專利名稱：用酯酶活性來檢測無乳鏈球菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測和鑒定無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的領域。更具體地，本發(fā)明涉及使用酯酶底物，任選與至少一種α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纖維二糖糖苷酶底物或N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物相組合地，用于檢測和鑒定無乳鏈球菌的用途。
鏈球菌屬(Streptococcus)包括在自然界中、在人和動物的皮膚和粘膜上十分普遍的許多物種，并且是造成復性感染的原因。它們是普遍存在的細菌，其在外界環(huán)境(土壤、空氣、水)中以游離狀態(tài)存在，在人和動物中以腐生狀態(tài)或共生狀態(tài)存在。對于A、C、G和H群鏈球菌和唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)，它們位于鼻咽內(nèi)，D群糞鏈球菌位于腸內(nèi)，以及B群鏈球菌位于陰道腔內(nèi)。它們的致病作用十分不同，并且取決于所牽涉的菌種和它們在生物體中的位置。
鏈球菌是革蘭氏陽性球菌，直徑0.5-1μm，表現(xiàn)為聚集成小鏈的形式，并且是靜止的。它們?yōu)檫^氧化氫酶陰性，具有發(fā)酵代謝，它們?nèi)芜x為厭氧性的并且對溫度(最佳生長溫度為37℃)變化和pH(最佳pH為7)變化敏感。
無乳鏈球菌(或鏈球菌B)被認為在?？苿游镏惺且鹑橄傺椎闹饕獋魅緞┲?。在人中，它基本上是女性生殖道(陰道)的腐生物，但是其也存在于鼻咽中和腸中，特別是存在于直腸中。在成人中，菌株建群(colonisation)常常保持無癥狀，但是無乳鏈球菌可以是引起敗血病、肺炎、腦膜炎、關節(jié)炎、尿路感染和深度化膿的原因。在孕婦或分娩后的婦女中，感染可以導致子宮內(nèi)膜炎和不育。
在新生兒中，污染發(fā)生在子宮內(nèi)或更普遍地是發(fā)生在分娩時，這是由于吸入羊水或陰道分泌物。早期感染常常在從分娩后就發(fā)生或在生活的最初幾小時內(nèi)發(fā)生。早產(chǎn)、膜破裂和母親陰道內(nèi)強的菌株建群促進早期感染。這種類型的感染的死亡率十分高(＞50％)。晚期感染通常表現(xiàn)為腦膜炎(嬰兒腦膜炎)和關節(jié)炎。
特別是由于其患病率(在法國為10％，即至少75000位孕婦/年)以及由于其在足月分娩時引起的后果，這已成為公眾健康問題，因而建議在妊娠期結束時進行關于攜帶無乳鏈球菌的系統(tǒng)篩選，理想地是在閉經(jīng)的34和38周(妊娠的35-37周)之間進行。
選擇性培養(yǎng)基和/或使得能夠指導診斷的培養(yǎng)基可商業(yè)獲得。然而，這些培養(yǎng)基具有缺點，即它們本身不足以用于診斷無乳鏈球菌并且必需進行補充的測試，例如證明存在蘭斯菲爾德氏的B群抗原(主要存在鼠李糖的多糖)，和馬尿酸的水解(馬尿酸液體培養(yǎng)基)。
最常使用的選擇性培養(yǎng)基是Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基，其為用于在孕婦中搜尋B群鏈球菌的富集液體培養(yǎng)基。這種液體培養(yǎng)基含有抑制伴生菌叢中的大多數(shù)革蘭氏陰性微生物的不同抗生素，例如萘啶酸(acide nalixidique)和慶大霉素，或萘啶酸、多粘菌素和結晶紫。
在富集步驟之后，必須將所述補充了抗生素的Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基移種至用于搜尋鏈球菌的培養(yǎng)基上(參見CDC(Center forDisease Control)的建議，MMWR(Morbidity and Mortality WeeklyReport)，August 16，2002，Vol.51，No.RR-11)。
Lim培養(yǎng)基是Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基的變體，它含有1％的酵母提取物、萘啶酸和粘菌素。
也可以使用含有5％血液的Columbia瓊脂，其使得能夠特別是證明無乳鏈球菌的β-溶血特性。然而，這種特性不總是明顯的菌落周圍的溶血環(huán)可能是窄的，更確切地這是α-溶血，或甚至是γ-溶血的表象。相反地，如果在無乳鏈球菌菌落附近存在金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌落，那么該特性就會變得清楚(Camp-Factor)。
這些選擇性培養(yǎng)基的缺點是它們必須補充進行生物化學測試和/或免疫學測試。
目前，唯一可商業(yè)獲得的、隨時可用的、使得能夠直接從直腸-陰道取樣物分離和鑒定無乳鏈球菌的選擇性培養(yǎng)基是Granada培養(yǎng)基(Biolys SA)。這種培養(yǎng)基具有促進由無乳鏈球菌菌株產(chǎn)生類胡蘿卜素色素的特性，該色素的產(chǎn)生是由于在該培養(yǎng)基中存在可溶性淀粉、蛋白胨No.3、葡萄糖、丙酮酸鈉、硫酸鎂、甲氨蝶呤、粘菌素、結晶紫、瓊脂、馬血清、無水Na2HPO4、甲硝唑、MOPS(嗎啉代丙烷磺酸)半-鈉鹽和蒸餾水并且在厭氧條件下孵育。因而，這種培養(yǎng)基具有這樣的缺點，即直接檢測無乳鏈球菌是在厭氧條件下進行的，這不易于實施。而且，不可獲得含有一種或多種酶促底物的檢測培養(yǎng)基。
完全出乎意料，本申請人現(xiàn)已證實，有可能利用酶促底物，特別是酯酶酶促底物，來特異性檢測和鑒定無乳鏈球菌。
這是因為，令人驚奇地，本申請人已經(jīng)證明，在以相關的方式最常遇到的最近的細菌物種中，僅無乳鏈球菌在早期(至少孵育后18小時)不能利用酯酶的酶促底物，這樣它們是唯一不能在早期通過酯酶底物來揭示的，例如在早期在培養(yǎng)基中的菌落沒有改變，例如當用生色性酯酶底物時培養(yǎng)基中菌落的著色沒有改變，而在反應培養(yǎng)基中著色沒有擴散因而保持集中在菌落處，但是這些分子對這些細菌的生長沒有任何有害的影響。
因此，這種酶促底物具有額外的優(yōu)點，即可以較早地以具有十分好的對照的方式讀取結果，特別是在孵育大約18-20小時的時候。
因而，本發(fā)明的主題是用于特異性檢測和鑒定無乳鏈球菌的方法，其特征在于，使用含有至少一種酯酶酶促底物的反應培養(yǎng)基。
適于本發(fā)明目的的酯酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目錄，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作為酯酶底物的實例，可提及的是吲哚酚辛酸酯、吲哚酚壬酸酯或吲哚酚癸酸酯的衍生物，優(yōu)選吲哚酚辛酸酯衍生物，更優(yōu)選它們的鹵代衍生物，更優(yōu)選氯代或溴代衍生物，例如可特別早地進行讀取的5-溴-6-氯-3-吲哚酚辛酸酯和5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯。
因為在24小時的孵育后觀察到輕微的酯酶活性(在0-4的標度上，活性低于0.6)，無乳鏈球菌的檢測可以通過加入至少一種其他酶促底物來改善。由于無乳鏈球菌不利用酯酶底物或很少利用酯酶底物的特殊性質(zhì)，因而不能區(qū)分其他酶促底物是否被無乳鏈球菌和其他菌種利用。而且，由于無乳鏈球菌僅十分少地利用酯酶底物，從而這僅稍微改變獲得的菌落的外觀，我們將只在隨后的內(nèi)容中表明無乳鏈球菌不能利用酯酶底物。
因而，根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明方法使用還含有不同于酯酶底物的其他酶促底物的反應培養(yǎng)基。
適于本發(fā)明目的的除了酯酶底物之外的酶促底物(非酯酶底物)是任意底物，即菌株對所述底物的利用使菌落產(chǎn)生與當使用所述酯酶底物時所獲得的外觀不同的外觀。這種不同的外觀例如是不同的著色。此外，這種非酯酶底物是這樣的底物，即當菌株同時利用這種非酯酶底物和所述酯酶底物(不同于無乳鏈球菌的菌株)時，所獲得的菌落的外觀(例如它們的顯著色)也不同于無乳鏈球菌菌落的外觀。這是因為，當在反應培養(yǎng)基中同時組合酯酶底物和可由無乳鏈球菌菌株利用的非酯酶底物時，所述的無乳鏈球菌菌株則對所述酯酶是陰性的而對所述非酯酶底物是陽性的(它們可以標記為-/+，該式的第一部分相應于所述酯酶底物，而第二部分相應于所述非酯酶底物)，而其他菌株或者僅能利用所述酯酶底物(它們?yōu)?/-)，或者能同時利用所述酯酶底物和所述非酯酶底物(它們?yōu)?/+)。類似地，當在反應培養(yǎng)基中同時組合酯酶底物和不能被無乳鏈球菌菌株利用的非酯酶底物時，則無乳鏈球菌菌株對所述酯酶是陰性的并對所述非酯酶底物是陰性的(它們?yōu)?/-)，而其他菌株或者僅能利用所述酯酶底物(它們?yōu)?/-)，或者能同時利用所述酯酶底物和所述非酯酶底物(它們?yōu)?/+)?？偠灾?，無乳鏈球菌菌株總是-/+或-/-，而其他菌種總是+/-或+/+。
因而，例如，如果將生色的酯酶底物(當所考慮的菌落利用所述底物時，該酯酶底物引起所述菌落呈藍色著色)與另一生色的酶促底物(當所考慮的菌落利用所述底物時，該酶促底物引起所述菌落呈粉紅色著色)相組合，則可以獲得四種類型的著色或者粉紅色，或者無色至輕微藍色，或者藍色，或者紫色(粉紅色+藍色)。粉紅色著色和無色至輕微藍色外觀僅代表無乳鏈球菌或者菌株能利用所述非酯酶底物從而菌落變成粉紅色(-/+菌株)，或者其不能利用所述非酯酶底物從而菌落保持無色或變成輕微藍色(-/-菌株)。藍色和紫色著色代表其他菌種或者所述菌株僅能利用所述酯酶底物從而其變成藍色(+/-菌株)，或者所述菌株能同時利用所述酯酶底物和所述其他酶促底物從而其變成粉紅色加藍色，即紫色(+/+菌株)。
類似地，如果將吸收熒光的酯酶底物(當所考慮的菌落利用所述底物時，該酯酶底物導致熒光猝滅)與另一發(fā)熒光的酶促底物(當所考慮的菌落利用所述底物時，該酶促底物在所述菌落處引起熒光)相組合(后一種底物被無乳鏈球菌利用)，則可以獲得兩種類型的菌落或者有熒光的菌落，或者有弱熒光至無熒光的菌落。有熒光的菌落僅代表無乳鏈球菌，因為這種菌種僅能利用除了酯酶底物之外的酶促底物。有弱熒光至無熒光的菌落代表其他菌種或者所述菌株能利用所述酯酶底物從而其無熒光，或者所述菌株能同時利用所述酯酶底物和所述其他酶促底物從而其有弱熒光至無熒光。
適于本發(fā)明目的的除了酯酶底物之外的這樣的底物的實例包括α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纖維二糖糖苷酶底物、N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物。
因而，根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的方法使用這樣的反應培養(yǎng)基作為反應培養(yǎng)基，即所述反應培養(yǎng)基除了酯酶底物外還含有至少一種選自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纖維二糖糖苷酶底物、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物。
含有或由酯酶底物和至少一種選自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物和β-纖維二糖糖苷酶底物的酶促底物組成的反應培養(yǎng)基是新的，并且構成了本發(fā)明的另一主題。
適于本發(fā)明目的的α-葡糖苷酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目錄，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作為α-葡糖苷酶底物的實例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于傘形酮衍生物的底物和基于萘酚衍生物的底物。
優(yōu)選地，適于本發(fā)明目的的α-葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
這樣的吲哚酚衍生物的實例包括3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的衍生物，優(yōu)選這些化合物的鹵代衍生物。作為3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷的鹵代衍生物的實例，可提及6-溴-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-α-D-吡喃葡糖苷和6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷，最后一個化合物是特別優(yōu)選的。
適于本發(fā)明目的的磷酸酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates andReagents或www.biosynth.com中。
作為磷酸酶底物的實例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于傘形酮衍生物的底物和基于硝基苯(nitrophényle)的底物。
優(yōu)選地，適于本發(fā)明目的的磷酸酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
這樣的吲哚酚衍生物的實例包括3-吲哚基-磷酸酯的衍生物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯、5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸酯和6-氯-3-吲哚基-磷酸酯，最后一個化合物是特別優(yōu)選的。
適于本發(fā)明目的的β-纖維二糖糖苷酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates and Reagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目錄，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作為β-纖維二糖糖苷酶底物的實例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于傘形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。
優(yōu)選地，適于本發(fā)明目的的β-纖維二糖糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
這樣的吲哚酚衍生物的實例包括3-吲哚基-β-D-纖維二糖糖苷的衍生物，例如6-氯-3-吲哚基-β-D-纖維二糖糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-纖維二糖糖苷，最后一個化合物是特別優(yōu)選的。
適于本發(fā)明目的的N-乙?；?氨基葡糖苷酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates and Reagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目錄，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作為N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物的實例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于傘形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。
優(yōu)選地，適于本發(fā)明目的的N-乙?；?氨基葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
這樣的吲哚酚衍生物的實例包括3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷的衍生物，例如5-溴-6-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-N-乙?；?氨基葡糖苷，最后一個化合物是特別優(yōu)選的。
適于本發(fā)明目的的β-葡糖苷酶酶促底物是使得能夠證明這樣的酶促活性的本領域技術人員已知的任何底物。這樣的底物可以例如為生色的或產(chǎn)生熒光的，并例如描述于BIOSYNTH的目錄，Substrates andReagents或www.biosynth.com中，或描述于GLYCOSYNTH的目錄，enzyme substrates catalogue或www.glycosynth.co.uk中。
作為β-葡糖苷酶底物的實例，可以提及基于吲哚酚衍生物的底物、基于傘形酮衍生物的底物和基于硝基苯的底物。
優(yōu)選地，適于本發(fā)明目的的β-葡糖苷酶酶促底物是基于吲哚酚衍生物的底物。
這樣的吲哚酚衍生物的實例包括3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷的衍生物，例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-D-吡喃葡糖苷。
根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的方法使用包含以下底物的反應培養(yǎng)基i)酯酶底物，和ii)磷酸酶底物或α-葡糖苷酶底物，優(yōu)選酯酶底物/磷酸酶底物的組合。
根據(jù)另一實施方案，除了酯酶底物和磷酸酶或α-葡糖苷酶底物之外，所述反應培養(yǎng)基還包含選自β-纖維二糖糖苷酶底物、N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物，優(yōu)選β-纖維二糖糖苷酶底物和N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物。
在本發(fā)明方法中使用的反應培養(yǎng)基由于存在所述的酶促底物因而是檢測反應培養(yǎng)基。
這種反應培養(yǎng)基或者可以僅用作揭示培養(yǎng)基，或者可以用作培養(yǎng)和揭示培養(yǎng)基。在第一種情況下，微生物的培養(yǎng)在接種前進行，在第二種情況下，所述的反應培養(yǎng)基還構成了培養(yǎng)培養(yǎng)基。
所述的反應培養(yǎng)基可以是固體、半固體或液體。術語“固體或半固體培養(yǎng)基”意在表示，例如膠化的培養(yǎng)基。
瓊脂是微生物學中用于培養(yǎng)微生物的常規(guī)固體培養(yǎng)基，但是也可以使用明膠或瓊脂糖。有一些制劑可商業(yè)獲得，例如Columbia瓊脂、Trypcase-soja瓊脂、Mac Conkey瓊脂、Sabouraud瓊脂，或更一般地，在Handbook of Microbiological Media(CRC出版社)中描述的那些。
反應培養(yǎng)基中瓊脂的量是2-40g/l。對于固體培養(yǎng)基，瓊脂的量優(yōu)選為9-25g/l，更優(yōu)選12-14g/l。對于半固體培養(yǎng)基，瓊脂的量優(yōu)選為2-6g/l。
本發(fā)明的酶促底物可在廣的pH范圍內(nèi)使用，特別是在pH5.5至10。
在所述反應培養(yǎng)基中酶促底物的濃度為10至2000mg/l，優(yōu)選為50至500mg/l，更優(yōu)選為80至400mg/l，這構成了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
當然，根據(jù)選取的底物，本領域技術人員將在該范圍內(nèi)確定培養(yǎng)基中酶促底物的濃度。因而，在所使用的酯酶底物是5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸酯的情況下，優(yōu)選采用100至400mg/l的濃度。
可用于本發(fā)明目的的反應培養(yǎng)基還可以包含用于改善本發(fā)明方法的特異性和靈敏度的其他成分。
因而，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述的反應培養(yǎng)基包含磷酸鹽溶液，例如Na2HPO4和K2HPO4溶液。
這是因為，這樣的磷酸鹽溶液的使用使得能夠明顯地提高所述培養(yǎng)基的可讀性，所述可讀性或者反映為著色清晰度的增度，或者反映為在18小時時磷酸酶活性的表達和/或檢測增加。
對于每種溶液，這樣的磷酸鹽溶液的濃度為0.3至1.5g/l，優(yōu)選0.5g/l的濃度。
所述反應培養(yǎng)基還可以含有用于抑制或限制不希望的菌株(例如假陽性菌株，如假絲酵母(Candida)或腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus))生長的抑制劑的混合物，而不改變所述培養(yǎng)基的檢測靈敏度。
在這方面，所述反應混合物可以含有抗生素的混合物。將抗生素加入至反應培養(yǎng)基中尤其使得能夠贏得時間，因為無乳鏈球菌的鑒定是直接進行的。
適于本發(fā)明目的的抗生素的實例包括氨曲南和兩性霉素B。這些抗生素可從ICN、Squibb或Sigma商業(yè)獲得。
在所述反應培養(yǎng)基中的每種抗生素的量根據(jù)所涉及的抗生素而不同，并很容易由本領域技術人員確定。
所述反應培養(yǎng)基還可以包含組合的一種或多種要素，例如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、礦物質(zhì)、維生素、表面活性劑、緩沖劑、磷酸鹽、銨鹽、鈉鹽、金屬鹽。培養(yǎng)基的實例描述于本申請人的專利申請EP 656421和WO99/09207中。
本發(fā)明方法的實施可以根據(jù)以下步驟來進行a)用全部或部分樣品接種如上所定義的反應培養(yǎng)基，b)孵育所述接種過的培養(yǎng)基，c)揭示單獨存在至少一種酯酶活性，或者與至少一種不同于酯酶活性的其他酶促活性相組合地存在至少一種酯酶活性，這構成了本發(fā)明的另一主題。
所述的接種和孵育步驟是本領域技術人員所周知的。
例如，孵育溫度可以是37℃。關于孵育氣氛，優(yōu)選為有氧環(huán)境。
所述的揭示過程是通過顯現(xiàn)著色的變化并用肉眼觀察來進行的，所述的著色在反應培養(yǎng)基中沒有擴散并因而集中在菌落處。在揭示熒光的情況下，使用本領域技術人員已知的熒光讀取設備。
待分析的生物樣品是可能含有無乳鏈球菌的任何臨床樣品，例如陰道取樣物、尿取樣物或對其進行分析可以幫助臨床醫(yī)生作出診斷的任何其他樣品。
借助于下述實施例可以更清楚地理解本發(fā)明，所述的實施例是以舉例說明而非限制性的方式給出的。
實施例1使用酯酶的酶促底物來檢測無乳鏈球菌1.1反應培養(yǎng)基的制備反應培養(yǎng)基通過混合心-腦提取物(4.84g/l；Solabia)、肉浸液(1.96g/l；Solabia)、biothione(1g/l；Solabia)、biotrypcase(7.2g/l；Solabia)、碳酸鈉(0.3g/l；VWR)、丙酮酸鈉(2g/l；Fluka)、HEPES緩沖劑(0.4g/l；Sigma)、乳清蛋白蛋白胨(2g/l；DMV)、葡萄糖(1g/l；Merck)、美洲瓊脂(2g/l；Sobigel)和歐洲瓊脂(12g/l；Roko)而制備。
在121℃下高壓滅菌15分鐘后，以0.3g/l的比率加入如下所示的酯酶酶促底物；然后在50℃的水浴中冷卻·5-溴-4-氯-3-吲哚基辛酸酯(X-C8；Inalco)，當使用它時產(chǎn)生青綠色著色，和·5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯(Magenta-C8；Inalco)，當使用它時產(chǎn)生粉紅色-紅色著色。
然后將所述培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)皿中以用于后面用細菌菌株進行接種。
1.2微生物菌株的接種將懸浮于生理鹽水中的三株無乳鏈球菌菌株和三株其他細菌菌株進行接種以便在每個培養(yǎng)基上產(chǎn)生分離的菌落，所有菌株均源自本申請人的保藏。然后將所述培養(yǎng)皿在37℃下孵育48小時。在孵育18、24和多于40小時后肉眼檢查形成的菌落。記錄這些菌落的著色、生長以及該著色的強度(代表了酯酶活性)。
1.3結果結果在下表1中給出，并如此表示-生長(C)，用mm標明大小，-顏色(Co)，T＝青綠色，R＝粉紅色或紅色，-著色的強度(I)，基于0-4的任意標度，0相應于沒有活性和4相應于存在十分強的著色，-根據(jù)以小時表示的孵育時間(T)。
表1
結果證明，可利用酯酶酶促底物來較早地檢測鏈球菌B，因為在18-24小時它們表現(xiàn)出無活性至具有十分弱的活性。
實施例2用酯酶底物和α-葡糖苷酶或磷酸酶底物檢測無乳鏈球菌重復上面在實施例1中描述的操作方案，除了在加入0.3g/l酯酶底物X-C8的同時，加入0.3g/l的6-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃葡糖苷(Rose-α-Glu)或0.3g/l的6-氯-3-吲哚基磷酸酯(Rose-P)，當使用它們時產(chǎn)生粉紅色著色。
結果在下面表2中給出，該表中如同實施例1中一樣，給出了生長、著色和強度，其中R＝粉紅色/紅色，RM＝粉紅色-栗色，T＝青綠色，V＝綠色，Vi＝紫色，B＝藍色，GVi＝灰色-紫色，以及GB＝灰色-藍色。
表2
該表證明，當將生色性酯酶底物與可被無乳鏈球菌菌株利用的不同于酯酶底物的其他生色酶促底物組合使用時，改善了無乳鏈球菌菌株的檢測。
實施例3用酯酶底物、磷酸酶底物和β-纖維二糖糖苷酶底物檢測無乳鏈球菌重復在實施例2中描述的操作方案，使用0.3g/l的X-C8和0.2g/l的Rose-P，除了在高壓滅菌前，在加入其他底物的同時還加入0.08g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-纖維二糖糖苷(Cellobio)，以及加入0.5g/l Na2HPO4和0.5g/l K2HPO4之外。
作為對照培養(yǎng)基，使用了僅有X-C8和Rose-P的培養(yǎng)基。
結果在下面表3中給出，該表中如同實施例1中一樣，給出了生長、著色和強度，其中R＝粉紅色/紅色，Ma＝淡紫色，Vi＝紫色，B＝藍色，GB＝灰色-藍色，以及V1＝紫紅色。
表3
表3中的所獲得的結果證明，當使用三種酶促底物(其中包括酯酶底物)時，改善了相對于其他菌株的無乳鏈球菌的檢測特異性。
實施例4用酯酶底物、磷酸酶底物和N-乙酰基-氨基葡糖苷酶底物檢測無乳鏈球菌重復在實施例3中描述的操作方案，除了用0.4g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-N-乙酰基-氨基葡糖苷(X-NAGlu)代替Cellobio之外。
對照培養(yǎng)基與所述測試培養(yǎng)基相同，除了其不含有X-NAGlu外。
結果在下面表4中給出，該表中如同實施例1中一樣，給出了生長、著色和強度，其中R＝粉紅色/紅色，B＝藍色，GR＝灰色-粉紅色，以及Mg＝品紅色。
表4
該表中的結果證明，當使用三種酶促底物(其中包括酯酶底物)時，改善了相對于其他菌株的無乳鏈球菌的檢測特異性。
實施例5用酯酶底物、磷酸酶底物和β-葡糖苷酶底物檢測無乳鏈球菌重復在實施例4中描述的操作方案，除了用0.08g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷(X-β-Glu)和0.3g/l的5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-β-D-吡喃葡糖苷(GreenA-β-Glu)代替X-NAGlu之外。
對照培養(yǎng)基與所述測試培養(yǎng)基相同，除了其既不含有X-β-Glu也不含有GreenA-β-Glu之外。
結果在下面表5中給出，該表中如同實施例1中一樣，給出了生長、著色和強度，其中R＝粉紅色/紅色，Ma＝淡紫色，Vi＝紫色，B＝藍色，以及GB＝灰色-藍色。
表5
表5中的所獲得的結果證明，當使用三種酶促底物(其中包括酯酶底物)時，改善了相對于其他菌株的無乳鏈球菌的檢測特異性。
實施例6通過加入磷酸鹽溶液來提高檢測靈敏度重復在實施例1中描述的操作方案，除了在加入0.3g/l的酯酶底物X-C8的同時加入0.3g/l的Rose-P，以及加入0.5g/l Na2HPO4和0.5g/l K2HPO4之外。
作為對照培養(yǎng)基，使用相同的培養(yǎng)基，但是沒有磷酸鹽溶液。
結果在下面表6中給出，該表中如同實施例1中一樣，給出了生長、著色和強度，其中R＝粉紅色，以及Mg＝品紅色。
表6
在該表6中的結果證明，或者改善了無乳鏈球菌菌株的自18小時起的著色清晰度，或者增加了無乳鏈球菌菌株的表達。
實施例7用根據(jù)本發(fā)明的含有酯酶底物的培養(yǎng)基和商業(yè)可獲得的培養(yǎng)基來進行無乳鏈球菌的檢測靈敏度和特異性的比較對于該關于靈敏度和特異性的研究，使用了如實施例1中所述制備的根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基，其含有0.3g/l的X-C8，以及0.2g/l的Rose-P、0.08g/l的Cellobio、0.5g/l的Na2HPO4、0.5g/l的K2HPO4、0.012g/l的氨曲南和0.004g/l的兩性霉素B。
作為對比培養(yǎng)基，使用Granada培養(yǎng)基(ref 10077，BIOLYS，F(xiàn)rance)。
接種69株微生物，其中包括14株無乳鏈球菌，并且讓其在37℃下孵育直至24小時并在超過這個時間后讓其處于環(huán)境溫度下。如上所述對菌落進行顯色。根據(jù)供應商(bioMérieux，F(xiàn)rance)的建議使用Slidex Strepto Kit通過凝集試驗對具有鏈球菌B的特征的可疑菌落(即顯現(xiàn)出粉紅色/紅色的菌落)進行確認。非特征性的菌落(即不顯現(xiàn)粉紅色的菌落)或者具有特征性著色但是在凝集試驗中產(chǎn)生陰性反應的菌落(假陽性菌株)通過Galeries ID 32 Strep(bioMérieux，F(xiàn)rance)進行鑒定。
對于靈敏度和特異性，結果表示為正確診斷相對于全部測試的％，并且在下面的表7中給出，靈敏度的％相應于在所述培養(yǎng)基上檢測的真陽性的數(shù)目除以要檢測的真陽性的總數(shù)目(*100)，特異性的％相應于在所述培養(yǎng)基上檢測的真陰性的數(shù)目除以要檢測的真陰性的總數(shù)目(*100)。
表7
在該表中所示的結果證明，使用本發(fā)明的方法檢測鏈球菌B(無乳鏈球菌)的靈敏度得到提高。而且，它們還顯示，本發(fā)明的檢測培養(yǎng)基還具有良好的特異性，所述特異性在接種所述瓊脂前進行富集之后而得到提高，其中所述的富集是由于在有或無5％CO2下于35-37℃在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中傳代18-24小時而獲得的(參見CDC(Center for Disease Control)的建議，MMWR(Morbidity andMortality Weekly Report)，August 16，2002，vol.51，No.RR-11)。
實施例8基于臨床樣品的所述培養(yǎng)基的使用對于該研究，使用根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基，其如上面在實施例7中所描述的進行制備。
在本研究中使用了總共134個來源于陰道或子宮頸內(nèi)取樣的樣品/拭子。
將每個拭子在1ml無菌生理鹽水中乳化，并將100μl這種溶液一方面放置在含有5％的馬血的Columbia瓊脂上，另一方面放置于在本發(fā)明方法中使用的培養(yǎng)基上。此外，將100μl上述溶液用于接種Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基。于37℃并在有氧條件下孵育20小時后，用所述的Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基接種所述的含血瓊脂和本發(fā)明的培養(yǎng)基，然后于37℃并在有氧條件下孵育20小時。
根據(jù)供應商(bioMérieux，F(xiàn)rance)的建議使用Slidex StreptoKit通過凝集試驗對具有鏈球菌B的特征的可疑菌落(即顯現(xiàn)出粉紅色/紅色的菌落)進行確認。
在134個樣品中，112個接種在所述的瓊脂培養(yǎng)基上，一方面直接使用在生理鹽水中的懸浮液進行接種，另一方面于在Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基中進行富集之后進行接種。其余的22個樣品僅直接使用在生理鹽水中的懸浮液而接種在所述的瓊脂培養(yǎng)基上。
結果顯示在下述表8中，所述的結果計算為靈敏度和特異性的平均百分數(shù)。
表8
以上表8中的結果顯示，用于臨床樣品的本發(fā)明培養(yǎng)基使得能夠提高無乳鏈球菌檢測的靈敏度和特異性。這是因為，在本發(fā)明培養(yǎng)基上于20份含有無乳鏈球菌的取樣物中檢測出20份，而在Columbia培養(yǎng)基上檢測出19份，并且在所述酯酶培養(yǎng)基上僅有1個唯一的假陽性結果，而在Columbia瓊脂上有24個。甚至可以說，這些結果比當用實驗室菌株測試所述培養(yǎng)基時還要好。
權利要求
1.用于特異性檢測和鑒定無乳鏈球菌的方法，其特征在于，使用含有至少一種酯酶酶促底物的反應培養(yǎng)基。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應培養(yǎng)基還含有不同于酯酶底物的可被無乳鏈球菌利用的其他酶促底物。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的其他酶促底物是至少一種選自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物、β-纖維二糖糖苷酶底物、N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述反應培養(yǎng)基含有i)酯酶底物和ii)磷酸酶底物或α-葡糖苷酶底物。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述反應培養(yǎng)基還含有選自β-纖維二糖糖苷酶底物、N-乙?；?氨基葡糖苷酶底物和β-葡糖苷酶底物的酶促底物。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，每種酶促底物的濃度為10至2000mg/l。
7.用于在可能含有無乳鏈球菌這一物種的細菌的樣品中特異性檢測和鑒定這種細菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟a)用全部或部分樣品接種如權利要求1-6中任一項中所定義的反應培養(yǎng)基，b)孵育所述接種過的培養(yǎng)基，c)揭示單獨存在至少一種酯酶活性，或者與至少一種不同于酯酶活性的其他酶促活性相組合地存在至少一種酯酶活性。
8.反應培養(yǎng)基，其特征在于，所述反應培養(yǎng)基含有酯酶底物和至少一種選自α-葡糖苷酶底物、磷酸酶底物和β-纖維二糖糖苷酶底物的酶促底物。
9.如權利要求8所述的反應培養(yǎng)基，其特征在于，所述反應培養(yǎng)基還含有磷酸鹽溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用含有至少一種酯酶酶促底物的反應培養(yǎng)基來特異性檢測和鑒定無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的方法。
文檔編號G01N33/50GK101035907SQ200580031188
公開日2007年9月12日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權日2004年9月16日
發(fā)明者L·巴爾博, D·羅比雄 申請人:拜奧默里克斯公司