專利名稱：一種新的植物外源凝集素基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物抗蟲基因工程及生物化學領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一個新克隆的莧菜ACA基因及在植物中表達的重組質(zhì)粒，可進行植物轉(zhuǎn)化以構(gòu)建具有抗蚜蟲特性的轉(zhuǎn)基因植物；同時通過構(gòu)建ACA基因高效，穩(wěn)定表達的微生物表達載體，可利用微生物獲得ACA蛋白。
ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)是南美大陸一種營養(yǎng)價值高的莧菜的種子[1]中存在的一種植物凝集素，是一種貯藏蛋白，在種子萌發(fā)時提供營養(yǎng)。該蛋白只在胚乳形成時大量合成，在營養(yǎng)器官中不合成。GenBank中已經(jīng)報道了ACA蛋白氨基酸序列(Accession No.g2781234)。用純化的蛋白在體外喂飼豌豆蚜的實驗結(jié)果表明ACA對所試蚜蟲有很高的抑制或毒殺作用[2]。該凝集素蛋白在腫瘤細胞的特異性識別，組織化學鑒定及腫瘤的早期診斷上有重要作用[3]。隨著對植物凝集素的功能進一步闡明及對其在醫(yī)學，生物學方面的潛在應(yīng)用價值的了解，克隆ACA基因?qū)ρ芯亢蛻?yīng)用該凝集素有重要意義。雖然在體外抗蟲試驗中，ACA表現(xiàn)出很好的抗蚜蟲作用，但它在轉(zhuǎn)基因植物中是否有相同的功能還有待實驗證實。另外ACA蛋白作為一種富含必需氨基酸的蛋白質(zhì)在改善作物品質(zhì)上也會有重要作用。同時體外方便地獲得大量的ACA蛋白可為腫瘤的檢測提供充足的材料。
基于以上情況，本發(fā)明的目的是提供一種可獲得ACA的新的結(jié)構(gòu)基因，重組質(zhì)粒，及在微生物和植物中表達的重組質(zhì)粒。
為了獲得ACA的基因組結(jié)構(gòu)基因，以莧菜總DNA為模板進行PCR，首次獲得了ACA結(jié)構(gòu)基因。這個基因含有2628bp，有一個1716bp的內(nèi)含子和兩個分別為212bp和700bp的外顯子。由其核苷酸序列推導出的氨基酸序列與已發(fā)表ACA蛋白的序列相比有很高的同源性。構(gòu)建了能在植物體中具有組成型表達的重組質(zhì)粒。其優(yōu)點是在所得的轉(zhuǎn)基因植株各組織中能表達ACA蛋白。為特定的目的，也可用組織特異型啟動子驅(qū)動ACA基因在特定組織中表達。表達ACA蛋白的轉(zhuǎn)基因植株可能會獲得很好的抗蚜蟲活性，同時由于ACA中必需氨基酸含量豐富，所以在植物中表達該蛋白還有助于改善植物的營養(yǎng)價值。利用ACA基因構(gòu)建高效，穩(wěn)定表達的微生物表達載體，可利用微生物大量合成ACA，該蛋白在腫瘤的檢測中也會有一定的應(yīng)用價值。
本發(fā)明通過基因工程手段，首次克隆了ACA基因，從而為實現(xiàn)ACA的生產(chǎn)以及在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學等方面的應(yīng)用提供可能。
為了達到上述目的，實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下以莧菜品種Amaranthus caudatus的種子或葉組織提取的總DNA為模板，根據(jù)與ACA蛋白有高度同源的另一種莧菜Amaranthus hypochondriacus的AmA1蛋白基因的序列設(shè)計并合成一對引物[4]，通過PCR擴增ACA結(jié)構(gòu)基因，并克隆了該基因。將純化的PCR產(chǎn)物連接到pUC18載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia.coli)DH5α，獲得含ACA結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒pACA及其大腸桿菌(e.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子(pACA/DH5α)已交中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保存，保存的微生物命名為pACAg，編號為CGMCC NO.0438。以重組質(zhì)粒pACA為模板，利用反向PCR技術(shù)，設(shè)計特異的引物，擴增出ACA cDNA的編碼區(qū)DNA片段，與載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α，獲得了重組質(zhì)粒pACAc及其大腸桿菌(E.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子。從重組質(zhì)粒pACAc或pACA中分離出含有ACA結(jié)構(gòu)基因的DNA片段，分別連接到植物組成型表達載體pBin438，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α，獲得能在植物中組成型表達的重組質(zhì)粒pBACAc和pBACA及大腸桿菌(E.coli)DH5α轉(zhuǎn)化子。從上述轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒pBACAc和pBACA，轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌(Agrobacterium.tumefacieus)LBA4404。分別獲得土壤桿菌(A.tumefacieus)轉(zhuǎn)化子pBACAc/LBA4404和pBACA/LBA4404。同時從重組質(zhì)粒pACAc分離含有ACA結(jié)構(gòu)基因DNA片段，連接到大腸桿菌表達載體pET30a(+)，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)，獲得能在大腸桿菌中表達的重組質(zhì)粒pEACAc和大腸桿菌轉(zhuǎn)化子pEACAc/BL21(DE3)。對大腸桿菌轉(zhuǎn)化子pEACAc/BL21(DE3)進行了誘導表達，獲得了特異的ACA蛋白。
實施例1.莧菜Amaranthus caudatus總DNA的提取植物材料為美國IOWA州立大學區(qū)域植物引種站提供的莧菜(Amaranthus caudatus)。DNA提取方法參照文獻5。取莧菜葉片或正在成熟種子200mg，液氮研磨后，加入1ml冰預冷的DNA提取緩沖液
，充分混勻后，4℃離心2700Xg 10分鐘，去上清。在沉淀中加入500ul細胞核裂解緩沖液
，重新懸浮沉淀物，于65℃水浴30分鐘。加入等體積的氯仿-異戊醇(24∶1)抽提，10000rpm離心，取上清。加入0.6倍體積的預冷的異丙醇沉淀。12000rpm離心沉淀，70％乙醇洗一次，干燥后溶于50ul滅菌水中，-20℃保存。
2.ACA基因的PCR擴增在20ul的PCR體系中，加入1ul約50ng莧菜總DNA，2ul 10x擴增緩沖液，2ul dNTP(每種NTP終濃度為10mmol/L)，2ul引物(終濃度為10pmol/ul)Taq Plus I(2.5Units)，加水至20ul。在反應(yīng)混合物的液面上加適量礦物油以防止蒸發(fā)。
5’端引物序列5’GGAAGATCTACCATGGCGGGATTACCAGTG 3’3’端引物序列5’AGCGTCGACTTAGTTGTTGGATCCCAATTC 3’PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘預變性，然后以94℃1分鐘，49℃1分鐘，72℃1分30秒反應(yīng)，30個循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物在電泳分析中有兩條DNA擴增帶，分子量分別約為2.5kb和0.9kb。分別回收(用上海華順DNA回收試劑盒回收)，溶于30ul滅菌水中。
3.ACA基因的克隆及序列分析基因克隆和序列分析參照文獻6。取回收的PCR產(chǎn)物10ul與1ul來自于pUC18的T載體在20ul的連接體系中連接，其中含2ul 10x連接緩沖液，10ul PCR回收產(chǎn)物，1ul載體，1ul T4連接酶，6ul滅菌水。連接體系在14℃-16℃反應(yīng)12小時，取8ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α后，涂于含50mg/L Amp(氨芐青霉素)的LB固體培養(yǎng)基上。利用藍白斑法篩選陽性克隆。對于陽性克隆用堿法提取質(zhì)粒，進一步酶切鑒定后，用Pharmacia T7測序試劑盒測序。結(jié)果顯示插入片段約2.6kb含ACA基因。質(zhì)粒構(gòu)建過程見

圖1，質(zhì)粒命名為pACA。最后經(jīng)ABI377測序儀完成全序列測定，序列結(jié)果見圖2A-C。序列分析表明該基因共有2628bp，含1716bp內(nèi)含子和兩個分別為212bp和700bp的外顯子。ACA核基因的結(jié)構(gòu)見權(quán)利要求1和圖3。
4.反向PCR獲得編碼區(qū)ACA基因序列根據(jù)ACA基因的序列，設(shè)計兩對引物分別與內(nèi)含子相鄰的外顯子互補，其序列為5’端序列5’GTGGTCTCCCAATCATTATTG 3’3’端序列5’CTAACCAAATATTTGTTAGTG 3’反向PCR體系含有1ul dNTP(每種dNTP各為10mmol/L)，5’端引物和3’端引物各1ul(25pmol/ul)；堿法制備的pACA質(zhì)粒稀釋500倍，取1ul做PCR模板；10X PCR緩沖液2ul，pfu Taq酶0.4ul(5Unit/ul)，加水至20ul.PCR反應(yīng)條件為94℃3分鐘預變性，94℃50秒，58℃50秒，72℃2.5分鐘，30個循環(huán)，最后72℃10分鐘。PCR產(chǎn)物電泳分析顯示一條3.5kb的DNA片段，純化PCR產(chǎn)物，T4 DNA多核苷酸激酶進行磷酸化，乙醇沉淀后溶于20ul滅菌水中。
5.ACA編碼區(qū)序列的克隆及序列分析取10ul上述純化產(chǎn)物，加入2ul 10x連接酶緩沖液，1ul T4 DNA連接酶(1Unit/ul)，7ul滅菌水至總體積20ul。連接反應(yīng)在14℃-16℃反應(yīng)12小時，取8ul轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α后，涂于含50mg/LAmp的LB固體培養(yǎng)基上，挑取轉(zhuǎn)化子，堿法制備質(zhì)粒，NcoI和SalI酶切，產(chǎn)物約為900bp。ABI 377測序儀測序結(jié)果證明拼接正確，質(zhì)粒命名為pACAc。在pACAc中ACA基因的序列見圖2A-C(大寫字母表示)。ACA基因編碼的氨基酸序列與已發(fā)表的ACA序列的比較見圖4。
6.含ACA基因編碼區(qū)的植物表達載體和重組農(nóng)桿菌的制備。
BglII和SalI雙酶切質(zhì)粒pACAc，回收ACA結(jié)構(gòu)基因片段與BamHI酶切，SalI酶切的載體pBin438[7]片段連接，即得重組質(zhì)粒pBACAc，整個構(gòu)建過程見圖5。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化凍存感受態(tài)細胞DH5α后，涂于含50mg/L Kan(卡那霉素)的固體LB平板上。利用酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒pBACAc。用堿法提純的質(zhì)粒pBACAc轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌LBA4404感受態(tài)細胞，涂于50ug/ul Kan，50ug/ul Rif(利福平)，50ug/ulStr(鏈霉素)的YEP固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行PCR檢測及酶切分析后獲得含pBACAc的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化子。
7.含ACA基因的植物表達載體構(gòu)建。
外源基因為來自pACA的ACA基因片段，NcoI酶切質(zhì)粒pACA，Klenow酶補平，SalI酶切，回收2.6kb的基因片段，與BamHI酶切，Klenow酶補平，SalI酶切的載體pBin438片段連接即得重組質(zhì)粒pBACA，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，利用酶切和PCR方法鑒定轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒pBACA。根癌土壤桿菌制備方法同以上6中所述。除利用CaMV 35S啟動子外，還可以利用組織特異性的啟動子或其它類型的啟動子與ACAc或ACA構(gòu)建植物表達載體。pBACA的構(gòu)建過程見圖6。
8.含ACAc基因的大腸桿菌表達載體的構(gòu)建和表達NcoI，SalI酶切質(zhì)粒pACAc，回收約0.9kb片段與同樣雙酶切的表達載體pET30a(+)連接。轉(zhuǎn)化篩選重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，該重組質(zhì)粒命名為pEACAc。按文獻[8]提供的方法誘導表達。細菌接種于卡那霉素濃度為50ug/ul的LB培養(yǎng)基中于37℃，250rpm條件下培養(yǎng)。當細菌培養(yǎng)達到OD＝0.2時，加入IPTG，終濃度為1mmol/L，誘導表達3小時。誘導產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，蛋白分子量標準為BioLab公司的預染蛋白分子量標準。大腸表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳[9]結(jié)果顯示在含有重組質(zhì)粒pEACAc的大腸表達產(chǎn)物中有一條分子量為36KD的特異的蛋白(1泳道)，而對照菌中則無此蛋白(2泳道)。說明該蛋白在大腸桿菌中獲得表達。表達蛋白經(jīng)過掃描后計算約占總蛋白的35％。電泳結(jié)果如圖7。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步詳細描述。
圖1ACA基因重組質(zhì)粒pACA構(gòu)建模式圖(Amp氨芐青霉素抗性)圖2A-CACA基因全序列，小字母代表內(nèi)含子的堿基序列圖3ACA基因結(jié)構(gòu)示意圖，圖上方的數(shù)字表示有關(guān)部分的大小(以bp表示)圖4ACA基因推導的氨基酸序列和ACA蛋白測序所得氨基酸序列同源性比較(ACA.PROACA蛋白質(zhì)氨基酸序列；ACAc.PRO本發(fā)明克隆的ACA基因推導的氨基酸序列；方框內(nèi)氨基酸表示兩序列中不同的氨基酸)圖5ACA植物表達載體pBACA構(gòu)建模式圖(NPTII新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因35S帶雙增強子的CaMV35S啟動子；NOS胭脂堿合成酶基因轉(zhuǎn)錄終止子LBTi質(zhì)粒左邊界序列；RBTi質(zhì)粒右邊界序列)圖6ACA基因編碼區(qū)植物表達載體pBACAc構(gòu)建模式圖(KlKlenowDNA聚合酶)圖7ACA蛋白大腸桿菌表達產(chǎn)物SDS-PAGE電泳圖(M分子量標準；1pEACAc/BL21(DE3)；2對照pET30a/BL21(DE3)；箭頭所指示的帶為表達的目的蛋白ACA)附注LB培養(yǎng)基5g/NaCl；10g/Trypton；5g/Yeast extract；PH7.0；12g/L瓊脂；15磅滅菌30分鐘
YEP培養(yǎng)基5g/L NaCL；10g/L Trypton；10g/L Yeast Extract；PH7.0，12g/L瓊脂，15磅滅菌30分鐘主要參考文獻1.Vietmeyer，N et al(1986).Sciences 232，1379-13842.Rahbe Y，Sauvion N，F(xiàn)ebvay G et al 1995，Ento Exp App，76143-1553.Boland，C et al.(1991).Cancer Res.51，657-6654.Anjana R et al.(1992).PNAS.Vol(89).11774-117785.Paterson AH，Brubaker CL，Wendel JF et al Plant Mol.Biol.Reporter，(1993)11(2)122-1276.薩姆布呂克等，分子克隆實驗指南，第二版，北京科學出版社，19937.李太元等，中國科學B輯，(1994)24276-2828.A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-Tagedprotein。Qiagene Company9.Laemmli UK.1970.Nature 227680-68權(quán)利要求
1.一種莧菜凝集素ACA結(jié)構(gòu)基因，其特征在于該基因含有一個內(nèi)含子和兩個外顯子。具有如下式所示的2628bp的核苷酸序列。1ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTACACTAACAAATATTTGGTTAGgtacgttttttttcgcgtttatacttcctccgtttcaatatagtcgcaatatatcgaaaataaacactattcacttatctcctttaatttgtgattgataagtaatttataagttaaaacatagtcaactgagatcttgtttgattcatctcgacgtaaagattattaatatcaaatttttataattttatattatacataattgtagttattaatgattgaattagtacattagactgcgtgaaaaaggcatatgttgtaagtattttggaacgaaggtagtgttatatttcttctgttagtctatttaaaatttgcgatatttaaattaaatatttaagatttttttgagttacatgtttcaaattctggagtgagtacgtactttaagtatacttttgtactagctaccatttgattgacataattaataaatgggaaattccacatggtagcatctagttttgatgaaatgccagtggtgacacttttttaagaaaattccacatgctagcattcagtttatacactatctaattgccgtagcattttccgttaagttcttgttaaattccactaaatttatcattttgtaagtttttttccacatggtagtatccagtttttgttaatttatcattttaactcttaattcaccattttaatgtttaattcactatttaattcattaacgctcataagtgttagatatttttattgaaaaattataagaaactatctaatcgggtcgaaacaagaacttattcgcctatttttcgatacgtaaaccggaaaagatatttggcgtcatttttacctatcataacgatttttttcaataaacggacgttgcaattacccttatgggataactctttcgaaaatccggtcgaaacaagtacttattcgcctattttccgatagatgtgttcaagaaaatgggacaactaaatagattcagagggagtatttcggagtaattatgttgacaaaattatacttgaactaatagctacggtgatgcttgttcaatttcactgattttgtacaatcataaagtttcttgatcacatttccaaaaaaatgaaagttaagtggcaaaaaatatgtgaatataaaatttgacaagtctaatttaaaattttcactaattttttttaataaaacgaaatacaacataatatatttttattgagatatattttgtgaaatttaatttaaatgtcaccactataaatttgtaatggtacatatagttgatttagttacatttattagaccttctagctgcataattaaaatcatactaaagctttttcctgagatagaatctaatgatatttctcatatgccggcatgcaaccaaataaagtgttactatataaattactaaagtagcgacattttttaatgttgcaaaaagaaaattttgtttagtgacggtcttatagtgtgactatctctattgggcagacatatgtacatttagtatgaaatgatcacttataattttaaagtaatacaattacagagtgacttgtttacaatgaatttgtgtttttgtccagcaagtcttttaatgagagacgtctcttagatctaatccattagagtttaattcttactcttattctatatttttctttatgggtcacccaattagagttggtatctcaaagagaccgtctctcacaagaatttgcgtttttgtcttagGTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACT2628GCTATTTTAGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩個外顯子外顯子1和外顯子2，分別具有如下式所示的212bp和700bp的核苷酸序列。外顯子11ATGGCGGGATTACCAGTGATTATGTGCCTAAAATCAAATAACAACCAGAAGTACTTAAGATATCAAAGTGATAATATTCAACAATATGGTCTTCTTCAATTTTCAGCTGATAAGATTTTAGATCCATTAGCTCAATTTGAAGTCGAACCTTCCAAGACTTATGATGGTCTTGTTCACATCAAATCTCGCTAC212ACTAACAAATATTTGGTTAG外顯子21929GTGGTCTCCCAATCATTATTGGATTACAGCATCAGCCAATGAACCAGATGAAAATAAAAGCAATTGGGCATGCACATTATTCAAACCACTTTACGTAGAAGAAGGTAACATGAAAAAGGTTCGACTTTTGCACGTCCAATTAGGTCATTATACACAGAATTATACCGTTGGTGGGTCCTTCGTATCATACTTATTTGCCGAATCAAGTCAAATTGATACCGGCTCTAAAGACGTATTCCATGTCATAGATTGGAAATCAATCTTTCAATTTCCCAAAAGATATGTCACATTTAAAGGAAATAATGGAAAATATTTAGGGGTTATCACAATTAATCAACTTCCATGTCTACAATTTGGGTATGATAATCTTAATGATCCAAAGGTGGCTCATGAAATGTTTGTCACTTCTAATGGTACTATTTGCATTAAATCCACTTATATGAACAAGTTTTGGAGACTCTCTACGGATGATTGGATATTAGTCGATGGGAATGATCCTCGCGAAACTAATGAAGCTGCAGCGTTGTTTAGGTCAGATGTGCATGATTTTAATGTGATTTCGCTTTTGAACATGCAAAAAACTTGGTTTATTAAGAGATTTACGAGTGGTAAGCCTGGGTTTATAAATTGTATGAATGCAGCTACTCAAAATGTTGATGAAACTGCTATTTT2628AGAGATAATAGAATTGGGATCCAACAAC
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩個外顯子推測其編碼的氨基酸序列如下1M A G L P V I M C L K S N N N Q K Y L R Y Q S D N I Q Q Y GL L Q F S A D K I L D P L A Q F E V E P S K T Y D G L V H IK S R Y T N K Y L V R W S P N H Y W I T A S A N E P D E N KS N W A C T L F K P L Y V E E G N M K K V R L L H V Q L G HY T Q N Y T V G G S F V S Y L F A E S S Q I D T G S K D V FH V I D W K S I F Q F P K R Y V T F K G N N G K Y L G V I TI N Q L P C L Q F G Y D N L N D P K V A H E M F V T S N G TI C I K S T Y M N K F W R L S T D D W I L V D G N D P R E TN E A A A L F R S D V H D F N V I S L L N M Q K T W F I K RF T S G K P G F I N C M N A A T Q N V D E T A I L E I I E L304G S N N
4.一種重組質(zhì)粒，它是含有權(quán)利要求1所述的ACA基因序列的pACA質(zhì)粒。
5.一種重組質(zhì)粒，它是含有權(quán)利要求2所述的ACA基因僅含外顯子序列的pACAc質(zhì)粒。
6.一種重組微生物，它含有權(quán)利要求4，5所述的重組質(zhì)粒pACA或pACAc。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組微生物，它是大腸桿菌Escherichia.coliDH5αCGMCCNo.0438。
8.一種重組質(zhì)粒，它是由權(quán)利要求1或2所述的ACA基因序列與二元表達載體pBin438構(gòu)建而成的植物表達載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物表達載體，它們分別是如圖5或圖6所示的pBACA和pBACAc。
10.一種重組質(zhì)粒，它是由權(quán)利要求2所述的ACA外顯子序列ACAc與大腸桿菌表達載體pET30a(+)構(gòu)建而成。
11.一種按權(quán)利要求10所述的重組質(zhì)粒是pEACAc。
12.一種重組微生物，含有pBACA重組質(zhì)?；騪BACAc重組質(zhì)粒。
13.一種重組微生物，含有pEACA重組質(zhì)粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的重組微生物是根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefacieus)LBA4404或大腸桿菌Escherichia.coliDH5α。
15.由權(quán)利要求9所述的植物表達載體pBACA或pBACAc在轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
16.由含ACA編碼區(qū)序列的大腸桿菌表達載體pEACAc在細菌中表達產(chǎn)生的ACA凝集素蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供來源于Amaranthus caudatus含有內(nèi)含子的莧菜凝集素ACA(Amaranthus caudatus agglutinin)基因的克隆及編碼ACA蛋白的編碼區(qū)基因序列。將上述的ACA編碼區(qū)基因序列轉(zhuǎn)化到高效、穩(wěn)定表達的微生物表達載體中,可利用微生物大量合成ACA蛋白。ACA基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達可使轉(zhuǎn)基因植物獲得抗蚜蟲作用,同時提高其營養(yǎng)品質(zhì),在植物抗蟲基因工程和品質(zhì)改良中有潛在的應(yīng)用價值。
文檔編號C07K14/415GK1353187SQ0013342
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者田穎川, 周永剛 申請人:中國科學院微生物研究所