專利名稱：鼠尾藻凝集素及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種凝集素及制備方法，尤其是ー種凝集細(xì)胞廣泛的鼠尾藻凝集素及制備方法。
背景技術(shù)：
凝集素(Lectin)是非免疫起源的具有糖專ー性、可促使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白。凝集素在自然界中分布極廣，從病毒到人類，幾乎所有的物種中，均已分離得到了凝集素，其中最初發(fā)現(xiàn)的是植物凝集素。1966年，Boyd等人在一些熱帶海藻中發(fā)現(xiàn)了海藻凝集素的存在，此后Blunden和Rogers等對(duì)英國(guó)沿海的海藻檢測(cè)了提取物的凝集活性，但是發(fā)現(xiàn)只有很少的ー些海藻提取物對(duì)未經(jīng)處理的人血紅細(xì)胞有一定的凝集作用，之后Hori等 又對(duì)越南海藻凝集素進(jìn)行了篩選。Hori報(bào)道至1994年，人們從10種綠藻、13種紅藻中分離純化出凝集素，并且從其中5種紅藻中得到了部分純化制品。之后，人們又對(duì)隅江蘺iGracilaria cor/ ea)、絨線藻(Zfe1Sja villosa )等進(jìn)行了分離純化及其性質(zhì)的研究,發(fā)現(xiàn)所提取的凝集素具有凝集細(xì)胞、參與原生質(zhì)體形成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、激活淋巴細(xì)胞、抑制血小板凝集等多種功能的生物活性。褐藻雖然也是ー種海藻，但是由于常規(guī)提取物中含有多酚，故人們一直偏見地認(rèn)為褐藻提取物凝集細(xì)胞現(xiàn)象只是多酚凝集血細(xì)胞的ー種假凝集現(xiàn)象，以至于迄今為止，對(duì)海藻凝集素的研究主要集中在紅藻、緑藻，而關(guān)于褐藻門圓子綱馬尾藻屬鼠尾藻thunbergiiグ治// tee)凝集素的分離純化未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)偏見，提供ー種凝集細(xì)胞廣泛的鼠尾藻凝集素及制備方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻為原料，經(jīng)凍干、粉碎、浸泡、離心、硫酸銨分級(jí)，DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析而得到，其分子量為17kD。上述的鼠尾藻凝集素的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行
a.以新鮮鼠尾藻為原料，凍干、粉碎成粗粉，按質(zhì)量體積(g/ml)比為I:1(Γ20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS緩沖液，4°C 30°C浸泡16 24h，5000r/min離心30min,取上清液；
b.在冰水浴及攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至上清液中，使上清液中硫酸銨飽和度達(dá)65 85%,攪拌混勻后,5000r/min離心30min,收集沉淀,棄去上清；
c.用生理鹽水溶解沉淀并用生理鹽水透析至無(wú)S042_后，采用I.6X 20cm DEAE-52纖維素離子交換層析柱，用梯度混合儀進(jìn)行線性梯度洗脫，所述梯度混合儀混合瓶中的洗脫液I是PH 7.5的O. Olmol.じ1Tris-HCl緩沖液，所述梯度混合儀儲(chǔ)藏瓶的梯度洗脫液II是pH 7. 5 含有 O. 8mol.じ1 NaCl 的 O. 15mol.じ1 Tris-HCl 緩沖液，洗脫流速為 3ml/10min，按每管3ml分管，收集23 31管的洗脫產(chǎn)物并濃縮；d.將上述濃縮的洗脫產(chǎn)物，上I. 6 X 90cm Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析柱，洗脫液為PH7. 2的O. 015mol/LPBS緩沖液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51 59管的洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥。本發(fā)明首次以鼠尾藻為原料，分離、純化出凝集細(xì)胞活性強(qiáng)的鼠尾藻凝集素，所凝集的細(xì)胞廣泛，對(duì)于兔、狗、羊、鯽魚、雞及人(A、B、AB)等紅細(xì)胞均有凝集作用，其中對(duì)兔及雞紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的最低濃度分別為4. 4mg/ml、0. 55 mg/ml,即使在100°C 30min熱處理后仍然對(duì)兔紅細(xì)胞顯示出血凝活性(活性下降75%)，而在25°C 50°C保溫30min，活性均未見改變。糖抑制性實(shí)驗(yàn)表明，鼠尾藻凝集素僅被糖蛋白牛甲狀腺球蛋白和Y-球蛋白所抑制，最小抑制濃度分別為I. 25mg. mじ1和2. 5mg. mじ1。本發(fā)明的鼠尾藻凝集素在pH6. 5 7范圍內(nèi)活性最聞。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例經(jīng)凝膠過(guò)濾所測(cè)分子量譜圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例DEAE-52纖維素離子交換層析的譜圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析譜圖。
具體實(shí)施例方式a.鼠尾藻采回后立即用過(guò)濾海水洗浄，用紗布或?yàn)V紙吸干水分，放入-20°c冰箱中冷凍，然后置于冷凍干燥機(jī)中凍干，研磨成粉末，按質(zhì)量體積(g/ml)比為I :20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS緩沖液，4°C浸泡16h，5000r/min離心30min，取上清液；
b.在冰水浴及攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至上清液中，使上清液中硫酸銨飽和度達(dá)85%,攪拌混勻后,5000r/min離心30min,收集沉淀,棄去上清；
c.用生理鹽水溶解沉淀并用生理鹽水透析至無(wú)S042_后，采用I.6X 20cm的DEAE-52纖維素離子交換層析柱，用PH值7. 5，0. Olmol/じ1 Tris-HCl緩沖液平衡至A28(l〈0. 01再上樣，用梯度混合儀進(jìn)行線性梯度洗脫，所述梯度混合儀混合瓶中的洗脫液I是PH 7.5的O. Olmol.じ1Tris-HCl緩沖液，所述梯度混合儀儲(chǔ)藏瓶的梯度洗脫液II是pH 7.5含有O. 8mol.じ1 NaCl的O. 15mol.じ1 Tris-HCl緩沖液，梯度混合瓶與恒流泵相連，恒流泵與層析柱頂端相連，調(diào)好流速為3ml/10min，按每管3ml分管，收集23 31管的洗脫產(chǎn)物并濃縮；
DEAE-52纖維素離子交換層析的譜圖如圖2所示經(jīng)線性離子梯度洗脫，可得兩個(gè)蛋白吸收峰，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)在280nm時(shí)的吸光值后，對(duì)各蛋白質(zhì)吸收峰進(jìn)行凝集活性測(cè)定，用兔血紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，表明第一個(gè)蛋白峰(相對(duì)于23 31管)有凝血活性。d.將上述濃縮的洗脫產(chǎn)物，上I. 6X90cm Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析柱，洗脫液為 ρΗ7· 2 的 O. 015mol/LPBS 緩沖液(O. 015mol/L, Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7. 2)，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第5廣59管的洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥得白色樣品，即鼠尾藻凝集素。Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析譜圖如圖3所示可以分出兩個(gè)吸收峰,經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)在280nm時(shí)的吸光值后，對(duì)各蛋白質(zhì)吸收峰進(jìn)行凝集活性測(cè)定，用兔血紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，表明第二個(gè)蛋白峰(相對(duì)于59管)有凝血活性。
將所得產(chǎn)物經(jīng)凝膠過(guò)濾分析其分子量為17kD，其譜圖如圖I所示，圖中I是牛甲狀腺球蛋白(MW669000D)，2是胰蛋白酶(MW23300D)，3是細(xì)胞色素C (Cytochrome C)(MWl2200D)，4是本發(fā)明實(shí)施例的鼠尾藻凝集素。實(shí)驗(yàn)及結(jié)果
凝集活性的測(cè)定方法
在96孔V型血凝板上用40 μ I本發(fā)明實(shí)施例凝集素溶液與等量生理鹽水系列倍比稀釋后，加入2%紅細(xì)胞懸液40 μ 1，振勻，室溫放置2h后，肉眼觀察，無(wú)凝集現(xiàn)象時(shí)紅細(xì)胞沉積在V型孔底部呈大紅點(diǎn)狀，有凝集現(xiàn)象時(shí)呈網(wǎng)狀不下沉，血凝活力以產(chǎn)生凝集現(xiàn)象時(shí)的最小凝集素量或凝集素最大稀釋倍數(shù)表示。本發(fā)明實(shí)施例的鼠尾藻凝集素對(duì)10種紅細(xì)胞有凝集作用，其中對(duì)雞血細(xì)胞的凝集活力卻高達(dá)27，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表I :
表I鼠尾藻凝集素血凝活性
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—- 糖抑制試驗(yàn)
選擇以下糖類α-乳糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、蔗糖、麥芽糖、D-葡萄糖，起始濃度為80mmol/L ;選擇的糖蛋白Y _球蛋白、牛甲狀腺球蛋白，起始濃度為20g/L。在96孔V型血凝板中加入糖或糖蛋白溶液40 μ L，用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，然后加入40 μ L能凝集兔紅細(xì)胞的最小濃度2倍的本發(fā)明鼠尾藻凝集素，靜置15min (室溫)，再加入40 μ L，2%兔紅細(xì)胞懸液振勻，靜置2h，觀察糖抑制兔紅細(xì)胞凝集的最小濃度。結(jié)果表明本發(fā)明鼠尾藻凝集素不被所測(cè)試的單糖、ニ糖、聚糖所抑制，僅被糖蛋白(牛甲狀腺球蛋白和Y-球蛋白)所抑制，最小抑制濃度分別為I. 25mg. mL_1和2. 5mg. mL'結(jié)果見表2。表2糖和糖蛋白對(duì)本發(fā)明實(shí)施例血凝活性的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種鼠尾藻凝集素，其特征在于是以鼠尾藻為原料，經(jīng)凍干、粉碎、浸泡、離心、硫酸銨分級(jí)，DEAE-52離子交換層析和Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析而得到，其分子量為17kD。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的鼠尾藻凝集素的制備方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行 a.以新鮮鼠尾藻為原料，凍干、粉碎成粗粉，按質(zhì)量體積(g/ml)比為I:1(Γ20向鼠尾藻粗粉中添加含O. 15mol.じ1NaCl的PBS緩沖液，4°C 30°C浸泡16 24h，5000r/min離心30min,取上清液； b.在冰水浴及攪拌條件下，添加硫酸銨粉末至上清液中，使上清液中硫酸銨飽和度達(dá)65 85%,攪拌混勻后,5000r/min離心30min,收集沉淀,棄去上清； c.用生理鹽水溶解沉淀并用生理鹽水透析至無(wú)S042_后，采用I.6X 20cm DEAE-52纖維素離子交換層析柱，用梯度混合儀進(jìn)行線性梯度洗脫，所述梯度混合儀混合瓶中的洗脫 液I是PH 7.5的O. Olmol.じ1Tris-HCl緩沖液，所述梯度混合儀儲(chǔ)藏瓶的梯度洗脫液II是pH 7. 5 含有 O. 8mol.じ1 NaCl 的 O. 15mol.じ1 Tris-HCl 緩沖液，洗脫流速為 3ml/10min，按每管3ml分管，收集23 31管的洗脫產(chǎn)物并濃縮； d.將上述濃縮的洗脫產(chǎn)物，上I.6 X 90cm Sephadex G-200凝膠過(guò)濾層析柱，洗脫液為PH7. 2的O. 015mol/LPBS緩沖液，流速2ml/10min，按每管2ml分管，收集第51 59管的洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鼠尾藻凝集素及制備方法，其特征在于是以鼠尾藻為原料，經(jīng)凍干、粉碎、浸泡、離心、硫酸銨分級(jí)，DEAE-52離子交換層析和SephadexG-200凝膠過(guò)濾層析而得到，其分子量為17kD。所凝集的細(xì)胞廣泛，對(duì)于兔、狗、羊、鯽魚、雞及人(A、B、AB)等紅細(xì)胞均有凝集作用，其中對(duì)兔及雞紅細(xì)胞凝集反應(yīng)的最低濃度分別為4.4mg/ml、0.55mg/ml，即使在100℃30min熱處理后仍然對(duì)兔紅細(xì)胞顯示出血凝活性(活性下降75%)。糖抑制性實(shí)驗(yàn)表明，鼠尾藻凝集素僅被糖蛋白牛甲狀腺球蛋白和γ-球蛋白所抑制，最小抑制濃度分別為1.25mg.mL-1和2.5mg.mL-1。
文檔編號(hào)C07K14/405GK102690339SQ201210137779
公開日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月7日
發(fā)明者周曉茹, 李丹彤 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué), 李丹彤