專利名稱：一種四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從何首烏的根莖中提取二苯乙烯苷單體的分離純化工藝，屬于天然產(chǎn)物分離提取技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管性癡呆(Vascular Dementia, VD)是指在缺血性、出血性及急慢性缺血缺氧性腦血管疾病引起的腦組織損害基礎(chǔ)上，產(chǎn)生的以高級神經(jīng)認(rèn)知功能障礙為主的一組臨床綜合癥，是繼阿爾茨海默病后的引起癡呆的第二大原因。其臨床表現(xiàn)為記憶障礙、認(rèn)知缺損、人格改變、定向力喪失、行為異常、日常社交及生活能力低下等。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，歐美國家VD約占老年期癡呆的20%，而在我國約占60% ;日本的VD患病率則達(dá)到 I.1% -3. 0%。隨著世界范圍老齡化進(jìn)程加速，VD的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，且隨著年齡的增長而升高，甚至隨著心血管疾病和中風(fēng)的發(fā)病率的上升，VD將有可能成為引起癡呆的首要原因。由于血管性癡呆發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，存在多致病因素，現(xiàn)有藥物多為單靶點(diǎn)調(diào)控，存在著療效不強(qiáng)或效果單一、副作用大等不足，難以真正滿足治療血管性癡呆的實(shí)際需要。因此，研發(fā)新的具有多功能的、高效低毒的VD治療藥物具有很強(qiáng)的迫切性和必要性。我國傳統(tǒng)中醫(yī)及抗衰老中藥可挖掘的寶庫很多，中藥及其有效成分在防治VD方面具有潛在優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景。何首烏(Polygonum multiflorum Thunb)為寥科多年生草本植物的塊根，是我國傳統(tǒng)的延年益壽的中草藥。其主要的功效性成分二苯乙烯苷近年來成為研究的熱點(diǎn)。二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG),化學(xué)名為2、
3、5、4’ -四羥基二苯乙烯-2-0-B-D-葡萄糖苷，結(jié)構(gòu)為一種多酚類糖苷，結(jié)構(gòu)式為
OH
JI J 削 OH I HCT —OH, 0
/
Vo
LOH
TSG
文獻(xiàn)報(bào)道了其多項(xiàng)生理功能抗氧化、清除自由基；抗腫瘤；降低膽固醇；抑制動脈粥樣狀硬化；保護(hù)肝臟；具有血管舒張作用；防治老年癡呆；提高記憶等功效。由于其療效確切、副作用小，有望開發(fā)為治療VD的一類化學(xué)新藥。因此，研究從何首烏提取分離并得到高純度的二苯乙烯苷具有非常重要的意義。四羥基二苯乙烯苷為多酚類糖苷類物質(zhì)，強(qiáng)極性、存在敏感性基團(tuán)(酚羥基)、易形成氫鍵、及極端條件的不穩(wěn)定性等結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得其分離純化頗具有挑戰(zhàn)性。目前已報(bào)道的分離純化方法包括高效液相色譜法、各種層析法、結(jié)晶法等，然而高純度的分離純化一直處在實(shí)驗(yàn)室少量制備的水平，未見有適合工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模的制備工藝的報(bào)道。美國Chen(J.Agr.Food Chem.，1999，47，2226-2228)用 95% 乙醇提取，提取物溶解于水中，依次由已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物依次經(jīng)過反相硅膠柱，SephadexLH20柱，最后獲得二苯乙烯苷純品。 操作繁瑣，成本較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。日本Hata (藥學(xué)雜志，1975，2，211-213)的提取方式為乙醚冷浸，繼而用丙酮回流提取，丙酮提取液經(jīng)柱層析等方法分離純化后，放置冰箱中冷凍I個月得到的二苯乙烯苷。嚴(yán)秀珍等(上海第一醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1981，2，123-126)采用乙醇回流，乙醇浸膏用乙醚抽提，余物經(jīng)水、乙酸乙酯回流提取多次后，經(jīng)硅膠、聚酰胺、活性碳等各種層析方法反復(fù)分離純化得到薄層層析顯示一個斑點(diǎn)的無定形物，使用各種有機(jī)溶劑嘗試重結(jié)晶，均未得到結(jié)晶。后將該物質(zhì)乙?；?jīng)乙?；a(chǎn)物的波譜數(shù)據(jù)間接判斷上述無定形物為四羥基二苯乙烯苷(TSG)。該方法操作繁瑣，也沒有TSG相關(guān)的純度數(shù)據(jù)報(bào)道。呂麗爽等(中國發(fā)明專利CN101003554A)采用水或乙醇提取，濃縮液用聚酰胺或大孔樹脂層析柱分離，將收集到的物質(zhì)用溶劑重結(jié)晶法得到二苯乙烯苷晶體。該方法雖然可以得到TSG純品，但鑒于二苯乙烯苷純品獲得有限，不足以對結(jié)晶的工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。另外，多羥基化合物往往需要多次反復(fù)重結(jié)晶方能達(dá)到純度要求，周期長、回收率低、不適合工業(yè)化生產(chǎn)。陸蘊(yùn)茹等(中國發(fā)明專利ZL98120290. X)公開了從何首烏中提取分離TSG的方法，該方法將用于分離純化的層析柱進(jìn)行破壞性切割，共十個片段，再進(jìn)行取樣分離，過程繁瑣，成本高，只適合實(shí)驗(yàn)室微量樣品的制備。上述文獻(xiàn)或?qū)＠椒ǘ忌婕暗礁鞣N柱層析分離方法，眾所周知，柱層析操作繁瑣，一方面樣品損失比較大，導(dǎo)致產(chǎn)率偏低，另一方面大量洗脫溶劑的使用使得成本增加，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合大規(guī)模生產(chǎn)四羥基二苯乙烯苷的分離提純工藝，該工藝操作簡便，成本低廉，收率穩(wěn)定，在保持低成本和高收率的同時(shí)，能夠獲得高純度的四羥基二苯乙烯苷結(jié)晶，達(dá)到藥用天然產(chǎn)物的要求，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過程如下
一種四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，包括以下步驟
(1)何首烏經(jīng)乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶劑得褐色浸膏；
(2)褐色浸膏加乙醚冷浸處理，并除去乙醚層；
(3)乙醚冷浸處理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層，旋去乙酸乙酯得粗產(chǎn)品；
(4)粗產(chǎn)品加堿液調(diào)節(jié)pH為8-10,再用乙酸乙酯萃取，向萃取后的水層中加入環(huán)己燒和乙醇，旋蒸除去溶劑得TSG鹽粗品；
(5)TSG鹽粗品用乙醇或異丙醇重結(jié)晶，然后加水溶解，調(diào)節(jié)pH至5.5-7. 0，再用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯得TSG純品。TSG純品用高效液相色譜檢測純度大于99%。
上述四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝步驟(I)中，何首烏經(jīng)乙醇超聲提取得到浸提液。上述四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝步驟(2)中，褐色浸膏加乙醚浸泡處理
0.5-3小時(shí)，出去大黃素、大黃素甲醚等雜志。上述四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝步驟步驟(3)中，乙醚冷浸處理后的浸膏加水溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)后再用乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。上述四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝步驟步驟(4)中，粗產(chǎn)品用lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH為9，用乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。加入的環(huán)己烷和乙醇與水層中的水 形成三元共沸物，加入的環(huán)己烷和乙醇與水層中水三者體積比為70%:7%:23%。上述四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝步驟步驟(5)中，用鹽酸或醋酸調(diào)節(jié)pH至
5.5-7. O。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)與積極效果
1、從何首烏中提取有效成分時(shí)最好采用超聲波法，該方法無需加熱，操作簡便快捷，提取率高，周期短；
2、在純化過程中采用將TSG經(jīng)簡單的化學(xué)轉(zhuǎn)變成鹽，TSG成鹽后在水中溶解性好且穩(wěn)定，在該步驟用有機(jī)溶劑抽提大部分雜質(zhì)，簡化分離提純步驟；
3、利用鹽類化合物易結(jié)晶的特點(diǎn)，重結(jié)晶時(shí)易于和其它雜質(zhì)分離、獲得高純度TSG；
4、本發(fā)明避免了各種繁瑣的柱層析，合成工藝大為簡化，整體工藝條件溫和，不使用有毒有害溶劑，適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖I為本發(fā)明提取流程圖。
具體實(shí)施例方式如圖I所示，將何首烏塊莖粉碎，過篩80目，用工業(yè)乙醇超聲提取，提取液旋干得褐色浸膏，用乙醚冷浸萃取。乙醚萃取過的醇浸膏加水溶解，過濾，除去不溶性雜質(zhì)，濾液用乙酸乙酯萃取，蒸除溶劑得到粗產(chǎn)物。用適當(dāng)?shù)膲A調(diào)pH至8-10，乙酸乙酯萃取除雜質(zhì)，留置水層，加入乙醇和環(huán)己烷形成三元共沸物蒸除水，得到TSG鹽粗品。用乙醇重結(jié)晶，得到TSG鹽白色晶體，將其溶于水，用酸調(diào)pH到5. 5-7. 0，乙酸乙酯萃取，硫酸鎂干燥，蒸除溶劑得到TSG純品，高效液相色譜測其純度，可達(dá)99%。實(shí)施例I
稱取何首烏粉末100g(80目)置于燒杯中，加入工業(yè)乙醇200mL，超聲提取10分鐘，靜置，分離上清液，旋去溶劑得褐色浸膏。在褐色浸膏中，加入乙醚浸泡，0.5 h后過濾除去醚層。乙醚冷浸處理后的浸膏，加水分充分溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)。濾液用乙酸乙酯萃取至酯層再無吸收點(diǎn)為止。收集酯層旋去溶劑得褐色粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=9，乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。留置水層。在水層中加入環(huán)己烷，乙醇與水形成共沸物，(三者體積比為70%: 7%: 23%，沸點(diǎn)為62. 10C )旋去全部溶劑得TSG鹽粗品。將粗品用乙醇重結(jié)晶，得TSG鹽白色晶體。TSG鹽白色晶體用水溶解，IM HCl調(diào)節(jié)pH=6. 5，乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，加入無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液旋干得TSG純品4. 3g，高效液相色譜測的純度大于99%。 實(shí)施例2
稱取何首烏粉末500g (80目)置于燒杯中，加入工業(yè)乙醇超聲提取10分鐘，靜置，分離上清液，旋去溶劑得褐色浸膏。在褐色浸膏中，加入乙醚浸泡，0.5 h后過濾除去醚層。乙醚冷浸處理后的浸膏中，加水充分溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)。濾液用乙酸乙酯萃取至酯層再無吸收點(diǎn)為止。收集酯層旋去溶劑得褐色粗產(chǎn)品。粗產(chǎn)品用lmol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH=8. 5，乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。留置水層。在水層中加入環(huán)己烷，乙醇與水形成共沸物，旋去溶劑，得TSG鹽粗品。將粗品用異丙醇重結(jié)晶，得TSG鹽白色晶體。TSG鹽白色晶體、用水溶解，醋酸調(diào)節(jié)PH=6. 0，乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)層，加入無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液旋干得TSG純品21. Ig,高效液相色譜測的純度大于99%。
權(quán)利要求
1.一種四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于包括以下步驟 (1)何首烏經(jīng)乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶劑得褐色浸膏； (2)褐色浸膏加乙醚冷浸處理，并除去乙醚層； (3)乙醚冷浸處理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯層，旋去乙酸乙酯得粗產(chǎn)品； (4)粗產(chǎn)品加堿液調(diào)節(jié)pH為8-10,再用乙酸乙酯萃取，向萃取后的水層中加入環(huán)己燒和乙醇，旋蒸除去溶劑得TSG鹽粗品； (5)TSG鹽粗品用乙醇或異丙醇重結(jié)晶，然后加水溶解，調(diào)節(jié)pH至5.5-7. 0，再用乙酸乙酯萃取，除去乙酸乙酯得TSG純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于TSG純品用 高效液相色譜檢測純度大于99%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(I)中，何首烏經(jīng)乙醇超聲提取得到浸提液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(2)中，褐色浸骨加乙醚冷浸處理0. 5-3小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(3)中，乙醚冷浸處理后的浸膏加水溶解，過濾除去不溶性雜質(zhì)后再用乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(4)中， 粗產(chǎn)品用氫氧化鈉溶液或碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)PH為9，用乙酸乙酯萃取至酯層無吸收點(diǎn)為止。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(4)中，加入的環(huán)己烷和乙醇與水層中的水形成三元共沸物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于加入的環(huán)己烷和乙醇與水層中水三者體積比為70%:7%:23%。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的四羥基二苯乙烯苷的分離純化工藝，其特征在于步驟(5)中，用鹽酸或醋酸調(diào)節(jié)PH至5. 5-7. 0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從何首烏的根莖中提取二苯乙烯苷單體的分離純化工藝，何首烏先經(jīng)乙醇提取得到浸提液，除去乙醇溶劑得褐色浸膏，褐色浸膏加乙醚冷浸處理并除去醚層，乙醚冷浸處理后的浸膏加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集酯層，旋去溶劑得褐色粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品加堿液調(diào)節(jié)pH為8-10，再用乙酸乙酯萃取，萃取后的水層中加入環(huán)己烷和乙醇，旋蒸除去溶劑得TSG鹽粗品，再經(jīng)酸化、乙酸乙酯萃取得純品。本發(fā)明避免了各種繁瑣的柱層析，合成工藝大為簡化；整個工藝條件溫和，不使用有毒有害溶劑，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C07H1/08GK102659863SQ201210136568
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月6日
發(fā)明者何煒, 張俊娜, 張旭, 張邦樂, 王四旺, 王寶龍 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)