一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞白痢是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一，可造成雛雞較高的發(fā)病死亡 率，以及成年雞生產(chǎn)性能降低。經(jīng)蛋傳播是該病的主要途徑，因而對(duì)種雞及其所產(chǎn)的蛋有計(jì) 劃地進(jìn)行檢測，淘汰陽性雞，培育無白痢種雞群，切斷垂直傳播途徑，是控制該病的關(guān)鍵所 在。國內(nèi)外對(duì)種雞雞白痢的凈化方法主要采取全血或血清玻板凝集試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)陽性雞及時(shí) 淘汰，直至全群的陽性率不超過0. 1%為止。雖然我國已有用于檢測雞白痢的平板染色抗 原產(chǎn)品如"雞白痢、雞傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原"，但該抗原在實(shí)際應(yīng)用中存在敏感 度低、診斷速度慢、凝集圖像不夠清晰等缺陷，導(dǎo)致檢測后的種雞群不能達(dá)到徹底凈化的目 標(biāo)，給養(yǎng)殖者造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法，該抗原由雞白痢 沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905制成，用于在雞白痢檢測試劑中的用途。
[0004] 本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種雞白痢染色凝集抗原，該抗原由雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和 SP9905制成。雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905是從歷年來收集、保存的 500余株自然病例所分離的雞白痢沙門氏菌菌種中，經(jīng)多年反復(fù)篩選驗(yàn)證后獲得的4株抗 原性好、變異率低的雞白痢沙門氏菌菌種。
[0005]雞白痢沙門氏菌 SP7220 (Salmonella pullorum SP7220)、SP7701 (Salmonella pullorum SP7701)、SP8441(Salmonella pullorum SP8441)、SP9905(Salmonella pullorum SP9905)已于2014年10月15日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（中國.武漢.武漢大學(xué)）保 藏，名稱及鑒別特征：雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號(hào)：SP7220,保藏編號(hào)： CCTCC N0.M 2014476;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號(hào)：SP7701，保藏編號(hào)： CCTCC N0.M 2014475;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號(hào)：SP8441，保藏編號(hào)： CCTCC N0.M 2014477;雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum)，株號(hào)：SP9905,保藏編號(hào)： CCTCC NO. M 2014478。
[0006] 本發(fā)明提供了雞白痢染色凝集抗原的制備方法，包括如下具體步驟： 1) 種子菌液的制備：將雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌種分別經(jīng) 液體培養(yǎng)基復(fù)蘇繁殖后，接種固體平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)22h，挑選典型菌落接種固體斜面 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后用液體培養(yǎng)基洗下菌苔，再接種固體扁瓶培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后 用液體培養(yǎng)基洗下菌苔檢驗(yàn)合格后作為種子菌液； 2) 細(xì)菌培養(yǎng)：將種子菌液按培養(yǎng)基體積的4. 0%接種固體扁瓶培養(yǎng)基，經(jīng)37°C培養(yǎng)48h 后取出，用含有0.3%福爾馬林生理鹽水洗下菌苔，經(jīng)滅菌紗布過濾后收集菌液，置4°C過 夜滅活； 3)抗原制備：將滅活菌液經(jīng)4000r/min離心15min去上清，用0. 2%福爾馬林生理鹽水 重新懸浮菌泥，將4個(gè)抗原生產(chǎn)菌種按比濁度調(diào)整菌液濃度至每毫升1. 2 X 101(ICFU，充分混 勻，用2. 0%結(jié)晶紫溶液按體積比1 :10加入上述菌液中，間隔2h后再加一次，加入后充分 混勻，于37°C放置24h充分染色后，無菌分裝制成雞白痢染色凝集抗原。
[0007] 本發(fā)明所述的液體培養(yǎng)基組成為：牛肉湯500ml、豬胃消化液500ml、甘油12. 0ml、 硫代硫酸鈉5. 0g、檸檬酸鈉3. 0g、硫酸錳0. 5g、硫酸鎂0. 4g、硫酸亞鐵0. lg、磷酸氫二鉀 3. 5g、海藻糖12. 0g、水解乳蛋白5. 0g。所述的固體培養(yǎng)基通過液體培養(yǎng)基中加入1. 5%的 純化瓊脂粉制成。
[0008] 本發(fā)明方法所述的雞白痢染色凝集抗原含有的細(xì)菌濃度為每毫升1.OX101(ICFU， 其中含有雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905的細(xì)菌數(shù)量分別為40 %、25 %、 20% 和 15%。
[0009] 本發(fā)明還提供了上述雞白痢染色凝集抗原在雞白痢檢測試劑中的用途。
[0010] 本發(fā)明還要求保護(hù)上述雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905。
[0011] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明工藝方法簡單合理、科學(xué)、生產(chǎn)穩(wěn)定，成本低廉，選用 的雞白痢染色凝集抗原生產(chǎn)菌種抗原性好、變異率低，制成的雞白痢染色凝集抗原產(chǎn)品具 有敏感性高、特異性強(qiáng)、診斷快速、凝集圖像清晰的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0013] 實(shí)施例1。
[0014] 1)分離純化與染色鏡檢 雞白痢沙門氏菌SP9905株于1999年5月從江蘇省揚(yáng)州市某雞場的11月齡狼山雞盲 腸內(nèi)容物中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集盲腸內(nèi)容物加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌 液中37 °C過夜培養(yǎng)，再接種麥康凱瓊脂37 °C培養(yǎng)24小時(shí)，挑取直徑為0. 5mm-l. 0mm、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行 革蘭氏染色鏡檢，然后用光學(xué)顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細(xì)長桿菌。
[0015] 雞白痢沙門氏菌SP8441株于1984年12月從北京市某雞場的6月齡白來航蛋雞 輸卵管中分離所得。其具體分離方法為：無菌剪取輸卵管一小段加入營養(yǎng)肉湯中37°C過夜 培養(yǎng)，再接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色透明、 表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭 氏染色鏡檢，然后用光學(xué)顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細(xì)長桿菌。
[0016] 雞白痢沙門氏菌SP7701株于1977年2月從江蘇省揚(yáng)州市某雞場死亡的白洛克雛 雞肝臟中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集死亡雛雞的肝臟置營養(yǎng)肉湯中37°C過夜 培養(yǎng)后，再接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色透 明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行革 蘭氏染色鏡檢，然后用光學(xué)顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細(xì)長桿菌。
[0017]雞白痢沙門氏菌SP7220株于1972年11月從山東省青島市某雞場死亡的白來航 雛雞肝臟中分離所得。其具體分離方法為：無菌采集死亡雛雞的肝臟置營養(yǎng)肉湯中37°C過 夜培養(yǎng)后，再接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。挑取直徑為1. Omm-2. 0_、灰白色 透明、表面光滑的菌落，接種于馬丁瓊脂培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時(shí)。將純培養(yǎng)后的細(xì)菌進(jìn)行 革蘭氏染色鏡檢，然后用光學(xué)顯微鏡觀察，呈兩端稍圓的細(xì)長桿菌。
[0018] 2)生化鑒定 從馬丁瓊脂平板上挑取菌落，進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。微量生化鑒定管購自杭州微生物試 劑有限公司，按照說明書進(jìn)行操作。結(jié)果菌株的各項(xiàng)生化指標(biāo)（見表1)均符合雞白痢沙門 氏菌生化特性。
[0019] 表1雞白痢沙門氏菌生化鑒定結(jié)果
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞白痢染色凝集抗原，其特征在于：由雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441 和SP9905制成，所述的雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905均已于2014年 10月15日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號(hào)分別為：CCTCCNO.M2014476、CCTCC NO.M2014475、CCTCCNO.M2014477、CCTCCNO.M2014478。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雞白痢染色凝集抗原，其特征在于：所述的雞白痢染 色凝集抗原含有的細(xì)菌濃度為每毫升I.OXIOltlCFU,其中含有雞白痢沙門氏菌SP7220、 SP7701、SP8441 和SP9905 的細(xì)菌數(shù)量分別為 40%、25%、20% 和 15%。
3. -種雞白痢染色凝集抗原的制備方法，其特征在于包括如下具體步驟： 1) 種子菌液的制備：將雞白痢沙門氏菌SP7220、SP7701、SP8441和SP9905菌種分別經(jīng) 液體培養(yǎng)基復(fù)蘇繁殖后，接種固體平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)22h，挑選典型菌落接種固體斜面 培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后用液體培養(yǎng)基洗下菌苔，再接種固體扁瓶培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后 用液體培養(yǎng)基洗下菌苔檢驗(yàn)合格后作為種子菌液； 2) 細(xì)菌培養(yǎng)：將種子菌液按培養(yǎng)基體積的4. 0%接種固體扁瓶培養(yǎng)基，經(jīng)37°C培養(yǎng)48h 后取出，用含有0. 3%福爾馬林生理鹽水洗下菌苔，經(jīng)滅菌紗布過濾后收集菌液，置4°C過夜 滅活； 抗原制備：將滅活菌液經(jīng)4000r/min離心15min去上清，用0. 2%福爾馬林生理鹽水重 新懸浮菌泥，將4個(gè)抗原生產(chǎn)菌種按比濁度調(diào)整菌液濃度至每毫升I. 2XIOltlCFU的菌液濃 度后充分混勻，用2. 0%結(jié)晶紫溶液按體積比I: 10加入上述菌液中，間隔2h后再加一次，加 入后充分混勻，于37°C放置24h充分染色后，無菌分裝制成雞白痢染色凝集抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雞白痢染色凝集抗原的制備方法，其特征在于： 所述的液體培養(yǎng)基組成為：牛肉湯500ml、豬胃消化液500ml、甘油12. 0ml、硫代硫酸鈉
5. 〇g、檸檬酸鈉3. 0g、硫酸錳0. 5g、硫酸鎂0. 4g、硫酸亞鐵0.lg、磷酸氫二鉀3. 5g、海藻糖 12. 0g、水解乳蛋白5.Og;所述的固體培養(yǎng)基通過液體培養(yǎng)基中加入1. 5%的純化瓊脂粉制 成。
5. 權(quán)利要求1所述的雞白痢染色凝集抗原在雞白痢檢測試劑中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP7220。
7. 權(quán)利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP7701。
8. 權(quán)利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP8441。
9. 權(quán)利要求1所述的雞白痢沙門氏菌SP9905。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞白痢染色凝集抗原及其制備方法和應(yīng)用，屬于獸醫(yī)診斷技術(shù)領(lǐng)域。該抗原是將雞白痢沙門氏菌菌種SP7220、SP7701、SP8441和SP9905分別復(fù)蘇傳代后制成種子菌液，再將種子菌液接種固體培養(yǎng)基增殖，經(jīng)福爾馬林滅活后，通過比濁法調(diào)整菌液濃度，最后加入結(jié)晶紫溶液染色后充分混勻分裝即制成雞白痢凝集抗原。本發(fā)明工藝方法簡單合理、科學(xué)、生產(chǎn)穩(wěn)定，成本低廉，選用的雞白痢染色凝集抗原生產(chǎn)菌種抗原性好、變異率低，制成的雞白痢染色凝集抗原產(chǎn)品具有敏感性高、特異性強(qiáng)、診斷快速、凝集圖像清晰的優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的檢測雞白痢的染色凝集抗原。CCTCC NO:M201447820141015CCTCC NO:M201447720141015CCTCC NO:M201447620141015CCTCC NO:M201447520141015
【IPC分類】G01N33-569, C12N1-20, C12R1-42
【公開號(hào)】CN104789500
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510158394
【發(fā)明人】龔建森, 許明, 苗晉鋒, 張笛, 顧蓓蓓, 朱春紅, 竇新紅, 劉學(xué)賢, 徐步, 童海兵, 鄒劍敏
【申請(qǐng)人】江蘇省家禽科學(xué)研究所
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月3日