一種利用赤霉菌制備3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明留體化合物生物轉(zhuǎn)化方法具體的設(shè)計一種羥化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 屈螺酮是一種新型的孕激素，因其具有一定的鹽皮質(zhì)激素作用，在用于制備口服 短效避孕藥時，可以克服一般孕激素帶來的體重增加的副作用。3 β，7α，15 α -三羥基 雄甾-5-烯-17-酮（即7α，15α -二羥基去氫表雄酮，簡稱7α，15α -diOH-DHEA，CAS : 2963-69-1)則是生產(chǎn)屈螺酮的重要中間體，因合成困難，一般采用或去氫表雄酮（DHEA)生 物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。
[0003] 中國專利CN102965288A公開了一種用于將DHEA轉(zhuǎn)化為3β，7α，15α -三羥基雄 留-5_ 稀-17-酮的赤霉菌（Gibberellaintermedia) CA3-1 (保藏編號為 CGMCC No. 4903)， 可以實現(xiàn)高濃度投料與高產(chǎn)物得率，其在常規(guī)發(fā)酵工藝下，投料濃度達到5-8g/L，底物轉(zhuǎn)化 率達到68-84%，且隨著投料濃度提高，其底物轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)了顯著的降低，當投料濃度達到 8g/L時，轉(zhuǎn)化率僅有68%。
[0004] 因此在采用赤霉菌將DHEA轉(zhuǎn)化為3 β，7α，15 α -三羥基雄甾-5-烯-17-酮的生 物發(fā)酵中，進一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高底物的轉(zhuǎn)化率和投料濃度，成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決 的問題

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種改進的利用赤霉菌制備3β，7α， 15 α-三羥基雄留-5-烯-17-酮的方法，在研宄中為我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中通常被用 作抑菌劑的某種殼聚糖衍生物，能夠意外的提高赤霉菌發(fā)酵制備3 β，7 α，15 α -三羥基雄 甾-5-烯-17-酮時的轉(zhuǎn)化率和投料濃度。
[0006] 本發(fā)明提供了 一種利用赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1 制備 3 β，7 α， 15 α -三羥基雄留-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏編號為CGMCC No. 4903,所述方法 包括以下步驟：
[0007] (1)菌體培養(yǎng)液的制備，將保藏號為CGMCC No. 4903的赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)、菌體培養(yǎng)得到菌體培養(yǎng)液；
[0008] (2)生物轉(zhuǎn)化，向步驟（1)中的菌體培養(yǎng)液中加入富馬酰殼聚糖和DHEA，富馬酰殼 聚糖與菌體培養(yǎng)液的重量體積比為1 : 50?100, DHEA的終濃度為8. 5?10g/L，在26? 30°C下，200?220r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36?60h，即得轉(zhuǎn)化液；
[0009] (3)產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到3 β，7α，15 α-三羥基雄 甾-5-烯-17-酮。
[0010] 所述的富馬酰殼聚糖的取代度為〇. 45?0. 48。
[0011] 所述的方法，其特征是斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其組成為成分及配比為： 土豆淀粉200?500g/L ;葡萄糖30?50g/L ;酵母粉5?lOg/L ;瓊脂粉15?20g/L以及 余量的蒸餾水；
[0012] 所述的方法，其特征是所述用于菌體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為菌體培養(yǎng)基，所述菌體培養(yǎng) 基的成分及配比為：葡萄糖20?50g/L ;NaCl 0· 5?2g/L ;酵母粉10?30g/L ;K2HP04 0· 1?5. Og/L ;FeS04 · 7H20 0· 01?0· lg/L ;及余量的蒸餾水，調(diào)培養(yǎng)基的pH至6· 5-7. 5。
[0013] 所述的方法，其特征是所述菌體培養(yǎng)液的制備工藝為：
[0014] 斜面培養(yǎng)，將接種菌種的培養(yǎng)基斜面置于28-32?，培養(yǎng)3-5天，得到成熟的孢子 菌絲，菌體培養(yǎng)分為一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)兩步；
[0015] -次培養(yǎng)，用接種環(huán)挑斜面培養(yǎng)得到的一環(huán)菌絲接種于有80?120mL菌體培養(yǎng)基 中，在26?30°C下震蕩培養(yǎng)18-36h得到一次培養(yǎng)液；
[0016] 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比3-6%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一 次培養(yǎng)相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)18_36h，得到菌體培養(yǎng)液。
[0017] 所述的方法，其特征是依發(fā)酵規(guī)模不同，二次培養(yǎng)可以分多次進行。每次接種均采 用上一次培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液，接種量為體積百分比3-6%，用于生產(chǎn)菌體培養(yǎng)液。
[0018] 殼聚糖（chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)（chitin) 經(jīng)過脫乙酰作用得到的，殼聚糖具有一定增溶作用，但因其也具有抑菌作用，因此一般不在 生物發(fā)酵領(lǐng)域使用，參考文獻一一殼聚糖的化學(xué)改性及其衍生物的抑菌活性研宄（馮永巍， 江南大學(xué)博士論文，2011年6月）中公開了對殼聚糖進行化學(xué)改性得到的苯甲酰殼聚糖、 對羥基苯甲酰殼聚糖、富馬酰殼聚糖等殼聚糖衍生物，我們經(jīng)過實驗驚奇的發(fā)現(xiàn)，富馬酰殼 聚糖在用于本發(fā)明所提及的赤霉菌羥化發(fā)酵時時，能夠顯著的提高底物的投料濃度和轉(zhuǎn)化 率，而殼聚糖及其他殼聚糖衍生物均無此效果。而且對于采用其他菌種進行羥化發(fā)酵時，加 入富馬酰殼聚糖也無此作用。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0020] 菌種：赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1，保藏編號 CGMCC No. 4903
[0021] 底物原料：去氫表雄酮（DHEA)，含量98%，
[0022] 富馬酰殼聚糖、對羥基苯甲酰殼聚糖、苯甲酰殼聚糖均按參考文獻一一殼聚糖的 化學(xué)改性及其衍生物的抑菌活性研宄（馮永巍，江南大學(xué)博士論文，2011年6月）中公開 的方法制備得到，其中富馬酰殼聚糖的取代度為〇. 45?0. 48,苯甲酰殼聚糖的取代度為 1. 2-1. 3,對羥基苯甲酰殼聚糖的取代度為1. 2-1. 3,殼聚糖的脫乙酰度>大于90%。
[0023] PDA培養(yǎng)基的配比為：土豆淀粉300g/L ;葡萄糖40g/L ;酵母粉7g/L ;瓊脂粉17g/ L以及余量的蒸餾水；pH自然，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0024] 菌體培養(yǎng)基的配比為：葡萄糖35g/L;NaCl 0.9g/L;酵母粉15g/L;K2HP04 0.2g/ L ;FeS04 ·7Η20 0· 05g/L ;滅菌前調(diào)培養(yǎng)基的pH至6· 5_7· 5,在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0025] 步驟
[0026] (1)將實驗室_80°C保存的菌種甘油管，加入到IOmL的菌體培養(yǎng)基進行活化培養(yǎng)。 再轉(zhuǎn)接到置于250mL錐形瓶中的30mL菌體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2天得種子液，
[0027] 斜面培養(yǎng)，將該種子液劃線于PDA培養(yǎng)基，將接種菌種的PDA斜面置于30°C的恒溫 培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4天，得到成熟的孢子菌絲；
[0028] -次培養(yǎng)，用接種環(huán)挑一環(huán)斜面培養(yǎng)得到的菌絲接種于裝有IOOmL菌體培養(yǎng)基的 500mL搖瓶中，在28°C，220rpm搖床上培養(yǎng)24h，得一次培養(yǎng)液；
[0029] 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比4%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一次 培養(yǎng)相同條件繼續(xù)培養(yǎng)20小時，得到菌體培養(yǎng)液；
[0030] 3)將去氫表雄酮及殼聚糖或其衍生物投入到菌體培養(yǎng)液中，去氫表雄酮的投料濃 度為Ag/L，殼聚糖或其衍生物的投料濃度為Bg/L，相同條件下轉(zhuǎn)化60小時放瓶。乙酸乙酯 提取轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物進行HPLC分析，計算DHEA轉(zhuǎn)化為7 α，15 a -diOH-DHEA的轉(zhuǎn)化率為
[0031]
【主權(quán)項】
1. 一種利用赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1 制備 3 β，7 α，15 α -三輕基雄 甾-5-烯-17-酮的方法，所述赤霉菌保藏編號為CGMCC No. 4903,其特征是所述方法包括以 下步驟： (1) 菌體培養(yǎng)液的制備，將保藏號為CGMCC No. 4903的赤霉菌（Gibberella intermedia) CA3-1作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)、菌體培養(yǎng)得到菌體培養(yǎng)液； (2) 生物轉(zhuǎn)化，向步驟（1)中的菌體培養(yǎng)液中加入富馬酰殼聚糖和DHEA，富馬酰殼聚糖 與菌體培養(yǎng)液的重量體積比為1 : 50?100, DHEA的終濃度為8.5?10g/L，在26?30°C 下，200?220r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36?60h，即得轉(zhuǎn)化液； (3) 產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到3β，7α，15α-三羥基雄 甾-5-烯-17-酮。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的富馬酰殼聚糖的取代度為0. 45?0. 48。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其組成為成 分及配比為：土豆淀粉200?500g/L ;葡萄糖30?50g/L ;酵母粉5?10g/L ;瓊脂粉15? 20g/L以及余量的蒸餾水； 所述用于菌體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為菌體培養(yǎng)基，所述菌體培養(yǎng)基的成分及配比為：葡萄 糖 20 ?50g/L ;NaCl 0· 5 ?2g/L ;酵母粉 10 ?30g/L ;Κ2ΗΡ040· 1 ?5. Og/L ;FeS04 · 7 H2OO. 01?0. lg/L ;及余量的蒸餾水，調(diào)培養(yǎng)基的pH至6. 5-7. 5。
4. 如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征是所述菌體培養(yǎng)液的制備工藝為： 斜面培養(yǎng)，將接種菌種的培養(yǎng)基斜面置于28-32?，培養(yǎng)3-5天，得到成熟的孢子菌絲， 菌體培養(yǎng)分為一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)兩步； 一次培養(yǎng)，用接種環(huán)挑斜面培養(yǎng)得到的一環(huán)菌絲接種于有80?120mL菌體培養(yǎng)基中， 在26?30°C下震蕩培養(yǎng)18-36h得到一次培養(yǎng)液； 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比3-6%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一次培 養(yǎng)相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)18_36h，得到菌體培養(yǎng)液。
【專利摘要】一種利用赤霉菌制備3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的方法，其特征是所述方法包括以下步驟：(1)菌體培養(yǎng)液的制備，將保藏號為CGMCC？No.4903的赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)、菌體培養(yǎng)得到菌體培養(yǎng)液；(2)生物轉(zhuǎn)化，向步驟(1)中的菌體培養(yǎng)液中加入富馬酰殼聚糖和DHEA，富馬酰殼聚糖與菌體培養(yǎng)液的重量體積比為1∶50～100，DHEA的終濃度為8.5～10g/L，在26～30℃下，200～220r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36～60h，即得轉(zhuǎn)化液；(3)產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到3β，7α，15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮。
【IPC分類】C12P33-06, C12R1-645, C12P33-12
【公開號】CN104561218
【申請?zhí)枴緾N201410624624
【發(fā)明人】張崢斌, 張汝金, 尹金玉, 高成華
【申請人】浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月9日