1-同時分選乳樣中腸球菌、鏈球菌:
每100g培養(yǎng)基中含有:胰蛋白胨20g、酵母浸出物/酵母粉3g、牛心浸液/牛肉膏3g、葡萄糖2g、氯化鈉2g、磷酸氫二鈉0.4g、碳酸鈉2.5g、萘啶酮酸15mg、多粘菌素B 1.5mg、結(jié)晶紫0.2mg、七葉苷3g、檸檬酸鐵0.5g、瓊脂15g，其中葡萄糖和多粘菌素B需要預(yù)先配制，濾過除菌，分裝保存于-20°C條件下，隨取隨用；其余成分加水、加熱攪拌溶解，煮沸Imin以后，在118°C條件下滅菌20min后，待溫度下降至50°C — 65°C時，加入預(yù)配的多粘菌素混勻，灌裝在培養(yǎng)皿中，待溫度下降至37 °C以下(至室溫)時，即可使用，或無菌操作，將此選擇平板用封口膜或滅菌報紙等封閉，暫存于2— 8 °C備用。
[0025]將從甘肅省蘭州市秦王川采集的臨床型和陰性奶牛乳房炎乳樣89個，接種實施例I所述選擇培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)18—24h，挑取其中白色菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、特征性的觸酶試驗再次確認(rèn)，挑取12株菌落表現(xiàn)為白色或灰白色的菌落經(jīng)后續(xù)16S rDNA測序鑒定，最終確認(rèn)了 8株無乳鏈球菌。該實驗研宄表明本選擇培養(yǎng)基切實有效，能夠快速地分離篩選出無乳鏈球菌。
[0026]實施例2_同時分選乳樣中腸球菌、鏈球菌:
每100g培養(yǎng)基中含有:胰蛋白胨15g、酵母浸出物/酵母粉5g、牛心浸液/牛肉膏3g、葡萄糖1.5g、氯化鈉2.5g、磷酸氫二鈉0.3g、碳酸鈉2.0g、萘啶酮酸18mg、多粘菌素B
1.8mg、結(jié)晶紫0.15mg、七葉苷4g、檸檬酸鐵0.3g、瓊脂12g，其中葡萄糖和多粘菌素B需要預(yù)先配制，濾過除菌，分裝保存于-20°C條件下，隨取隨用；其余成分加水、加熱攪拌溶解，煮沸3min以后，在115°C條件下滅菌12min后，待溫度下降至50°C — 65°C時，加入預(yù)配的葡萄糖和多粘菌素混勻，灌裝在培養(yǎng)皿中，待溫度下降至37°C以下(至室溫)時即可使用，或無菌操作，將此選擇平板用封口膜或滅菌報紙等封閉，暫存于2— 8 °C備用。
[0027]將從甘肅省及周邊地區(qū)采集的臨床型和陰性奶牛乳房炎乳樣280個，接種實施例2所述選擇培養(yǎng)基35°C培養(yǎng)18 — 24h，可見分選平板上長了大量黑色及棕黑色菌落和少量白色菌落，挑取其中黑色/棕黑色菌落經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，選取以對生、短鏈或單個存在的68株革蘭氏陽性球菌經(jīng)增菌培養(yǎng)后，進行16S rDNA測序鑒定，最終確認(rèn)了 63株腸球菌(本實驗室數(shù)據(jù)，尚未公開)。實驗結(jié)果表明本選擇培養(yǎng)基用于分離腸球菌時切實有效，較傳統(tǒng)多步生化鑒定分離腸球菌方法節(jié)省了許多時間。
[0028]實施例3-用于同時分選乳樣中腸球菌、鏈球菌:
每100g培養(yǎng)基中含有:月示蛋白胨25g、酵母浸出物/酵母粉2g、牛肉膏2g、葡萄糖lg、氯化鈉2g、磷酸氫二鈉0.5g、碳酸鈉2.6g、萘啶酮酸12mg、多粘菌素B 2mg、結(jié)晶紫
0.3mg、七葉苷2g、檸檬酸鐵0.8g、瓊脂18g，配制和保存方法同實施例1。
[0029]實施例4-用于同時分選乳樣中腸球菌、鏈球菌:
每100g培養(yǎng)基中含有:蛋白胨15g、酵母浸出物/酵母粉5g、牛肉膏5g、葡萄糖3g、氯化鈉2.5g、磷酸氫二鈉0.4g、碳酸鈉3g、萘啶酮酸20mg、多粘菌素B為1.2mg、結(jié)晶紫0.lmg、七葉苷5g、檸檬酸鐵0.5g、瓊脂10g。配制和保存方法同實施例1。
[0030]實施例5-單獨同時分選乳樣中的腸球菌:與實施例1不同之處在于氯化鈉為65g，分選培養(yǎng)溫度為45 °C。
[0031]實施例6-單獨同時分選乳樣中的腸球菌:與實施例1不同之處在于氯化鈉為70g，分選培養(yǎng)溫度為47°C。
[0032]實施例5-單獨同時分選乳樣中的腸球菌:與實施例1不同之處在于氯化鈉為50g，分選培養(yǎng)溫度為43 °C。
[0033]單純用于分選腸球菌時，若將培養(yǎng)溫度提高至45°C時，能更有效地抑制葡萄球菌、鏈球菌等背景微生物的生長，從而更特異地分離乳樣中可以分解七葉苷，且能夠耐受45°C高溫的腸球菌，如糞腸球菌、屎腸球菌、海氏腸球菌和類鳥腸球菌等。其中，能夠分解七葉苷的牛鏈球菌和乳房鏈球菌也可在此溫度條件下生長和產(chǎn)生顏色反應(yīng)，需要剔除時，將NaCl提升至50-70%，這個鹽濃度條件下，能夠更好地抑制鏈球菌等絕大部分背景細(xì)菌的生長，而腸球菌生長不受明顯影響。
【主權(quán)項】
1.一種從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基用于同時分離腸球菌和鏈球菌，其組成如下:細(xì)菌學(xué)蛋白胨15 — 25g、酵母2 — 5g、牛心浸液或牛肉膏2—5g、葡萄糖I一3g、氯化鈉1.8一2.5g、磷酸氫二鈉0.3一0.5g、碳酸鈉2.0一3g、萘啶酮酸12—20mg、多粘菌素B 1.2—2mg、結(jié)晶紫0.1—0.3mg、七葉苷2—5g、檸檬酸鐵0.3—0.8g、瓊脂10 — 18g，菌種培養(yǎng)溫度為35— 37°C。
2.—種從乳樣中分離鏈球菌的培養(yǎng)基，其特征在于其組成如下:細(xì)菌學(xué)蛋白胨15—25g、酵母2—5g、牛心浸液或牛肉膏2—5g、葡萄糖I一3g、氯化鈉50_70g、磷酸氫二鈉0.3一0.5g、碳酸鈉2.0 — 3g、萘啶酮酸12 — 20mg、多粘菌素B 1.2 — 2mg、結(jié)晶紫0.1—0.3mg、七葉苷2 — 5g、檸檬酸鐵0.3—0.8g、瓊脂10 — 18g，分選培養(yǎng)溫度為43-47°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，其特征在于:分選培養(yǎng)溫度為45 °C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，其特征在于:所述細(xì)菌學(xué)蛋白胨選自蛋白胨、月示蛋白胨或胰蛋白胨中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，其特征在于:所述酵母為酵母浸出物或酵母粉中的一種。
6.權(quán)利要求1或2所述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于它包括如下步驟: 將葡萄糖和多粘菌素需預(yù)先配制成儲存液，凍存于零下10-零下30°C條件下，隨用隨?。黄溆嘟M分加水加熱攪拌溶解，加水定容至10001^，115—118°0滅菌12 — 20min，待溫度降至50— 65°C時，添加多粘菌素、葡萄糖儲存液混勻，灌制平板，待溫度下降至37°C以下時，即可使用。
7.權(quán)利要求5所述的從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:各組分加水加熱攪拌溶解步驟，將原料煮沸l(wèi)_3min。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從乳樣中分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基用于同時分離腸球菌和鏈球菌，細(xì)菌學(xué)蛋白胨15—25g、酵母2—5g、牛心浸液或牛肉膏2—5g、葡萄糖1—3g、氯化鈉1.8—2.5g、磷酸氫二鈉0.3—0.5g、碳酸鈉2.0—3g、萘啶酮酸12—20mg、多粘菌素B 1.2—2mg、結(jié)晶紫0.1—0.3mg、七葉苷2—5g、檸檬酸鐵0.3—0.8g、瓊脂10—18g，菌種培養(yǎng)溫度為35—37℃。本發(fā)明培養(yǎng)基的優(yōu)點是：整個分離過程簡單、直觀、迅速，可以從乳樣中同時分離腸球菌和鏈球菌的培養(yǎng)基，直接將病原種類定位到具體的種或?qū)?，大大簡化了下游分析鑒定的過程。另外還提供了一種從乳樣中單獨分離鏈球菌的培養(yǎng)基組成。
【IPC分類】C12R1-01, C12R1-46, C12N1-20
【公開號】CN104789502
【申請?zhí)枴緾N201510162451
【發(fā)明人】趙興緒, 武小虎, 候書寶, 馬友記, 張勇
【申請人】甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月8日