從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種從乳樣中分離菌的培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]目前可用于乳品中腸球菌、鏈球菌分離鑒定的系統(tǒng)有VITEK細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和API20E細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，其原理是將用于革蘭氏陽性細(xì)菌多種生化鑒定試驗集成在標(biāo)準(zhǔn)化的載體上(如96孔板)，通過接種細(xì)菌，機(jī)器、或人工輔助機(jī)器讀取并與結(jié)果判定庫(表)進(jìn)行比對，從而將不同的細(xì)菌種類區(qū)分開來。而對需要檢測、監(jiān)測的目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行高效的初步分選，則是保證下游快速、準(zhǔn)確鑒定的基礎(chǔ)。腸球菌廣泛存在于環(huán)境、動物和人的消化道內(nèi)，隨著其自然進(jìn)化過程和抗生素的廣泛使用，有關(guān)病原性腸球菌的報道越來越多，在引起人類心內(nèi)膜炎、尿路感染、醫(yī)源性感染，以及奶牛乳房炎方面，越來越受到學(xué)界的重視。因此，如何更高效的從乳樣中分選出腸球菌、鏈球菌就顯得十分必要。
[0003]理想的分選培養(yǎng)基應(yīng)在盡可能抑制背景細(xì)菌的前提下，全面地允許目標(biāo)微生物的生長。但是，目前尚沒有一種通用的培養(yǎng)基，能夠分選乳樣中腸球菌的同時，對鏈球菌也進(jìn)行區(qū)別性的分選，且具有顯色反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供一種從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基的制備方法。
[0006]—種從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基用于同時分離腸球菌和鏈球菌，其組成如下:細(xì)菌學(xué)蛋白胨15 — 25g、酵母2 — 5g、牛心浸液或牛肉膏2 — 5g、葡萄糖I一3g、氯化鈉1.8—2.5g、磷酸氫二鈉0.3—0.5g、碳酸鈉2.0 — 3g、萘啶酮酸12 — 20mg、多粘菌素B 1.2 — 2mg、結(jié)晶紫0.1—0.3mg、七葉苷2 — 5g、檸檬酸鐵0.3—0.8g、瓊脂10—18g，菌種培養(yǎng)溫度為35— 37°C，此時絕大部分腸球菌菌落成黑色，而鏈球菌菌落呈白色。
[0007]從乳樣中分離鏈球菌的培養(yǎng)基，其組成如下:細(xì)菌學(xué)蛋白胨15 — 25g、酵母2—5g、牛心浸液或牛肉膏2—5g、葡萄糖I一3g、氯化鈉50-70g、磷酸氫二鈉0.3一0.5g、碳酸鈉2.0—38、萘啶酮酸12—2011^、多粘菌素8 1.2—2mg、結(jié)晶紫0.1—0.3mg、七葉苷2—5g、檸檬酸鐵0.3—0.8g、瓊脂10 — 18g，分選培養(yǎng)溫度為43-47°C ;優(yōu)選分選培養(yǎng)溫度為45°C。
[0008]優(yōu)選地，所述細(xì)菌學(xué)蛋白胨選自蛋白胨、月示蛋白胨或胰蛋白胨中的一種。
[0009]優(yōu)選地，所述酵母為酵母浸出物或酵母粉中的一種。
[0010]上述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟:將葡萄糖和多粘菌素需預(yù)先配制成儲存液，凍存于零下10-零下30°C條件下，隨用隨取；其余組分加水加熱攪拌溶解，加水定容至10001^，115—118°0滅菌12 — 20min，待溫度降至50—65°C時，添加多粘菌素、葡萄糖儲存液混勻，灌制平板，待溫度下降至37°C以下(至室溫)時，即可使用。
[0011]優(yōu)選地，各組分加水加熱攪拌溶解步驟，將原料煮沸l(wèi)_3min。以使各組分充分溶解、混合均勻。
[0012]奶牛乳房炎是奶牛最常見的疾病之一，多表現(xiàn)為混合感染，病原種類繁多，但其中報道和研宄最高的幾種病原為金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯氏細(xì)菌等。腸球菌作為奶牛乳房炎的病原細(xì)菌，其實早有報道，只是當(dāng)時未引起廣泛的注意，因為早期的許多酸奶、奶酪制品中的主要微生物就是腸球菌。
[0013]隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，病原微生物的診斷水平有了很大的提高，致病性腸球菌收到了越來越多的重視，主要是由于其引起人類心內(nèi)膜炎、尿路感染、醫(yī)院性感染、口腔感染和越越來越普遍的耐藥性。在對甘肅及周邊地區(qū)的奶牛乳房炎病原調(diào)查的過程中，我們發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌仍然是主流致病菌之一(45/280)，但是腸球菌的檢出率也非常之高(63/280)，(280指采集乳樣280個)，我們認(rèn)為這樣的變化不是一個偶然事件，所以才把腸球菌作為研宄中的一個重點來做。
[0014]針對乳樣中致病性腸球菌、鏈球菌陽性檢出率較高的現(xiàn)狀，我們試圖利用腸球菌、鏈球菌特有的生理、生化特性，對已報到的腸球菌、鏈球菌分選培養(yǎng)基組方進(jìn)行優(yōu)化，使分選過程更簡單、準(zhǔn)確且直觀，從而提高乳樣檢測、檢測效率。
[0015]本發(fā)明組方過程中，充分考慮到萘啶酮酸和多粘菌素組合，能夠很好地抑制跟蘭氏陰性細(xì)菌的生長，結(jié)晶紫能夠有效地抑制金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、綠膿桿菌、白念珠菌和表皮癬菌等雜菌的生長，而腸球菌和個別鏈球菌能夠分解七葉苷的特性，我們在此基礎(chǔ)上加入了檸檬酸鐵，且整個分選培養(yǎng)溫度可提高至45°C，直接分選特定的腸球菌，使整個分選過程目的性和可操作性更強(qiáng)，通過簡單的顏色反應(yīng)將絕大部分腸球菌、鏈球菌區(qū)分出來，尤其是將乳樣中，奶牛乳房炎中很常見的腸球菌和鏈球菌區(qū)分開來，從而簡化了分選過程，提高了分選效率，對以往的分選培養(yǎng)基改進(jìn)效果十分明顯。
[0016]要分離到腸球菌，就需要抑制背景細(xì)菌(雜菌)的生長，包括革蘭氏陰性(G-)和跟革蘭氏陽性(G+)細(xì)菌，在抑制背景細(xì)菌生長的同時，還要保證目標(biāo)細(xì)菌(腸球菌、鏈球菌)的正常生長。由于乳樣中主要病原種類是一定的，選用結(jié)晶紫用于抑制G+細(xì)菌的生長，選用多粘菌素和萘啶酮酸用于抑制G-細(xì)菌的生長，而目標(biāo)細(xì)菌中絕大部分的腸球菌、鏈球菌均可以在含有一定的濃度范圍的這些抑菌物質(zhì)培養(yǎng)基里良好地生長。因此，選擇結(jié)晶紫、多粘菌素和萘啶酮酸聯(lián)用，能夠有效地抑制背景細(xì)菌生長的同時，允許目標(biāo)細(xì)菌的生長。
[0017]目標(biāo)細(xì)菌中，大部分腸球菌能夠分解七葉苷產(chǎn)生七葉素，個別鏈球菌也可以分解七葉苷產(chǎn)生七葉素，大部分鏈球菌并不能夠分解七葉苷，而七葉素能夠與檸檬酸鐵中的鐵離子(Fe3+)結(jié)合形成黑色物質(zhì)，使菌落表現(xiàn)為黑色，呈現(xiàn)特定的顏色反應(yīng)，這樣腸球菌和鏈球菌就基本上得以區(qū)分開來。
[0018]又因為大部分腸球菌能夠在45°C條件下生長，而大部分鏈球菌不能再45°C條件下生長，同時其它絕大部分背景細(xì)菌也不能在45°C條件下生長，所以可以利用腸球菌的這一特點，提高培養(yǎng)溫度，正對性地達(dá)到篩選腸球菌的目的。
[0019]同時，腸球菌能夠耐受6.5%的NaCl針對性地分選腸球菌時，還可以直接將NaCl的濃度提高至6 — 7%，分離效果更好。
[0020]需要備注說明的幾點細(xì)節(jié):
1.45°C條件下腸球菌生長情況: 21 種腸球菌中，除E.dispar，E.haemoperoxidus, E.malodoratus, E.moraviensis和E.sulfureus以外的絕大部分常見的腸球菌均可以在45 °C生長[周庭銀.[M]臨床微生物診斷與譜圖.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社2007年6月，第二版]。上述5種不能再45°C條件下生長的細(xì)菌，也鮮見在乳樣中發(fā)現(xiàn)的報道。
[0021]2.鏈球菌中，既能夠分解七葉苷，又能夠在45°C生長的主要是牛鏈球菌、鳥鏈球菌和馬鏈球菌，但是除了鳥鏈球菌之外，均不能在含有6.5%的NaCl的培養(yǎng)基中生長，但是有關(guān)奶牛乳房炎和乳品污染的報道中，鮮見鳥鏈球菌出現(xiàn)。
[0022]本發(fā)明培養(yǎng)基的優(yōu)點是:整個分離過程簡單、直觀、迅速，可以從乳樣中同時分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，直接將病原種類定位到具體的種或?qū)?，大大簡化了下游分析鑒定的過程。
【具體實施方式】
[0023]以每100g培養(yǎng)基為例，對本發(fā)明培養(yǎng)基的組成作進(jìn)一步說明。本分選培養(yǎng)基所使用的原材料屬于常規(guī)微生物診斷試劑，均可以從市場上購買到。
[0024]實施例