專利名稱：制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋 白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)
其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、
藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin,簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和
變藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，
每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin )通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白
(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相
互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得
CPE主要吸收約560固的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570ntn的可見光，發(fā)
射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650
660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素
(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素
(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍(lán)膽素
(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放
大作用，提高檢測靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測和醫(yī)
療檢測等領(lǐng)域。目前主要是通過化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對(duì)目標(biāo)的標(biāo)記。
CPC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(TooleyAJ, CaiYA， Glazer
A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C_phycocyanin holo-alpha
subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA' 2001, 98(19):10560
10565)。 PCB生物合成基因由力o7和pc/力組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)PCB
(F. T丄andgraf， C. Forreiter, et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia
coli[J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。我們通過基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素基
因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)
得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素和
藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的連接，而不需要通過化學(xué)交聯(lián)等方法來實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記；把藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因、PCB生物合成基因克隆于表達(dá)載體。利用以上 表達(dá)載體，通過基因工程菌，可以直接生成鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光 蛋白質(zhì)。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。藻藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過直接實(shí)現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔 基蛋白的連接，可用于生物學(xué)檢測以及醫(yī)療檢測領(lǐng)域。本發(fā)明為藻藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功 能材料應(yīng)用于醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域，特別是檢測領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白
質(zhì)的方法。它是應(yīng)用藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合催化藻藍(lán)膽素(PCB)與鏈霉親和素標(biāo)記的藻
藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞
基類熒光蛋白質(zhì)。將含有藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白
alpha亞基類脫輔基蛋白基因拼接的基因、藻藍(lán)膽素生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入
宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)
蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光
蛋白質(zhì)的方法，包括下述步驟
(1) 采用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中， 得到alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法將鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或 其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法將PCB生物合成酶基因力o7和或其同源基因同時(shí)克隆于第 三個(gè)表達(dá)載體中或分別克隆于第三、第四個(gè)表達(dá)載體中，得到PCB合成質(zhì)粒。
(4) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、PCB生物合 成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌， 應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋 白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)。
上述的制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)的方法中所述的宿 主菌為大腸桿菌。所述的alpha亞基裂合酶基因是指與A7aZ ae/7a sp. PCC7120中"cf和 c; c,基因或M ^啦7 osiAs sp. PCC7603中c;x^和c; C基因同源的基因。所述的藻藍(lán)蛋 白alpha亞基類脫輔基蛋白基因是指與A7a6ae朋sp. PCC7120或#. 7a肌'/7o犯s sp. PCC7603中cpd同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)，大 腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；
4、 產(chǎn)物中鏈霉親和素與熒光藻藍(lán)蛋白alpha亞基類色素蛋白質(zhì)直接結(jié)合，不需額外 進(jìn)行處理，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明中a^A/a^,催化下生成的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒 光蛋白質(zhì)的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。 具體實(shí)施方
下面以實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。 實(shí)施例1
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種如s6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， J柳眾as〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/4/ s力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)
為BA000019，必7a/w'/70S"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱和 力/7a6ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s^在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻藍(lán) 蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔 基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將力/ a/bae朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ c^和cpc尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpc￡-c/ cF，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Qx^/c;x^，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(Zw7和pc州)克隆于Novagen公司購買的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pcyA在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA。 即脫輔基蛋白基因c; c力在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因sa在和^71I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是AboI和之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和/力o I之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力o7和 ; c/力，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Afco I和 I之間，pc^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在7Votel和i7wI之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-cpcf-c; cF、 pET30-sa~cpd和pACYCDuet-Ao/-/ 《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D卿為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1,1/L， 2CTC至37。C振蕩表達(dá)約12小 時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。其吸收與 熒光光譜見圖l所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)過夜；取100nL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 3 0. 4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10分鐘；離心1分鐘(10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g, 4'C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30分鐘，42'C熱休克90s，冰浴5分鐘后加入300nLLB培養(yǎng)基，37。C低速振蕩培養(yǎng)45分鐘，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37'C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取100nL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37'C振蕩培養(yǎng)至ODe。。-0. 5-0.7 時(shí)，冰浴約30分鐘，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、20°C、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離 心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株 進(jìn)行大量表達(dá)。 實(shí)施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種//朋6se"a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 脫7a/Biy7oms sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/J朋力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，尨7a/w'"os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱m)和 力朋力ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-srcpd，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻藍(lán) 蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔 基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將Ja/w'/ o幼ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ cf和cpc, 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/ cf-cpc尸，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶。c￡/c/7CF，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PcyA。
即脫輔基蛋白基因c/ d在pET30中是在f RV和/力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因m在《p/7l和)fe7II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酵切位點(diǎn)是tVcoI和尸"I之間，裂合酶基因cpcF在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^boRV和/力oI之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力W和 pc州)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，Z o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在AfcoI和尸" I之間，pcj^l在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在y^tel和^oI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分
別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-cpcf-cpc,、 pET30-sa~cpc力和pACYCDuet-Z o7-p《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種/l朋6ae朋sp.PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， vK Ja/z i/70SiAs sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，M Ja肌'/70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱m)和
^肌'/70s"s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-stcpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻 藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫 輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將^ a^e/7a sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpcF克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpc￡-cpc尸，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Ox^/c/^F，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(Zw7和pcW)克隆于Novagen公司購買的
pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc7A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA。
即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親和素基因sa在vf/wl和^71I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因c/x^在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afco I和,W I之間，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和// o I之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力o7和 pc^)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-l中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在AfcoI和/^t I之間，/ c/力在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在AWeI和iT oI之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-cpcf-c; cF、 pET30-s『cpc力和pACYCDuet-力o7-pc/zJ轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例4(1)從GeneBank中可以査到，藻種j朋6訓(xùn)a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Ja/w'/7aws sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ atee/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，vf/. 7a肌7 os〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和 M 7a肌'/7os"ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa"C/ d，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻 藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫 輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將必Ja肌'/70s〃ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c/ c尸 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-cpcF，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Qjc￡/c;x^，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc;^)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ W了c/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PcyA。即脫輔基蛋白基因cpM在pET30中是在AcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因m在和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpM在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afco I和尸"I之間，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是化oRV和J力o I之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力o7和 pc/j),它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Afco I和尸W I之間，/ c/Z在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在WeI和J力ol之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pETDuet-c; c^"-cpc,、 pET30-s『cpc力和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng) 基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODeoo為0.5至0.8，加入異丙基硫代-f3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小 時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離 心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6a, sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，#. Ja/w'/70s^ sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿/)ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，必7a/M'"o^^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254，可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱S3)和 ^a&e朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-sa~c/ M，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親 和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將^M力ae/ a sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpW和c/ c,克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/ cf-cpcF，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶^^/cpc尸，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和； c州)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI和PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因③"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的^coR I和化t I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afeo I和尸"I之間，裂合酶基因cpcF在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和i7 oI之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力o 和pcW)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Afco I和 戶"I之間，/ cy力在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在AWeI和J力ol之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。c/ c力和pACYCDuet-Z o7-; 《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腦ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Nr親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例6(1) 從GeneBank中可以査到，藻種sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Ja/M'/JOS"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力朋tee/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，i/. h/z i/70S〃ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱和 力朋&e朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-sa"C/ c力，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親 和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將J/. ^yw'/70s^sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因和c/ c尸 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c; cf-c/ cF，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶0^《cpc尸，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc州)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫口八[￥〔01161-/ 07-;^//}，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的^boR I和I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因c/ c^在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Wco I和尸"I之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和/力o1之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力o7 和/7cy力)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Afco I和 At I之間，pc;^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在We I和J力o I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-c/ cf-cpc尺pCOLADuet-^-cpd和pACYCDuet-力o7-pc州轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過^2+親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例7(1) 從GeneBank中可以查到，藻種A atee/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Ja/w770s"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^/7a/ ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，i/. ^肌'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和 必7a/w'/70幼s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-sa~cpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉 親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將」朋6朋朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ c^"和cpcF克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-cpcF，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Q;ci5/Q^A得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc/J)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pcj^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-l中是在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)的I和尸"I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因在pETDuet中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是I和尸"I之間，裂合酶基因c/ c,在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力W 和pcW)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在；Vco I和 At I之間，/ c州在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Ato I和J力o I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-c/ cf-c; c尸、pCOLADuet-sa^c; "和pACYCDuet_/w7-pc/力轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。實(shí)施例8(1)從GeneBank中可以查到，藻種七a力ae/7a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7柳i/70卯s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。如a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，必^yw'/Kw"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱和 必7a啦'/70^;ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-stc/ cA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉 親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將M Zg歷j'/70s"ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和cpc, 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-c/ c尸，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶a ^/"c,，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pcj^)克隆于Novagen公司購買的 pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-/ c/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA。即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因^M拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的^coR I和I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是I和尸W I之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是feoRV和化ol之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(力W 和pc/力)，它們在同一個(gè)載體pACYCDuet-1中，力o7處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Afco I和 尸stl之間，pcj^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在A^el和J力ol之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pETDuet-，f-cpc,、 pC0LADuet-s";x^和pACYCDuet-/ a -p一轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例9(1)從GeneBank中可以查到，藻種/l朋te朋s sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，M〗a/w'/70s〃s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。/)朋/^e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019，尨Ja啦'/70s^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱和力朋tee朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-stcpc力，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻藍(lán) 蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔 基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將^朋fee朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c; c尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-c/ cf，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶0 c^/cpcF，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01 。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pcW，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即脫輔基蛋白基因cpd在pET30中是在5boRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因sa在yrp"I和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是vVcoI和P"I之間，裂合酶基因cpc,在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是^boRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hoi和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pETDuet-c; t^-cpc尸、pET30-sa~c/ c/I和pACYCDuet-ho1、 pETDuet-pcyA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-卩-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種勘s6a, sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必J柳i/ os"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。如a力ae/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，i/. Ja/w'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和 力"3力s朋a sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s『cpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻藍(lán) 蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔 基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將M J柳i/ os"ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-c/ c尸，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Q ^/cpcF，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。
即脫輔基蛋白基因在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親
和素基因sa在A>/7l和《WII兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于
第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afco I和尸"I之間，裂合酶基因c/ c,在pETDuet中，處
于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是&oRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hol和
pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在
pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-cpcf-cpc尸、pET30-和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代_(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩 表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M Ja肌7 oms sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。力/ a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019,必Ja/z i"om5 sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和 必Ja肌'朋siAssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-srcpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻 藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫 輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。
(2) 將^7a6se朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c;x^和c/ c,克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpc^-cpc尸，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Q^f/c;x^，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pc;v!，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。
即脫輔基蛋白基因在pET30中是在化oRV和I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因sa在f/wl和5Wn兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是/^oI和尸"I之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是&oRV和i7wl之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hol和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-c/ cf-c/ c尸、pET30-sa"Cpc/f和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA轉(zhuǎn)入 大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D咖為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-p-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2CTC至37。C振蕩 表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán) 蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N:T親和 層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例12
(1)從GeneBank中可以查到，藻種力朋6朋朋sp.PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成，
M 7湖u'"as"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿&e朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)
為BA000019，必7a邁i/7oms sp, PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254，
可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和
必h/w'/70犯s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen
公司購買的pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-s『c/^/f，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻
藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將M Zg/7 i/ws"ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c/ c尸 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/ cf-cpcf，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶0 ci5/c;x^，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o/克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)HOl。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pc州克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。
即脫輔基蛋白基因cpd在pET30中是在fcoRV和/力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，鏈霉親 和素基因幼在和5^n兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因c; cf在pETDuet中，處于 第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afco I和尸W I之間，裂合酶基因cpc尸在pETDuet中，處 于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和//wl之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hol和 pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在 pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-cpc￡-c; c尺pET30-sa"C/ d和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH7.0
的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代_(3-D-半乳糖苷
(is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩
表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)
蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例13
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力細(xì)sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 尨Zg則'/705"s sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿tee朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019,vK 7a/w'/ os"ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254, 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱和
sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pC0LADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-sfcpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親 和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。
(2) 將勘a力ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ cf和cpcF克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/ cf-cpC在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Ox^/cpcF，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。
(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。
將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pc^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-; cj^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。
即鏈霉親和素基因^和脫輔基蛋白基因cp"拼接后的片段在pCOLADuet-l中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的I和尸W I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因c/jW在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afc0 I和尸"I之間，裂合酶基因cpcF在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和i7 oI之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分
別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，
把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-c/^-c/ c,、 pC0LADuet-,cpc力和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振 蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過NP 親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋 白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例14(1) 從GeneBank中可以査到，藻種^7a力ae朋sp, PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?？盿力ae朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，必Jaw'/ o^^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所查到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱sa)和 ^ja6ae朋sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen公 司購買的pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-sa^cpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親 和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將Uawj'y owssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c; cf和c; c尸 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-cpcf-cpc尸，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶CpC￡/c/x^，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力W克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達(dá)H01。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcy/l克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因卬M拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的￡boR I和尸"I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Afco I和At I之間，裂合酶基因c; cA在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和///ol之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet—cpcf-cpc尺pCOLADuet-sa~cpc^和pACYCDuet-hoi、 pETDuet-pcyA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖 苷(is叩rophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過^2+ 親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋 白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例15(1)從GeneBank中可以查到，藻種如Wae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M 7a/wV7osiAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定?！古髏ee/7a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，M ^/w'/7owssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱幼)和 髮h/w'/7o幼ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-sa-cpcA在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893,通過全基因合成得到。(2) 將^7aZw朋a sp. PCC7120中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因cpcf和c; c尸克 隆于Novagen公司購買的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-c/ cf-cpc,，在大腸桿菌中 能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶07^/^c尸，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o 克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 pcjv/克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-/ c^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因"d拼接后的片段在pCOLADuet-1中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的I和尸"I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpcf在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是餘o I和At I之間，裂合酶基因c/^F在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和J力ol之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分 別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段， 把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將pETDuet-cpc￡-c/)c,、 pC0LADuet-sa~cpc^和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l,ol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過NP親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例16(1) 從GeneBank中可以查到，藻種細(xì)6細(xì)a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， 必Ja/w'/70SiAS sp. PCC7603部分序列已經(jīng)測定。^ a6ae/ a sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào) 為BA000019，M 7a歷/y o^sYA sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254， 可從所査到序列中找到所需基因；通過基因工程方法，將鏈霉親和素基因(簡稱M)和 M 7a/w'"o^ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于Novagen 公司購買的pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-stc; c力，在大腸桿菌中能表達(dá)鏈霉 親和素和藻藍(lán)蛋白alpha亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白 alpha亞基脫輔基蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模 板，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相 應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過全基因合成得到。(2) 將尨7a啦'77omssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶基因c/ cf和c/ cF 克隆于Novagen公司購買的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-wc￡-cpc尸，在大腸桿菌 中能表達(dá)藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶Qx^/"c尸，得到藻藍(lán)蛋白alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì) 粒。(3) 將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 力o7克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)H01。將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因之一 克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì) 粒叫pCDFDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cp"拼接后的片段在pC0LADuet-1中是在第 一個(gè)多克隆位點(diǎn)的fcoR I和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因cpc^在pETDuet中， 處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是/feo I和尸"I之間，裂合酶基因"cF在pETDuet中， 處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是fcoRV和/力oI之間；PCB合成酶基因是2個(gè)(hoi 和pcyA)， hoi在pACYCDuet-1中，處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA 在pETDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間。基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體 用同樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致1: 1 混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌， 利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將pETDuet-c/ C-，、pCOLADueHcpd和pACYCDuet-hol、 pETDuet-pcyA 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于 pH7.0的LB培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代_(3-D-半乳糖 苷(isoprophyl thiof D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振 蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋白A;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni" 親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻藍(lán)蛋 白A。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的alpha亞基裂合酶、藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫 輔基蛋白和PCB生物合成酶基因或其同源基因以及鏈霉親和素基因及其同源基因來制備 鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開的問題， 本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍(lán)藻勘a6ae朋sp. PCC7120和已公開部分序列 的藍(lán)藻Mh肌'/70s"ssp. PCC7603為例對(duì)本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根 據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1.一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)的方法，其特征在于包括下述步驟(1)采用基因工程方法，將alpha亞基裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到alpha亞基裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法將鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法將PCB生物合成酶基因ho1和pcyA或其同源基因同時(shí)克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中或分別克隆于第三、第四個(gè)表達(dá)載體中，得到PCB合成質(zhì)粒。(4)將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、PCB生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的宿主菌為大腸桿菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的alpha亞基裂合酶基因是指與 力朋6ae/7a sp. PCC7120中c/7cf和cpcF基因或M sp. PCC7603中c; cf和c; c尸 基因同源的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基 蛋白基因是指與A a6ae/ a sp. PCC7120或?qū)碕柳i/ os^ sp. PCC7603中cpd同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)的方法，通過應(yīng)用藻膽蛋白alpha亞基裂合酶催化藻藍(lán)膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類alpha亞基熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白alpha亞基類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于生物學(xué)和醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101407806SQ20071003077
公開日2009年4月15日 申請(qǐng)日期2007年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月9日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開弘 申請(qǐng)人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)