專利名稱：家蠶c-型凝集素重組表達(dá)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的DNA重組表達(dá)技術(shù)及 應(yīng)用，具體涉及一種C-型凝集素及其功能域的重組表達(dá)的創(chuàng)制方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
家蠶由于能夠生產(chǎn)蠶絲，是中國重要的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)絲綢工業(yè)的重要養(yǎng)殖昆蟲。家蠶 在養(yǎng)殖過程中遭受各種病源生物危害，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，迫切需要高效無害 的藥物來防治病害。現(xiàn)在家蠶飼養(yǎng)中主要使用抗生素防治微生物感染病害，使用抗生素的 結(jié)果會(huì)導(dǎo)致抗藥菌產(chǎn)生，對(duì)家蠶生長也有影響。隨著科學(xué)家對(duì)無脊椎動(dòng)物先天免疫分子機(jī) 理的解析和基因工程技術(shù)的發(fā)展，我們可以通過基因工程技術(shù)，生產(chǎn)家蠶本身的免疫系統(tǒng) 的抗病蛋白如凝集素，用于防治家蠶養(yǎng)殖中的細(xì)菌性感染疾病。與所有無脊椎動(dòng)物一樣，家蠶的免疫系統(tǒng)屬于先天免疫系統(tǒng)，與脊椎動(dòng)物的免疫 系統(tǒng)具有極大差異，主要特點(diǎn)是沒有脊椎動(dòng)物所具有的抗體，因此對(duì)病源生物的識(shí)別沒有 特異性，也沒有記憶性。無脊椎動(dòng)物先天免疫的策略不在于體內(nèi)的免疫分子能夠識(shí)別病源 微生物中的每一個(gè)可能的抗原，而是在于能夠識(shí)別在某類微生物中普遍存在的高保守的共 有結(jié)構(gòu)，如脂多糖、肽聚糖。這些微生物中普遍存在的高保守的共有結(jié)構(gòu)被稱為病原相關(guān) 分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs),而無脊椎云力物先天免疫系 統(tǒng)中能夠識(shí)別這些病原相關(guān)分子模式的受體被稱為模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)。在模式識(shí)別受體識(shí)別并結(jié)合外來微生物后，繼而啟動(dòng)一系列先天免疫的 效應(yīng)基因如各種抗菌肽的表達(dá)，這些抗菌肽可以抑制或消滅病源微生物。由于先天免疫是 昆蟲等無脊椎動(dòng)物抵御病源生物入侵和危害的唯一途徑，因此，在無脊椎動(dòng)物病害防治中 不能使用脊椎動(dòng)物中普遍使用的疫苗防病策略和方法，而必須找到新的防病途徑。凝集素廣泛存在于動(dòng)、植物體的細(xì)胞膜上、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞外基質(zhì)中，是一類具有 糖結(jié)合專一性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)，其主要功能是可以結(jié)合糖類，不同的凝集素可以 結(jié)合不同的糖類。目前已知昆蟲中存在各種不同的凝集素，其中，C-型凝集素是Ca2+依 賴的凝集素，從1988年被定義名稱以來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一千多種。C-型凝集素在免疫相關(guān) 時(shí)期高表達(dá)，在Ca2+存在下能特異的識(shí)別病原微生物表面的糖類物質(zhì)，引起宿主的一系列 免疫反應(yīng)從而有效地抵抗病原微生物的入侵，是先天免疫反應(yīng)中的一種模式識(shí)別受體，作 用機(jī)制是以其特有的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate recognition domain, CRD) 結(jié)合微生物表面碳水化合物，在免疫反應(yīng)的非已識(shí)別中起重要作用(Chai Lian-Qin, Tian Yuan-Yuan, Yang Dan-Tong, Wang Jin-Xing, Zhao Xiao-Fan,2008, Molecular cloning and characterization of a C—type lectinfrom the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. Developmental &Comparative Immunology,32 71-83)。家蠶凝集素基因克隆和功能已有研究報(bào)道，Koizumi (Koizumi N, Imamura Μ, Kadotani Τ, Yaoi K, Iwahana H, Sato R. The lipopolysaccharide-binding protein participating in haemocytenodule formation in the silkworm Bombyx mori isa novel member of the C-type lectin superfamilywith two different tandem carbohydrate-recognition domains.FEBS Lett 1999a ；443 139-143 ；Koizumi N， Imamura M，Kadotani T，Yaoi K，Iwahana H，Sato R. Lipopolysaccharide-bindingpr otein of Bombyx mori participates in a hemocyte-mediated defense reaction againstgram-negative bacteria. J Insect Physiol 1999b ；45 853-859.) iiE 明家胃 C-型凝集素具有脂多糖結(jié)合能力，其功能是在先天免疫中參與血細(xì)胞結(jié)節(jié)形成，參與血細(xì) 胞介導(dǎo)的革蘭士陰性菌防御，殺死入侵的病源微生物。但目前為止沒有關(guān)于家蠶凝集素的 重組表達(dá)和用于家蠶感染性疾病防治的研究報(bào)道。全基因組序列研究表明，C-型凝集素從 蠕蟲、果蠅到脊椎動(dòng)物，雖然不 完全相同，但不同C-型凝集素的碳水化合物識(shí)別結(jié)構(gòu)域CRD 序列具有相對(duì)保守的氨基酸殘基，C-凝集素的碳水化合物結(jié)合活性是通過碳水化合物識(shí)別 結(jié)構(gòu)域來實(shí)現(xiàn)的，因此，重組表達(dá)凝集素全長基因(含結(jié)構(gòu)域)或僅表達(dá)凝集素的碳水化合 物識(shí)別結(jié)構(gòu)域均可以獲得有活性的產(chǎn)物。本發(fā)明通過生物工程技術(shù)生產(chǎn)家蠶C-型凝集素， 可以用于家蠶養(yǎng)殖中的微生物感染病害防治。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種家蠶養(yǎng)殖中感染性病害使用的生 物藥物，用于家蠶的感染性病害防治。本發(fā)明在大腸桿菌中重組表達(dá)了家蠶C-型凝集素基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明在大腸桿 菌中重組表達(dá)的家蠶C-型凝集素基因有幫助家蠶抵抗病源微生物侵襲的功能，可以用于 家蠶在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的病害防治。本發(fā)明提供基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物，其特征是，將家蠶C-型凝 集素基因重組表達(dá)到大腸桿菌中。優(yōu)選的，所述家蠶C-型凝集素基因來自家蠶C-型凝集素(Accession number :CAB38429 基因全序列在基因庫中，網(wǎng)址為http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ protein/4469126)。在大腸桿菌中重組表達(dá)家蠶C-型凝集素全長基因以及在上述基因的 基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基因，獲得重組蛋白凝集素。本發(fā)明還提供一種基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，包括如下步驟[1]針對(duì)插入表達(dá)載體的家蠶C-型凝集素的基因序列分別設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引 物，用PCR方法擴(kuò)增家蠶C-型凝集素；[2]在大腸桿菌表達(dá)菌株中擴(kuò)增并提取表達(dá)載體_家蠶C-型凝集素質(zhì)粒；[3]將表達(dá)載體-家蠶C-型凝集素質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)，用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)；[4]用Ni2+柱或其它填料純化重組表達(dá)家蠶C-型凝集素。重組表達(dá)家蠶C-型凝集素為在大腸桿菌中表達(dá)的家蠶C-型凝集素。步驟[3]中所述誘導(dǎo)物為IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷的縮寫)、甲醇或其 它化合物。其中，步驟[1]中所述表達(dá)載體選自大腸桿菌表達(dá)載體和酵母表達(dá)載體。優(yōu)選的， 大腸桿菌表達(dá)載體選自ρΕΤ系列載體或pGEX系列載體，酵母表達(dá)載體選自pPIC系列載體。其中，步驟[1]中所述家蠶C-型凝集素為家蠶C-型凝集素基因(Accession number :CAB38429，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/4469126)及其基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基因。其中，步驟[2]中所述大腸桿菌表達(dá)菌株為任何大腸桿菌表達(dá)菌株，優(yōu)選DH5 α。其中，步驟[3]中所述宿主為大腸桿菌、酵母菌或其它表達(dá)生物。所述大腸桿菌，優(yōu)選BL21(DE3)；所述酵母菌，優(yōu)選畢赤酵母(Pichia pastoris)；所述其它表達(dá)生物，優(yōu)選 昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明還提供所述基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物的應(yīng)用，其特征是， 用于防治家蠶感染性病害。利用本發(fā)明的方法創(chuàng)制的基因重組家蠶C-型凝集素，可以用于家蠶的感染性病 害防治。將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的人工 養(yǎng)殖的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對(duì)家蠶的感染。所述微生物選自蘇云金桿菌 (Bacillusthuringiensis)，綠僵菌(Metarhizium anisopliae)或白僵菌(Beauveria bassiana)0本發(fā)明所述的重組表達(dá)家蠶C-型凝集素，減少病源生物在蟲體中的生存數(shù)量和 感染機(jī)會(huì)，可以減少病源生物對(duì)家蠶的致死率。防治家蠶細(xì)菌性疾病的傳統(tǒng)方法主要是使用抗生素，如添食氯霉素、紅霉素、土霉 素，這樣的方法會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，抗生素對(duì)家蠶的正常生命活動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生不利影響。我們 發(fā)明的家蠶凝集素屬于生物藥物，家蠶凝集素是家蠶本身存在的抵御微生物浸染的天然物 質(zhì)，通過生物技術(shù)方法重組表達(dá)生產(chǎn)的家蠶凝集素可以補(bǔ)充家蠶體內(nèi)的凝集素的不足。重 組表達(dá)的凝集素通過取食或呼吸進(jìn)入蟲體后通過凝集入侵的細(xì)菌從而直接殺死病源微生 物或增加血細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬，不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，對(duì)家蠶本身的正常生命活動(dòng)沒有不 良影響，使用該藥物可以減少抗生素的使用，減少環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)利用本發(fā)明的方法得到的基因重組昆蟲凝集素的作用作進(jìn)一步 的說明。方法⑴設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增C-型凝集素基因，引物如下 LectEco :5’ -TACTCAGAATTCATGAAAGCGGCACTGGCCAGC-3’ (EcoR I ) ；LectXho :5’ -TACTC ACTCGAGTTCATTTGTCGTCGTGCTCTC-3’ (Xho I)，PCR 反應(yīng)，條件為 94°C 30sec,60°C 45sec, 72°C lmin，72°C IOmin0 將 PCR 片段和 pET_30a (+)載體分別用 EcoRI 和 XhoI 酶切，由 T4DNA 連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET-30a(+)載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α， 篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，取1 μ L構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒，稀釋10倍，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Ε. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG誘導(dǎo)插入基 因的表達(dá),取誘導(dǎo)后的菌液，6000rpm離心5min，收集菌體，用3ml PBS(140mM NaCl,2. 7mM KCl, IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4,pH7. 4)禾口 30 μ 1 20% Triton X-100，充分混勻，冰浴超聲 破碎lOmin，破碎好的菌體4°C，12，OOOrpm離心20min，分別收集上清和沉淀，用鎳親和柱純 化重組蛋白重組表達(dá)家蠶C-型凝集素凝集素。方法(2)將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的 人工養(yǎng)殖的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對(duì)家蠶的感染。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增C-型凝集素基因成熟肽(84_1013bp)，即去掉 信號(hào)肽部分。引物如下5’-TACTCAGAATTCATGAAAGCGGCACTGGCCAGC-3’ (EcoR I) ；LectXho 5，-TACTCACTCGAGTTCATTTGTCGTCGTGCTCTC-3’ (Xho I)，PCR 反應(yīng)，條件為 94 "C 30sec, 60°C 45sec，72°C lmin，72°C IOmin0 將 PCR 片段和 pET_30a(+)載體分別用 EcoRI 和 XhoI 酶切，由T4DNA連接酶將純化的cDNA片段與純化的pET_30a(+)載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E. coli DH5 α，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，取IyL構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒，稀釋10倍，轉(zhuǎn)化表達(dá) 菌株Ε. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Kan培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入終濃度為0. 5mM的IPTG 誘導(dǎo)插入基因的表達(dá)，取誘導(dǎo)后的菌液，6000rpm離心5min，收集菌體，用3ml PBS(140mM NaCl，2. 7mM KCl，IOmM Na2HPO4,1. 8mM KH2PO4, pH7. 4)禾口 30 μ 1 20% Triton Χ-100，充分混 勻，冰浴超聲破碎lOmin，破碎好的菌體4°C，12，OOOrpm離心20min，分別收集上清和沉淀， 用鎳親和柱純化重組蛋白。實(shí)施例2將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上或添加到滅菌冷卻至37°C的人工養(yǎng)殖 的家蠶的飼料中，lmg/L，防治微生物對(duì)家蠶的感染。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法可以減少環(huán)境中病源 微生物引起的家蠶感染性疾病的發(fā)生，如綠霉菌感染和蘇云金桿菌感染，發(fā)病率減少60%。實(shí)施例3在實(shí)施例1、2的基礎(chǔ)上，突變基因，獲得表達(dá)產(chǎn)物，具有相同的防治微生物感染的 功效。如1)將基因中任一編碼氨基酸的密碼子的第3位堿基突變而不改變氨基酸，獲得 具有相同氨基酸序列的重組表達(dá)家蠶C-型凝集素，如將tgg，cag, gag, get, cga (分別編 碼W, Q，Ε, A, R氨基酸)，突變成tgg, caa，gaa，gca，egg (仍然分別編碼W，Q，Ε, A, R氨基 酸)，基因中其它序列也如此；2)將基因中的部分序列缺失，獲得具有相同功效的重組表達(dá) 家蠶C-型凝集素，如將基因編碼框中的第1-78堿基缺失、或?qū)⒌?73-503堿基缺失、或?qū)?第926-1010堿基缺失，獲得具有相同功效的重組表達(dá)家蠶C-型凝集素；3)將基因編碼蛋 白質(zhì)中的氨基酸突變而獲得具有相同功效的重組表達(dá)家蠶C-型凝集素，如將K F HK V突 變成K F H D V，基因編碼蛋白質(zhì)中的其它氨基酸突變也如此。實(shí)施例4在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，只表達(dá)基因的某個(gè)片斷，獲得表達(dá)產(chǎn)物，具有相同的防治微 生物感染的功效。如只表達(dá)家蠶C-型凝集素的第24到149氨基酸，獲得表達(dá)產(chǎn)物，或只 表達(dá)161到300氨基酸，獲得表達(dá)產(chǎn)物。實(shí)施例5在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，換用其它表達(dá)載體，如pGEX系列載體、酵母表達(dá)載體如pPIC 系列載體，獲得相同功能的凝集素產(chǎn)物。實(shí)施例6在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，換用其它表達(dá)系統(tǒng)，如酵母表達(dá)系統(tǒng)，獲得相同功能的凝集
素產(chǎn)物。實(shí)施例7給藥方式 將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素添加到滅菌冷卻至37°C的人工養(yǎng)殖的家蠶的飼料 上，濃度為lmg/L，防治病源微生物對(duì)家蠶的感染。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法使家蠶感染性疾病的發(fā)生從90%降低到20%。 將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉上，濃度為lmg/L，防治微生物對(duì)家蠶的感染。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該方法使家蠶感染性疾病的發(fā)生從90%降低到20%。
權(quán)利要求
一種基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物，其特征是，將家蠶C-型凝集素基因重組表達(dá)到大腸桿菌中。
2.如權(quán)利要求1所述的，所述家蠶C-型凝集素基因來自基因庫家蠶C-型凝集素基因 (Accession number :CAB38429，http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/4469126)、在大 腸桿菌中重組表達(dá)家蠶C-型凝集素全長基因、基因片斷、以及在上述基因的基礎(chǔ)上進(jìn)行修 飾或堿基突變產(chǎn)生的基因，獲得重組蛋白凝集素或凝集素功能域。
3.一種基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，包括如下步驟[1]針對(duì)插入表達(dá)載體的家蠶C-型凝集素的基因序列分別設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，用 PCR方法擴(kuò)增家蠶C-型凝集素基因；[2]在大腸桿菌中擴(kuò)增并提取表達(dá)載體_家蠶C-型凝集素基因質(zhì)粒；[3]將表達(dá)載體-家蠶C-型凝集素基因轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)，用誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)；[4]用Ni2+柱或其它填料純化重組表達(dá)家蠶C-型凝集素。
4.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[3]中 所述誘導(dǎo)物為IPTG、甲醇或其它化合物。
5.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[1]中 所述表達(dá)載體選自大腸桿菌表達(dá)載體、酵母表達(dá)載體。優(yōu)選的，大腸桿菌表達(dá)載體選自PET 系列載體或PGEX系列載體，酵母表達(dá)載體選自pPIC系列載體。
6.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[1]中 所述家蠶C-型凝集素為家蠶C-型凝集素基因及其基礎(chǔ)上進(jìn)行修飾或堿基突變產(chǎn)生的基 因。
7.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[2]中 所述大腸桿菌表達(dá)菌株為DH5 α。
8.如權(quán)利要求3所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法，其特征是，步驟[3]中 所述宿主為大腸桿菌、酵母菌；所述大腸桿菌，選自BL21(DE3)；所述酵母菌，選自畢赤酵母 (Pichia pastoris)0
9.如權(quán)利要求1所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物的應(yīng)用，其特征是， 用于防治家蠶微生物感染性病害。
10.如權(quán)利要求9所述的基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物的應(yīng)用，其特征是， 將重組表達(dá)家蠶C-型凝集素噴灑到桑葉或添加到滅菌冷卻至37°C的人工飼料中，lmg/L， 防治微生物對(duì)家蠶的感染；所述微生物選自蘇云金桿菌、綠僵菌或白僵菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，提供一種基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的生物藥物，將家蠶C-型凝集素基因重組表達(dá)到大腸桿菌中。還提供基因重組表達(dá)家蠶C-型凝集素的方法。本發(fā)明的凝集素，可以減少病源生物對(duì)家蠶的致死率，增加血細(xì)胞對(duì)病源生物的吞噬效率，減少病源生物在蟲體中的生存數(shù)量。不會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，對(duì)家蠶本身的正常生命活動(dòng)沒有不良影響，使用該藥物可以減少家蠶飼養(yǎng)中抗生素的使用，減少環(huán)境中耐藥菌的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A23K1/16GK101864425SQ201010173398
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月17日
發(fā)明者宋凱, 王金星, 趙小凡 申請人:山東大學(xué)