一種利用亞麻刺盤孢霉制備7α，15α-二羥基去氫表雄酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明留體化合物生物轉(zhuǎn)化方法具體的設(shè)計(jì)一種羥化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 屈螺酮是一種新型的孕激素，因其具有一定的鹽皮質(zhì)激素作用，在用于制備口服 短效避孕藥時(shí)，可以克服一般孕激素帶來的體重增加的副作用。7 α，15 α -二羥基去氫表雄 酮（即7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮，簡稱7 α，15 a -diOH-DHEA，CAS :2963-69-1)則是生 產(chǎn)屈螺酮的重要中間體，因合成困難，一般采用或去氫表雄酮（DHEA)生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)。
[0003] 中國專利CN102703558B公開了一種采用亞麻刺盤孢霉（Colletotrichum Iini) ST-I (保藏編號為CGMCC No. 6051)將DHEA轉(zhuǎn)化為7 α -羥基-去氫表雄酮和7 α，15 α -二 羥基去氫表雄酮和轉(zhuǎn)化方法，采用了將底物與等摩爾比的甲基-β -環(huán)糊精預(yù)包合后再投 料的方式，并生成能夠提高了底物的溶解度和轉(zhuǎn)化效率，經(jīng)過我們實(shí)驗(yàn)方法，這種方法對于 菌種有很高的選擇性，即不同的菌種在處理甲基-β -環(huán)糊精預(yù)包合的底物時(shí)，結(jié)果并不一 致，當(dāng)采用亞麻刺盤孢霉處理甲基-環(huán)糊精預(yù)包合的底物時(shí)效果并不好，且該方法得到 的產(chǎn)物為7 α -羥基去氫表雄酮與7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮的混合物，根據(jù)該專利公開 數(shù)據(jù)，在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中僅有60%為7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮，且這兩種產(chǎn)物分離較為困 難。
[0004] 中國專利CN 102757997Α公開了一種采用底物誘導(dǎo)法制備7 α，15α -二羥基雄甾 烯酮（即7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮）的方法，分次添加底物，使底物的最終添加濃度達(dá) 到8-10g/L，并能將轉(zhuǎn)化率提高到90%左右，然而經(jīng)過我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種方法需要延長總 發(fā)酵時(shí)間，從而影響生產(chǎn)效率，且該方法中采用的接種量為8-10%，較大的接種量實(shí)際上也 會制約生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大。
[0005] 因此在采用亞麻刺盤孢霉將DHEA轉(zhuǎn)化為7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮的生物發(fā) 酵中，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，提高底物的轉(zhuǎn)化率和投料濃度，成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問 題

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的利用亞麻刺盤孢霉制備 7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮的方法，在研宄中為我們驚奇的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中通常被用作 抑菌劑的某種殼聚糖衍生物，能夠意外的提高亞麻刺盤孢霉發(fā)酵制備7 α，15 α -二羥基去 氫表雄酮時(shí)的轉(zhuǎn)化率和投料濃度。
[0007] 本發(fā)明提供了一種利用亞麻刺盤孢霉（Colletotrichum lini)ST_l制備7 α， 15 α -二羥基去氫表雄酮的方法，所述亞麻刺盤孢霉保藏編號為為CGMCC No. 6051， 所述方法包括以下步驟⑴孢子培養(yǎng)，將保藏號為CGMCC No. 6051的亞麻刺盤孢霉 (Colletotrichum lini) ST-I作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)得到成熟孢子；
[0008] (2)菌體培養(yǎng)，步驟⑴得到的孢子接種到的菌體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌體培養(yǎng)得到菌 體培養(yǎng)液；
[0009] (3)生物轉(zhuǎn)化，向步驟⑴中的菌體培養(yǎng)液中加入羧甲基油酰殼聚糖和DHEA，DHEA 的終濃度為10. 5?12g/L，羧甲基油酰殼聚糖和DHEA的重量比為2?3 : 1，在28?30°C 下，200?220 r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36?60h，即得轉(zhuǎn)化液。
[0010] (4)產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到7α，15α-二羥基去氫表雄 酮。
[0011] 所述的羧甲基油酰殼聚糖的羧甲基取代度為0.58?0.62,油?；〈葹?0. 08 ?0. 09。
[0012] 所述的方法，其特征是斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其組成為成分及配比為： 土豆淀粉200?500g/L ;葡萄糖30?50g/L ;酵母粉5?10g/L ;瓊脂粉15?20g/L以及 余量的蒸餾水；
[0013] 所述的方法，其特征是所述用于菌體培養(yǎng)的菌體培養(yǎng)基的成分及配比為：葡萄糖 10?15g/L ;豆餅粉8?15g/L，酵母粉10?15g/L ;玉米漿2?3g/L ;及余量的蒸餾水； [0014] 所述的方法，其特征是
[0015] 所述步驟（1)的工藝為：將亞麻刺盤胞菌（Colletotrichum lini) ST-I按活化 后，接種到斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，置于28-32?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行斜面培養(yǎng)得到成熟的孢 子，培養(yǎng)時(shí)間3?5天。
[0016] 所述步驟（2)的菌體培養(yǎng)工藝分為為一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)；
[0017] -次培養(yǎng)，將步驟（1)得到的孢子接種于80?120mL菌體培養(yǎng)基中，在28?30°C 下振蕩
[0018] 培養(yǎng)18-36h得到一次培養(yǎng)液；
[0019] 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比3-5%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一 次培養(yǎng)相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)18_36h，得到菌體培養(yǎng)液。
[0020] 所述的方法，其特征是依發(fā)酵規(guī)模不同，二次培養(yǎng)可以分多次進(jìn)行。每次接種均采 用上一次培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液，接種量為體積百分比3-5%，用于生產(chǎn)菌體培養(yǎng)液。
[0021] 殼聚糖（chitosan)又稱脫乙酰甲殼素，是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)（chitin) 經(jīng)過脫乙酰作用得到的，殼聚糖具有一定增溶作用，但因其也具有抑菌作用，因此一般不在 生物發(fā)酵領(lǐng)域使用，參考文獻(xiàn)1 一一 "殼級糖的化學(xué)改性及其衍生物的抑菌活性研宄"（馮 永巍，江南大學(xué)博士論文，2011年6月）中公開了對殼聚糖進(jìn)行化學(xué)改性得到的苯甲酰殼聚 糖、對羥基苯甲酰殼聚糖、富馬酰殼聚糖等殼聚糖衍生物，參考文獻(xiàn)2-一"兩種水溶性殼聚 糖衍生物的制備與抑菌性能研宄"（孟祥君，河北大學(xué)碩士論文，2012年5月）中也公開了 羧甲基殼聚糖及羧甲基油酰殼聚糖等殼聚糖衍生物，我們經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驚奇的發(fā)現(xiàn)，羧甲基油 酰殼聚糖在用于本發(fā)明所提及的亞麻刺盤孢霉羥化發(fā)酵時(shí)時(shí)，能夠顯著的提高底物在較高 投料濃度下轉(zhuǎn)化率，而殼聚糖及其他殼聚糖衍生物均無此效果。而且對于采用其他菌種進(jìn) 行羥化發(fā)酵時(shí)，加入羧甲基油酰殼聚糖也無此作用，且本發(fā)明提供的方法，將降低了菌種培 養(yǎng)液的接種量，更有利于發(fā)酵規(guī)模的擴(kuò)大。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于 說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 菌種：亞麻刺盤孢霉（Colletotrichum lini) ST-1，保藏編號 CGMCC No. 6051
[0024] 底物原料：去氫表雄酮（DHEA)，含量98 %，
[0025] 富馬酰殼聚糖、對羥基苯甲酰殼聚糖、苯甲酰殼聚糖均按參考文獻(xiàn)1 一一殼聚糖的 化學(xué)改性及其衍生物的抑菌活性研宄（馮永巍，江南大學(xué)博士論文，2011年6月）中公開 的方法制備得到，其中羧甲基油酰殼聚糖的取代度為〇. 45?0. 48,苯甲酰殼聚糖的取代度 為1. 2-1. 3,對羥基苯甲酰殼聚糖的取代度為1. 2-1. 3，
[0026] 羧甲基殼聚糖及羧甲基油酰殼聚糖均按參考文獻(xiàn)2-一 "兩種水溶性殼聚糖衍生 物的制備與抑菌性能研宄"（孟祥君，河北大學(xué)碩士論文，2012年5月）中公開的方法制備 得到，其中羧甲基殼聚糖的取代度為〇. 85?0. 90。羧甲基油酰殼聚糖中，羧甲基取代度為 0. 58?0. 62,油?；〈葹?. 08?0. 9
[0027] 殼聚糖的脫乙酰度>大于90%。
[0028] PDA培養(yǎng)基的配比為：土豆淀粉300g/L ;葡萄糖40g/L ;酵母粉7g/L ;瓊脂粉17g/ L以及余量的蒸餾水；pH自然，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0029] 菌體培養(yǎng)基的配比為：葡萄糖10g/L ;豆餅粉15g/L，酵母粉10g/L ;玉米漿3g/L ; 及余量的蒸餾水，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0030] 步驟
[0031] (1)孢子培養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)室_80°C保存的菌種甘油管，加入到IOmL的菌體培養(yǎng)基進(jìn)行 活化培養(yǎng)。再轉(zhuǎn)接到置于250mL錐形瓶中的30mL菌體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2天得種子液，將該 種子液劃線于PDA培養(yǎng)基，將接種菌種的PDA斜面置于30°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4天，得 到成熟的孢子菌絲；
[0032] ⑵菌體培養(yǎng)，分為一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)，其中一次培養(yǎng)工藝為，用接種環(huán)挑一環(huán) 斜面培養(yǎng)得到的孢子菌絲接種于裝有IOOmL菌體培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，在28°C，220rpm 搖床上培養(yǎng)24h，得一次培養(yǎng)液；
[0033] 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比5%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一次 培養(yǎng)相同條件繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，得到菌體培養(yǎng)液；
[0034] 3)將去氫表雄酮及殼聚糖或其衍生物投入到菌體培養(yǎng)液中，去氫表雄酮的投料濃 度為Ag/L，殼聚糖或其衍生物的投料濃度為Bg/L，相同條件下轉(zhuǎn)化48小時(shí)放瓶。乙酸乙酯 提取轉(zhuǎn)化液中的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算DHEA轉(zhuǎn)化為7 α，15 a -diOH-DHEA的轉(zhuǎn)化率為
[0035]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用亞麻刺盤孢霉（Colletotrichum lini) ST-I制備7 α，15 α -二羥基去氫 表雄酮的方法，所述亞麻刺盤孢霉保藏編號為為CGMCC No. 6051，所述方法包括以下步驟 (1) 孢子培養(yǎng)，將保藏號為CGMCC No. 6051的亞麻刺盤孢霉（Colletotrichum Iini) ST-I作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)得到成熟孢子； (2) 菌體培養(yǎng)，步驟（1)得到的孢子接種到的菌體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌體培養(yǎng)得到菌體培 養(yǎng)液； (3) 生物轉(zhuǎn)化，向步驟⑴中的菌體培養(yǎng)液中加入羧甲基油酰殼聚糖和DHEA，DHEA的終 濃度為10.5?12g/L，羧甲基油酰殼聚糖和DHEA的重量比為2?3 : 1，在28?30°C下， 200?220r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36?60h，即得轉(zhuǎn)化液； (4) 產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到7 α，15 α -二羥基去氫表雄酮。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的羧甲基油酰殼聚糖的羧甲基取代度為 0. 58?0. 62,油?；〈葹?. 08?0. 09。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其組成為成 分及配比為，土豆淀粉200?500g/L，葡萄糖30?50g/L，酵母粉5?10g/L，瓊脂粉15? 20g/L以及余量的蒸餾水；用于菌體培養(yǎng)的菌體培養(yǎng)基的成分及配比為，葡萄糖10?15g/ L，豆餅粉8?15g/L，酵母粉10?15g/L，玉米衆(zhòng)2?3g/L及余量的蒸餾水。
4. 如權(quán)利要求1?3任一所述的方法，其特征是 所述步驟（1)的工藝為：將亞麻刺盤胞菌（Colletotrichum lini) ST-I按活化后，接 種到斜面培養(yǎng)的培養(yǎng)基上，置于28-32?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行斜面培養(yǎng)得到成熟的孢子，培 養(yǎng)時(shí)間3?5天。 所述步驟（2)的菌體培養(yǎng)工藝分為為一次培養(yǎng)和二次培養(yǎng)； 一次培養(yǎng)，將步驟（1)得到的孢子接種于80?120mL菌體培養(yǎng)基中，在28?30°C下振 蕩培養(yǎng)18-36h得到一次培養(yǎng)液； 二次培養(yǎng)，將一次培養(yǎng)液以體積百分比3-5%的接種量接入菌體培養(yǎng)基中，以與一次培 養(yǎng)相同的條件繼續(xù)培養(yǎng)18_36h，得到菌體培養(yǎng)液。
【專利摘要】一種利用亞麻刺盤孢霉制備7α，15α-二羥基去氫表雄酮的方法，所述方法包括以下步驟(1)孢子培養(yǎng)，亞麻刺盤孢霉ST-1作為生產(chǎn)菌種，經(jīng)斜面培養(yǎng)得到成熟孢子；(2)菌體培養(yǎng)，步驟(1)得到的孢子接種到的菌體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌體培養(yǎng)得到菌體培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化，向步驟(1)中的菌體培養(yǎng)液中加入羧甲基油酰殼聚糖和DHEA，DHEA的終濃度為10.5～12g/L，羧甲基油酰殼聚糖和DHEA的重量比為2～3∶1，在28～30℃下，200～220r/min的攪拌轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化36～60h，即得轉(zhuǎn)化液；(4)產(chǎn)物提取，將轉(zhuǎn)化液用乙酸乙酯提取濃縮，得到7α，15α-二羥基去氫表雄酮。
【IPC分類】C12R1-645, C12P33-06
【公開號】CN104561216
【申請?zhí)枴緾N201410625399
【發(fā)明人】張崢斌, 張汝金, 尹金玉, 高成華
【申請人】浙江仙居君業(yè)藥業(yè)有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年11月9日