性對(duì)照組樣品的制備
利用MY09/MY11引物對(duì)插入到pMD-T vector中的HPV18片段進(jìn) 行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25ul,包含10x buffer ， 2. 5ul; 25mMMgCl2， 6.0ul; 10mM d(A/C/G)TP, 0. 5ul; lOOuM生物素標(biāo)記引物MY09, 0.25ul; 100uM生物素標(biāo)記引物MYll， 0. 25ul;內(nèi)對(duì)照DM, 1. Oul; ddH20， 12. 4ul; lOOmMdUTP, 0. lul; UNGase (1U/ul) ， 0. 25ul; TaqDNA 聚合酶，0. 25ul;膜板DNA, 1. Oul;共25 ul。 PCR反應(yīng)程序?yàn)槭?先95。C變性9分鐘，然后95。C, 20秒；55°C, 30秒；72°C, 30秒； 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸5分鐘。
實(shí)施例2-2 HPV標(biāo)準(zhǔn)品的制備
同實(shí)施例2-l相似步驟制備生物素結(jié)合的擴(kuò)增HPV DNA樣品，不
同之處在于利用上述各種質(zhì)粒作為模板。
實(shí)施例2-3臨床樣本中DNA樣品的制備
采用煮沸和異丙醇沉淀法制備和純化臨床樣本中的DNA,然后參 照實(shí)施例2-1中的方法擴(kuò)增得到帶有生物素標(biāo)記的DNA。 實(shí)施例3利用DNA基因芯片檢測(cè)HPV DNA
利用導(dǎo)流雜交技術(shù)，將實(shí)施例2中擴(kuò)增得到的DNA樣品用實(shí)施例 1中制備的基因芯片進(jìn)行檢測(cè)，DNA樣品和基因芯片中尼龍膜上的探 針、Bio和IC反應(yīng)，最后根據(jù)顯色情況進(jìn)行判斷，有顯色的探針點(diǎn)表 示相應(yīng)的HPV亞型，IC點(diǎn)顯色表示擴(kuò)增成功，Bio點(diǎn)顯色表示雜交成 功。進(jìn)行臨床樣本檢測(cè)的同時(shí)，做陽(yáng)性HPV18陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
將擴(kuò)增獲得的25ul產(chǎn)物95"C下變性5分鐘，迅速轉(zhuǎn)移到冰水混 合物中，放置2分鐘。然后加入到事先溫洛到45r的0. 5ml雜交液中 (2xSSC/0. 1%SDS),混勻后加入到雜交儀的反應(yīng)孔中，應(yīng)用于實(shí)施例 1制得的基因芯片，45'C雜交10分鐘。然后用溶液B( 2xSSC/0. 1%SDS， 45。C溫洛)清洗3遍。加入0. 5ml封阻液(0. 25°/。脫脂奶粉，0. 05%硫 柳汞)，25'C封閉5分鐘。抽干后加入O. 5ml的酶標(biāo)液(TBS中溶解的 帶有鏈霉親和素標(biāo)記的AP酶)，酶標(biāo)5分鐘。用0. 8ml溶液A (TBS, 0. 1% Tween 20及0. 05%疊氮鈉)清洗4遍，然后加入0. 5ml的顯 色液(NBT/BCIP)，避光顯色5分鐘。最后用溶液B沖洗3遍，晾干， 分析顯色情況，判讀結(jié)果。 序列表
<110〉潮州凱普生物化學(xué)有限公司
<120>人乳頭狀瘤病毒基因分型檢測(cè)試劑盒及其基因芯片制備方法
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<212> DNA <213>人工序列
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<223> 引物HPV6
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cataagaaga taccttagga cttg 24
<210> 2
<211〉 24<212〉 腿 <213〉人工序列
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<223〉 引物HPV11
<400〉 2
acttagcagt aacgtctcag atgt 24
<210〉 3
<211〉 24
<212> 腿 <213>人工序列
<220>
<223> 引物HPV16
<400> 3
ctatacaagt acgtcgtcga tsttg 24
<210〉 4
<211> 24
<212> 陽(yáng) <213>人工序列
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<223> 引物HPV18
<400> 4.
gtatcactaa gtactcgtcg aatg 24
<210> 5
<211〉 24
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉 引物HPV31
<400〉 5
gacttcaata gtactagtca tcgg 24
<210〉 6 <211〉 24 <212〉 腿 <213>人工序列
<220〉
<223> 引物HPV33
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ctgatcatga actacgtcat ggat 24
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<211〉 24
<212> 腿
<213〉 人工序列
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<223> 引物HPV35
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ctagtgtcat gacacgtatc atag 24<210〉 8
<211> 24
<212〉 DNA <213>人工序列
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<223〉 引物HPV39
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cctaagtgta gacacgtatc agtt 24
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<212> 腿
<213> 人工序列
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<223> 引物HPV42
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gctatcgtca tgaactatgc taga 24
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<212> 腿 <213>人工序列
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<223〉 引物HPV43
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actgtgtcat gacacgtatc aagt 24
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<212> 腿 <213〉人工序列
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<223> 引物HPV44
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tagtgctcga gacacgtatc atat 24
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<212> DNA <213>人工序列
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<223〉 引物HPV45
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atgtgtcatg acacgt"ca tagc 24
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<212> 腿 <213〉人工序列
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<223> 引物HPVcp8304
<400〉 13
gcacta汪tag ttcagttgca g
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<212> DNA <213〉人工序列
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<223> 引物HPV53
<400〉 14
ttcUtcatg acacgtatca ctgg
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<223> 引物HPV52
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cagagctcga gacacgtatc aact 24
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<212> 腿 <213〉人工序列
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<223〉 引物HPV56
<400〉 16
aatggtcatg acacgtatca agga 24
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<212> 腿 <213>人工序列
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<223> 引物HPV58
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agcaaatgaa acagttgcag ga 22
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<212> DNA <213〉人工序列
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<223> 引物HPV59
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gccUatgaa acagttgcac cc 22
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<212〉 DNA
<213>人工序列
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<223〉 引物HPV61
<400> 19
tctga"gaa acagttgcta ca 22
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<212> 腿 <213〉人工序列
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<223> 引物HPV66
<400> 20
gcatctatag tatcagttag acg 23
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<212> 腿 <213>人工序列
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<223> 引物HPV68
<400> 21
atgtgtcatg agtatcatag c 21
<210> 22
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<212〉 DNA <213〉人工序列
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<223> Bio
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cgtccaaggg gaaactgatc t 21
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<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223> IC
<400> 23
ccagggttag catgtcaatt cct 23
<210> 24
<211〉 20
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉 引物MY09
<400> 24
cgtccmarrg gawactgatc 20 <210> 25
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223> 引物MY11
<400> 25
gcmcagggwc ataayaatgg 20
權(quán)利要求
1、一種具有與人乳頭狀瘤病毒HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針，其中探針選自SEQ ID Nos1-21和與SEQ ID Nos1-21互補(bǔ)的序列。
2、 一種人乳頭狀瘤病毒HPV基因分型檢測(cè)試劑盒，包括 (1) 一個(gè)基因芯片，其上帶有(1) 不同HPV型別的核苷酸探針，其中探針至少是一個(gè)選自 SEQ ID Nos: 1-21和與SEQ ID Nos: 1-21互補(bǔ)的序列；(ii) 標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列,序列為SEQ ID No. 22;(iii) 帶有編碼p-球蛋白部分的DM序列，作為內(nèi)控點(diǎn)， 序列為SEQ ID No. 23;(2) 各種引物，用于擴(kuò)增臨床樣本中的DNA序列，該引物選 自MY09/MY11,其序列分別為SEQ ID No. 24、 SEQ ID No. 25。
3、 權(quán)利要求2所述人乳頭狀瘤病毒HPV基因分型檢測(cè)試劑盒,其特征是所述基因芯片包括用于定位探針的位置標(biāo)記。
4、 權(quán)利要求2所述人乳頭狀瘤病毒HPV基因分型檢測(cè)試劑盒，其特征是所述基因芯片的探針是固定在尼龍膜上。
5 、權(quán)利要求2所述人乳頭狀瘤病毒HPV基因分型檢測(cè)試劑盒,其特征是所述引物的5'端標(biāo)記有生物素。
6、權(quán)利要求2所述基因芯片的制備方法，包括如下步驟 (1) DNA探針的制備合成與HPV DNA互補(bǔ)的末端經(jīng)過胺基化的DNA片段； 、(2) 固定探針將上述探針固定在活化處理好的尼龍膜上；(3) 制備基因芯片利用氫氧化鈉停止反應(yīng)，制得基因芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有與人乳頭狀瘤病毒HPV DNA互補(bǔ)的核苷酸序列的探針，和含有該探針的基因分型檢測(cè)試劑盒及其基因芯片制備方法。該探針選自SEQ ID Nos1-21和與SEQ ID Nos1-21互補(bǔ)的序列。該試劑盒包括一個(gè)基因芯片，其上帶有至少一個(gè)上述探針、標(biāo)記有生物素點(diǎn)的DNA序列、帶有編碼β-球蛋白部分的DNA序列，各種選自MY09/MY11的引物。該試劑盒的基因芯片通過DNA探針的制備，固定探針，利用氫氧化鈉停止反應(yīng)等步驟制得。本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出HPV感染及鑒定具體的亞型，更適合中國(guó)人，對(duì)于子宮頸癌的早期診斷、預(yù)防、治療和手術(shù)后的跟蹤具有重大的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101177701SQ20071003072
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2007年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月29日
發(fā)明者謝龍旭 申請(qǐng)人:潮州凱普生物化學(xué)有限公司