專利名稱：人同源盒基因LHX4全長cDNA序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人同源盒基因序列，具體涉及人同源盒基因LHX4的全長cDNA序列。
同源盒基因(homeobox gene)是1983年在瑞士Gehring實驗室發(fā)現(xiàn)的一類基因，它們因在其基因外顯子3′端共同具有一段長180個堿基對、高度保守的同源盒序列而得名，同源盒基因的表達產(chǎn)物是一類重要的轉錄因子，是發(fā)育的主控基因。由這段序列所翻譯出的蛋白質更具保守性，并富含堿性氨基酸，因此稱為同源盒區(qū)(homeodomain)。LIM同源盒基因(LIM homeoboxgene)屬于同源盒基因家族，它不僅具有同源盒結構，而且含有兩個富含半胱氨酸和組氨酸的LIM結構域。LIM結構域的名稱是由LIM家族中三個基因Lin-11(線蟲)、Isl-1(鼠)和Mec-3(線蟲)名稱的首字母縮寫而成。LIM同源盒轉錄因子(LIM homeodomain transcription factor，LIM-HD)是指LIM同源盒基因的蛋白質表達產(chǎn)物，大多表達在神經(jīng)系統(tǒng)，具有早期特征的的形成及后期調控組織特異性基因的表達等功能，因而這些基因決定脊柱和非脊柱動物發(fā)育中組織和細胞特異性分化。
LHX4基因(LIM homeobox gene 4)屬于LIM同源盒基因家族。1994年，美國Hung Li等人依據(jù)同源盒區(qū)最保守的氨基酸序列“KIWFQNRR”設計了一個含有編碼同源盒序列羧基端14個氨基酸序列的基因克隆，然后用這段基因序列去篩選小鼠胚胎cDNA文庫后得到一個1196bp的cDNA陽性克隆。這個克隆含有一段編碼170個氨基酸的翻譯區(qū)，它的位置從3′poly-A一直延伸到homeobox的5′端，因而它與LHX3有較高的同源性而命名為LHX4(Li Hung，Witte DP，Branford WW et al.Gsh-4 encodes a LIM-typehomeodomain is expressed in the developing central nervous system and isrequired for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885)。但由于LHX4基因在機體內的表達量很低，此后國內外一直沒有獲得小鼠或其他物種LHX4基因的cDNA全長序列。
本發(fā)明的目的是提供一種可以在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中得到表達的人LHX4基因的cDNA全長序列。
本發(fā)明的發(fā)明人以LHX4 pBluescript質粒(Li H，Witte DP，Branford WWet al.Gsh-4 encodes a LIM-type homeodomain is expressed in the developingcentral nervous system and is required for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885對該質粒有詳細描述)中小鼠LHX4基因cDNA 3′端部分序列為探針，應用放射性原位雜交技術篩選人脊髓cDNA文庫，在數(shù)百個陽性克隆中意外地得到一個含有完整的開放性閱讀框架(opening reading frame，ORF)、3′端有明顯的Poly A結構的陽性克隆。它編碼一個含399個氨基酸的蛋白質，與已知小鼠LHX4蛋白質僅有3個不同的氨基酸。該克隆的核酸序列與小鼠LHX4(AF135415)cDNA序列有92％的相似性，具體表示為GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCGCGGCCGCGTCGACCGGAGAGCGAGATCAAAGGGATTGGAAACAGACTGGGGACTGGCGGGGGGAGGGGGCCGGCCAGCCTGTGGAGTCCTCCCTGAGAAGCGGAGGGCCCGGCTTCCACCGTGACTCCAGCGGCCTGCTTGGGGTTTTAATTATTATTTTGAAATTTCTGAATCGAGCTAGAGCGAGAGAGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGCAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTTTAAACTTCTCTCCTCCCCACCCTACCTGCCCCCCTGGCTTGAGAGAATATCTTCAAGGATCAAAAGAGACTTGCCTTTTAAGGATCGAAAGTACGCCAATGTGAATTTCCATTATTTTCAATGGAAGTCCTCCGCTGATTCCTAGAAGGCTGTGAGACCACACTAGGGCATTGTTTCCCTGGGGAAGCAGTGGGAGAGCAGACTCATCTCAGAACACAGCACAGGGGGTAATGGCCTAGAGCTCTAGGGACACTGGCTTGTTGGGTCTCTCCCCTGCTGTTCTGCTTAGGGGCTTGGCTGCTCAGTGCTTTGGTAGCACAAGGTGACTGTGATAGGCCCCCTTGGCCTTTGGGAACTTTGCTCCAACTGGTGTGTCTCACACAATGCCTCGTCGACGCGGCCGCGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCArAGC通過RHGB4(Radiation Hybridization GeneBridge4)法和基因組數(shù)據(jù)庫檢索兩種方法對上述人LHX4基因的外顯子區(qū)域進行了劃分，結果發(fā)現(xiàn)人LHX4基因包含6個外顯子。外顯子序列為
ATGGATCATCCTCCTTTT其中同源盒區(qū)(homeodomain)由外顯子2和3共同表達構成；LIM結構域1(LIM domain 1)由外顯子5表達，LIM結構域2(LIM domain 2)由外顯子4表達。
接著，本發(fā)明的發(fā)明人利用已得到的人LHX4基因cDNA序列為探針，在成人多組織表達Array膜(multiple tissue expression array，MTE array)上通過放射性雜交的方法，研究了LHX4基因在成人不同組織中的表達情況，結果顯示全腦、大腦皮層、脊髓和胎腦有雜交信號出現(xiàn)。其中以胎腦信號最強。其余由強到弱依次為脊髓、全腦和大腦皮層，而人體其他組織中則沒有雜交信號出現(xiàn)。
他人和本發(fā)明的發(fā)明人都用實驗證明，LHX4是軀體運動神經(jīng)元發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用，是調節(jié)運動神經(jīng)元發(fā)育分化和軸突投射模式形成的一類重要轉錄因子(Sharma K，Sheng HZ，Lettier K et al.LIM homeoboxfactors Lhx3and LHX4 assign subtype identities for motor neurons.Cell，1998，95817-828；Thor S and Thomas JB.The Drosophila islet gene governs axonpathfinding and neurotransmitter identity.Neuron，1997，18397-407)。
本發(fā)明中使用的英文縮寫及其中文意義為英文縮寫 其中文意義Amp 氨芐青霉素BSA 牛血清白蛋白dCTP 2′-脫氧胞苷三磷酸ddH2O雙蒸水DEPC 焦碳酸二乙酯IPTG 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷NC 硝酸纖維素NTP 三磷酸核苷PEG 聚乙二醇SDS 十二烷基硫酸鈉SSC 標準檸檬酸鹽氯化鈉溶液Tris 三羥甲基氨基甲烷X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷下面用實施例結合附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為LHX4-pBluescript II SK(+/-)質粒圖譜。
圖2為LHX4 pBluescript II SK(+/-)質粒中所插入的小鼠LHX4翻譯區(qū)序列，圖中黑色下劃線的區(qū)域即為探針的序列。
圖3為探針的PCR擴增和玻璃奶純化結果(L200bp Ladder，A探針的PCR擴增，B探針的玻璃奶純化)。
圖4為放射性原位雜交篩庫示意圖(A第一輪雜交，B第二輪雜交，C第三輪雜交)。
圖5為第一輪雜交的克隆進行PCR鑒定(L200bp Ladder，C-陰性對照，C+陽性對照，1-7依次為陽性克隆SC1，SC4，SC6，SC7，SC8，SC11，SC14)。
圖6為第二輪雜交Lhx4特異性引物PCR鑒定結果(L200bp Ladder，C-陰性對照，C+陽性對照，1-13依次為陽性克隆SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143)。
圖7為第二輪雜交λgt11引物PCR鑒定結果(L200bp Ladder，C-陰性對照，1-13依次為陽性克隆SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143)。
圖8為第三輪雜交Lhx4特異性引物PCR鑒定結果(L200bp Ladder，C-陰性對照，1-5依次為陽性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
圖9為第三輪雜交λgt11引物鑒定結果(L200bp Ladder，C-陰性對照，C+陽性對照，1-5依次為陽性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
圖10為陽性克隆插入片段的玻璃奶純化(1-5依次為陽性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
圖11為LHX4基因全長cDNA序列圖12為Promega柱純化法回收純化探針(L200bp Ladder，A純化的LHX4探針)。
圖13為MTE Array膜與人LHX4 cDNA探針雜交結果。
圖14為LHX4基因所含6個外顯子序列實施例1.人同源盒基因LHX4全長cDNA序列的篩選和克隆一.材料主要化學試劑IPTG、X-gal(Promega公司)，DEPC、明膠、溴化乙錠(Sigma公司)，Tris堿、Agar、Agarose(GIBCO-BRL公司)，SDS(Promega公司)、麥芽糖(Merck公司)，其它各種試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。
主要儀器Mili-Q超純水系統(tǒng)(Milipore公司)，紫外分光光度計(Beckman)，紫外交聯(lián)儀(Bio-Rad GS Gene LinkerTM)，PCR儀(PE公司480型)，數(shù)碼相機和掃描儀(Kodak公司)，冷凍高速離心機、冷凍臺式離心機、臺式離心機、溫箱、電泳儀、紫外檢測儀(均為國產(chǎn))。
質粒LHX4-pBluescript質粒(美國NIH Hui Z和Heiner Westphal實驗室饋贈)cDNA文庫人脊髓cDNA文庫(Clontech公司)探針標記Ex Taq PCR系統(tǒng)(TaKaRa公司)，Primer-a-Gene labelingSystem(Promega公司)，玻璃奶DNA純化回收試劑盒(北京原平公司)，雜交Hybond雜交膜(Amersham公司)，Express雜交液(Clontech公司)，雜交爐(Heraeus公司)，[α-32P]dCTP(北京亞輝公司)，X光片(Fuji公司)克隆菌種E.Coil.DH5α，Y1090(本室存貨，可從一般商業(yè)專業(yè)公司購買)；載體T-EASY Vector(Promega公司)；引物λgt11的上下游引物(Sangon公司)；PCREX Taq PCR體系和Pyrobest Taq PCR體系(TaKaRa公司)。
序列分析測序儀PE公司377型測序儀(大連TaKaRa公司)；序列分析美國國家生物技術信息中心(NCBI)網(wǎng)站BLAST程序DNASIS 4.0軟件(Hitachi軟件公司)。
二.方法1.小鼠LHX4-pBluescript質粒的獲得和測序由于我們得到了國外實驗室饋贈的插入小鼠LHX4部分cDNA片段的LHX4-pBluescript質粒，為了保證插入序列的準確，我們對其進行了擴增和測序。
1.1.小鼠LHX4-pBluescript質粒的擴增和純化(1).以2μl連接產(chǎn)物轉化200μl E.coli DH5α感受態(tài)細菌。轉化后的DH5-α10μl涂布于LB/Agar/Amp+/IPTG+/X-Gal+的平板上37℃培養(yǎng)18～20小時。
(2).重組克隆的篩選和鑒定。挑選白色透明菌落，接種到50ml LB/Amp+(100μg Amp/ml LB)，220rpm，37℃搖菌12小時。以堿裂解法小提質粒。質粒溶于20μl。以Hind III、BamH I雙酶切鑒定重組質粒。2.0μl 10x MultBuffer、1.0μl Hind III(20U/μl)、1.0μl BamH I(10U/μl)、0.8μl RNase A(10mg/ml，Promega)、0.2μl BSA、10μl Plasmid preparation、共20μl混勻，37℃保溫2小時，以1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。用200bp PCRLadder(華美公司)作DNA大小的參照物。
(3).質粒測序模板的提取a.挑取陽性克隆接菌到6ml LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37℃、220rpm搖菌12～16小時。
b.室溫離心收集細菌，以200μl GTE(50mM glucose，25mM Tris.HClpH8.0，10mMEDTA)懸浮細菌。
c.加300μl新鮮配置的裂解液(0.2M NaOH，1％SDS)，溫和顛倒離心管10次以混勻內容物，置冰上5分鐘。
d.加300μl中和液(3M KAC，5M HAC，pH4.8)，溫和顛倒離心管12～14次以混勻內容物。置冰上5分鐘。
e.室溫12,000rpm離心10分鐘。
f.轉移上清至新離心管，加4μl RNase A(10mg/ml)，37℃溫育30分鐘。
g.以500μl等體積氯仿酚抽提兩次，再以500μl氯仿抽提一次，留取上清。
h.加等體積異丙醇，混勻，室溫10,000rpm離心10分鐘。
i.棄上清，以75％乙醇洗滌沉淀，吸盡殘液。
j.以33.6μl ddH2O懸浮沉淀，加6.4μl 5M NaCl，40μl 13％PEG8000，混勻，冰浴20分鐘。
k. 4℃ 12,000rpm離心12分鐘，小心吸盡上清。
l.以10μlddH2O溶解質粒沉淀。以0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒并測定質粒濃度。只有無RNA污染，且超螺旋成分含量大于90％的質粒才能用于測序。
1.2.測序將上述純化后的質粒20μl送大連TaKaRa公司，使用377型測序儀(PE公司)測序。
2.小鼠LHX4 cDNA探針的制備2.1. PCR擴增特異的部分LHX4 cDNA片段(1).合成上下游引物引物濃度為100μmol上游引物(primer 1)5′gccatcgctggggccagttc3′下游引物(primer 2)5′ctaaaaaggaggatggtcc3′(2).PCR擴增PCR buffer 2μl、DNTP 2μl、primer 1 1μl、primer 2 1μl、Ex Taq 0.5μl、模板0.5μl和ddH2O 13μl，共20μl于94℃變性3-5分鐘。94℃ 40秒，60℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環(huán)。72℃延伸10分鐘。結束反應后1.5％Agarose凝膠電泳鑒定。
2.2. PCR擴增產(chǎn)物的純化玻璃奶(Glass milk)法回收DNA片段DNA樣品經(jīng)1×TAE緩沖液配制的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后，長波紫外燈下切下欲回收DNA片段，在Eppendorf管中搗碎，加入3倍體積的溶膠液，60℃水浴5分鐘(其間輕搖Eppendorf管數(shù)次使膠完全溶化)，加入10μl玻璃奶，用加樣器混勻，室溫靜置5分鐘，離心8000rpm數(shù)秒，去上清，加125μl漂洗液，用加樣器吸漂洗液將玻璃奶沖散均勻，8000rpm離心去上清(重復3次)，再加20μl TE或滅菌蒸餾水，混勻，60℃水浴5分鐘，離心15000rpm數(shù)秒，回收上清備用。
2.3.小鼠LHX4 cDNA探針的同位素標記采用隨機引物標記試劑盒標記(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步驟同Promega公司操作手冊。用于標記的DNA來源于PCR擴增的片段。(1).25ng的DNA，用水補足30μl，98℃變性4分鐘，快速放到冰上。(2).依次向管中加入以下試劑成分 體積 終濃度5×標記緩沖液 10μldNTP混合物(無dCTP) 2μl 每種20μM10mg/ml BSA 2μl 400μg/ml(3).將1，2兩管混勻，然后加入成分 體積 終濃度〔α-32P〕dCTP 5μl 50μ Ci，3,000/mmolKlenow酶(5U/μl)1μl 100U/ml室溫標記1小時，取1μl按下述方法測定標記效率，剩余的探針98℃變性5分鐘后加入雜交液中。將1μl標記產(chǎn)物稀釋500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法測定標記效率。探針的比活度一般約為1×108～1×109cpm/μg.。
3.人脊髓cDNA文庫的篩選3.1.cDNA文庫滴度的測定(1).宿主菌Y1090的活化從瓊脂平板上挑取單克隆Y1090菌落于LB培養(yǎng)液中含10mM MgSO4，0.2％麥芽糖)，37℃搖過夜。離心后用10mM MgSO4再次懸浮，置于4℃。
(2).將原裝的人脊髓cDNA文庫分裝后，進行如下稀釋
5μl原液取5μl 取5μl 取5μl+→ +→ →+ +500μl SM 500μl SM500μl SM500μl SM1∶1021∶1041∶1051∶1061 234(3).將1，2，3，4號稀釋液2μl，加入200μl活化好的Y1090宿主菌中，混勻后置于37℃水浴中吸附15-20分鐘。
(4).化頂層膠(0.7％Agrose+LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，以3ml/管分裝，置于50℃水浴中。
(5).將(3)中2，3，4號混合液加入(4)中分好的頂層膠中，迅速到入鋪好底層的90mm平板中(LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，搖勻，吹干。倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)7-8小時，觀察，記生長克隆數(shù)。
3.2.噬菌斑原位雜交篩選cDNA文庫(1).準備30塊130mm平板，鋪底層膠(LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，風干30分鐘后置37℃ 1小時。
(2).配頂層膠(0.7％Agrose+LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，按7ml/管分裝，50℃保溫。
(3).按1∶100稀釋噬菌體液(5μl/500μl SM)，取稀釋液3μl置于300μl Y1090菌中混勻后，37℃吸附20分鐘。
(4).將(3)中每份混合物加入(2)的每一管中，并迅速鋪頂層，吹干后倒置37℃培養(yǎng)7-8小時。
(5).待到嗜菌斑生長的透亮，均勻，直徑接近1.5mm左右時停止培養(yǎng)，將平皿置4℃保存，以加固培養(yǎng)基硬度。這時每個平板上約有3萬個克隆，總共鋪100萬個克隆。
(6).將NC膜(132mm，0.45μ)30張編號，平板依NC膜順序編號。
(7).將NC膜置于平板頂層膠面上1-2分鐘，轉移噬菌體DNA至硝酸纖維素膜上，并對NC膜進行標記。
(8).將NC膜印跡面朝上置于3M濾紙上晾干。并依次通過變性液(0.5NNaOH，1.5M NaCl)5分鐘×2次，中和液(0.5M Tris-HCl，pH7.4，1.5M NaCl)5分鐘，漂洗液(2×SSC)短暫漂洗。晾干，置80℃烘烤2小時固定DNA。
(9).雜交液100ml(6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt)預熱至68℃。
(10).鮭精DNA(10mg/ml)1ml，98℃變性5分鐘，加入預熱的雜交液中，與NC膜預雜交1-2小時。
(11).更換雜交液并加入變性探針，68℃雜交18小時。雜交期間保持均勻震蕩和恒溫。
(12).雜交后以I液(0.1％SDS+2×SSC)洗膜三次，15分鐘/次。II液(0.1％SDS+1×SSC)洗膜兩次，并監(jiān)測信號強度。
(13).將洗好的膜置3M濾紙上晾干后壓X光片，-70℃曝光24-72小時。
3.3.陽性克隆的鑒定和純化(1).對照X光片，從培養(yǎng)皿上相應部位挑取陽性克隆噬菌斑，并將其懸浮于200μl SM(含20-30μl氯仿)溶液中，4℃過夜，使噬菌體從膠中釋放出來。
(2).用PCR鑒定陽性噬菌斑，PCR條件同前。PCR重復一次，確保結果的準確性。
(3).根據(jù)第一次挑出的陽性噬斑含有10個單克隆噬斑估計。第二次鋪板使每個平板的克隆數(shù)達到100-200個/板。
(4).再次進行噬菌斑原位雜交(方法同前)。使每板陽性克隆數(shù)達占克隆總數(shù)的60％。
(5).挑取單克隆陽性噬斑，PCR鑒定后，用λgt11載體引物擴增插入序列。
LHX4特異性引物PCR鑒定上游引物(primer 1)5′gccatcgctggggccagttc3′下游引物(primer 2)5′ctaaaaaggaggatggtcc3′λgt11載體引物
Forward Primer5′GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG3′Reverse Primer5′TTGACACCAGACCAACTGGTAATG3′PCR反應體系EX PCR buffer 2μl、DNTP 2μl、Forward primer 0.4μl、Reverse primer 0.4μl、Ex Taq 0.2μl、模板1μl和ddH2O 14μl共20μl于94℃變性3-5分鐘；94℃ 40秒，55℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘，30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；結束反應后1.5％Agarose凝膠電泳鑒定。
(6).對擴增到(大于1.2Kb)的陽性克隆準備進行克隆測序。
3.4.克隆和測序(1).對陽性克隆進行高保真PCR擴增使用TaKaRa公司Pyrobest Taq酶(ProofReading)系統(tǒng)Pyrobest buffer 5μl、dNTP 4μl、forward primer 1μl、reverse primer 1μl、Pyrobest Taq 0.5μl、模板2.5μl和ddH2O 36μl，共50μl于94℃變性3-5分鐘；94℃ 40秒，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘，30個循環(huán)；72℃延伸10分鐘；結束反應后1.5％Agarose凝膠電泳鑒定。
(2).PCR產(chǎn)物的純化玻璃奶純化(方法同前)。
(3).回收片段與PGEM-T EASY載體的連接連接體系為2×Rapidligation buffer 5μl、PCR回收片段(30ng)3μl、PGEM-T EASY載體1μl、T4 DNA ligase(3 Weiss Unit/ul)1μl，共10μl于4℃連接12小時。
(4).重組子轉化E.coil.DH5a菌株a.感受態(tài)的制備來自單菌落的DH5a經(jīng)過夜活化后，1∶100接種于50mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0.4-0.6。冰浴10分鐘，立即于4℃，4000rpm離心10分鐘，棄上清，菌體重懸于10ml冰預冷的0.1mol/LCaCl2，冰浴20分鐘后4℃4000rpm離心10分鐘，收集菌體重懸于1-2ml預冷的0.1mol/L CaCl2中，放置4℃過夜備用。
b.轉化取200μl感受態(tài)細胞于無菌離心管中，加入連接產(chǎn)物4-6μl并混勻，冰浴中放置30分鐘，然后置42℃熱休克90秒，迅速轉入冰浴，2分鐘后加800μl LB培養(yǎng)基，37℃緩慢振動培養(yǎng)1小時以恢復抗生素抗性。取100μl轉化菌液涂布于瓊脂平板(100μg/ml Amp+，X-gal+，IPTG+)，室溫放置30分鐘后37℃孵箱倒置培養(yǎng)12-16小時待克隆形成。
(5).藍白斑篩選和質粒的小量提取用接種環(huán)挑取平板中白色單菌落，接種于3-5ml Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床中振蕩過夜，使細菌生長至對數(shù)晚期，然后將菌液轉入1.5mlEppendorf管，高速離心1分鐘，去上清。向沉淀中加入100μl冰預冷的溶液I[50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)]懸浮細胞，置冰浴中，再加入200μl現(xiàn)配的溶液II(0.2mol/L NaOH、1％SDS)，上下顛倒Eppendorf管數(shù)次至液體變得清澈，加入150μl溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml)，倒置Eppendorf管振蕩，使溶液充分混勻后，將Eppendorf管置冰浴中3-5分鐘，4℃ 12000rpm離心5分鐘，收集上清，加等體積平衡酚振蕩混合，12000rpm離心3分鐘，收集上層水相，再用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提，加兩倍體積乙醇，混勻后室溫下放置15分鐘，4℃ 12000rpm離心5分鐘，去上清，用1ml 70％乙醇洗滌沉淀，去上清，空氣中干燥，然后將沉淀溶于20μl含RNA酶(20μg/ml)的水中，37℃保溫1小時，-20℃凍存待用。
(6).酶切鑒定根據(jù)不同限制性內切酶的具體要求進行。
以ApaI、PstI雙酶切鑒定重組質粒。2.0μl 10x Multbuffer，1.0μlApaI(10U/μl)，1.0μl PstI(10U/μl)，0.8μl RNase A(10mg/ml，Promega)，0.2μl BSA，10μl Plasmid preparation共20μl混勻，37℃保溫2小時，以1.5％Agrose凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。用200bp PCR Ladder(華美公司)作DNA大小的參照物。
(7).PEG法純化質粒溶解在30μl中的質粒(5-8μg)，加10μl(30％PEG8000、1.5mol/LNaCl)，冰上放置60分鐘。4℃ 12000rpm離心10分鐘，去上清，70％乙醇、100％乙醇各洗滌一次，空氣中干燥，再溶于20μl H2O中，作為測序反應模板。
(8).測序將(7).中純化好的測序反應模板20μl送大連TaKaRa公司測序。
3.5陽性克隆的序列分析cDNA序列的翻譯使用的是DNASIS 4.0版本(Hitachi軟件公司)。DNA及蛋白質的同源性比較用BLAST軟件[20]與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行比較。
三、結果1.小鼠LHX4-pBluescript II SK(+/-)質粒的插入序列和探針制備1.1.探針序列的選擇根據(jù)對小鼠LHX4-pBluescript II SK(+/-)質粒(見圖1)的插入片段的測序結果，選擇小鼠LHX4 3′端特異的cDNA序列為探針不包含LIM結構域和homeobox結構域(序列見圖2)。
1.2.探針的純化用PCR的方法，以質粒為模板，擴增所需的cDNA片段，并用玻璃奶純化(結果見圖3)。
2.放射性原位雜交法篩選人脊髓cDNA文庫2.1.放射性原位雜交在第一輪雜交中，人脊髓cDNA文庫共鋪100萬個克隆，雜交后挑選25個克隆，經(jīng)PCR鑒定7個陽性克隆為SC1，SC4，SC6，SC7，SC8，SC11，SC14。將第一輪雜交陽性克隆再次鋪板，第二輪雜交后共挑選21個克隆經(jīng)LHX4特異性引物和λgt11載體特異性引物PCR鑒定后，去除插入片段＜1.2Kb的克隆，得到13個陽性克隆，分別為SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143。第三輪雜交后共挑選70個單克隆，經(jīng)LHX4特異性引物和λgt11載體特異性引物PCR鑒定后，挑選5個陽性克隆為SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712.(結果見圖4～圖9)。
3.陽性克隆的鑒定及序列分析3.1.將陽性克隆的插入片段克隆入T-Easy載體并進行序列分析將λgt11引物擴增的PCR產(chǎn)物玻璃奶純化后與T-Easy載體相連，酶切鑒定陽性克隆并進行測序(結果見圖10)。
3.2.SC712序列分析我們將6個樣品的質粒純化后送大連TaKaRa公司測序，測序由PE公司的377型測序儀進行。序列回報后我們應用NCBIBlast2.0程序和ORF Finder程序，我們發(fā)現(xiàn)SC712克隆的序列有完整的ORF(opening reading frame，開放性閱讀框架)，3′端有明顯的Poly A結構。其核酸序列與小鼠LHX4(AF135415)cDNA序列有92％的相似性。編碼一個含399個氨基酸的蛋白質，與已知小鼠LHX4蛋白質僅有3個不同的氨基酸。因此，我們可以確認克隆到了一個人的LHX4基因全長cDNA序列(序列見圖3)。
實施例2.人同源盒基因LHX4在成人不同組織中的表達一.材料主要儀器HEAR hybrid雜交爐(Heraeus公司)，掃描儀(Kodak公司)。
主要試劑Huamn Ubiquitin Control cDNA Probes(Clontech公司，5ng/μl)，ExpressHyb雜交液(Clontech公司)，鮭精DNA(10mg/ml，ssDNA，GIBCO-BRL公司)，C0t-1 DNA(1mg/ml，Gibrco公司)，20×SSC(pH7.0)，20％SDS(Sigma公司)，洗膜液12×SSC，1％SDS，洗膜液20.1×SSC，0.5％SDS，玻璃奶純化試劑盒(原平公司)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Promega公司)，EX Taq PCR系統(tǒng)(TaKaRa公司)。
雜交膜MTE Arrary膜(Multiple Tissue Expression Arrary，Clontech公司)放射自顯影α-32P dCTP(北京亞輝公司)，X光片(Kodak公司)，X光片壓片盒(汕頭醫(yī)學實驗儀器廠)，D-72顯影液，定影液(浙江嘉興市南湖攝影儀器廠)。
二.方法1.探針的制備和純化1.1.PCR法擴增探針(1).設計引物Forward Primer5′atgatgcagagtgcgactgtc 3′Reverse Primer5′gtttaaaaaggaggatgatc 3′(2).PCR擴增體系為TaKaRa公司Ex Taq PCR系統(tǒng)PCR buffer 2μl，DNTP 2μl，primer 1 1μl，primer 2 1μl，Ex Taq 0.5μl，模板0.5μl，ddH2O13μl，共20μl。擴增條件
溫度 時間(分鐘)94℃ 30094℃ 03060℃ 03030個循環(huán)72℃ 03072℃ 10.004℃保存1.2.探針的純化對PCR擴增后的產(chǎn)物用Promega柱純化的方法進行純化(1).50μl PCR擴增產(chǎn)物中加入100μl純化緩沖液(direct purificationbuffer)，充分混勻。
(2).再加入1ml PCR純化樹脂(wizard PCR preps DNA purificationresin)，混勻。
(3).將上述液體全部加入5ml注射器中，并裝好小柱子(Wizard PCRpurification Spin Column)。將注射器緩慢推下使所有液體通過小柱子。
(4).卸下注射器，加入2ml 80％的異丙醇，裝好小柱子并將注射器緩慢推下使所有液體通過小柱子。
(5).將小柱子裝入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm離心1分鐘，使異丙醇徹底從小柱子上去除。
(6).將小柱子換入到干凈的Eppendorf管中，并從頂部加入30μl的dd H2O，靜置1分鐘，然后12000rpm離心20秒，回收液體。
(7).將所回收的液體取2μl進行瓊脂糖電泳，以檢測回收的效果。
1.3.探針的標記采用隨機引物標記試劑盒標記(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步驟同Promega公司操作手冊。用于標記的DNA來源于PCR擴增的片段。
(1).25ng的DNA，用水補足30μl，98℃變性4分鐘，快速放到冰上。
(2).依次向管中加入以下試劑成分 體積終濃度5×標記緩沖液 10μldNTP混合物(無dCTP) 2μl每種20μM10mg/ml BSA2μl400μg/ml(3).將1，2兩管混勻，然后加入成分 體積終濃度〔α-32P〕dCTP5μl50μ Ci，3,000/mmolKlenow酶(5U/μl) 1μl100U/ml室溫標記1小時，取1μl按下述方法測定標記效率，剩余的探針98℃變性5分鐘后加入雜交液中。將1μl標記產(chǎn)物稀釋500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法測定標記效率。探針的比活度一般約為1×108～1×109cpm/μg.。
1.4. MTE Array膜與特異性探針的雜交(1).準備ExpressHyb雜交液和鮭精DNA50-60℃預熱15ml ExpressHyb雜交液；98℃變性1.5mg鮭精DNA 5分鐘，并迅速置于冰浴中；將上述預熱好的ExpressHyb雜交液與變性后的鮭精DNA混勻。
(2).將MTE Array膜放入雜交管中并加入10ml步驟(1)中準備好的雜交液。
(3).保持65℃，連續(xù)震蕩中持續(xù)預雜60分鐘。
(4).將標記好的探針中加入30μg C0t-1 DNA，150μg鮭精DNA和50μl20×SSC，使總體積達到200μl。
(5).將上述步驟(4)中準備好的探針98℃變性5分鐘，然后68℃ 30分鐘(6).將步驟(5)中準備好的探針混合液加入剩下的5ml雜交液中，并確保兩種溶液能夠充分混合。
(7).從進行MTE Array預雜的雜交管中棄去預雜液，加入步驟(6)中準備好的雜交液，并盡量去除氣泡并使雜交液全面覆蓋膜。
(8).65℃持續(xù)震蕩雜交過夜(6-12小時)。
(9).雜交完畢后，到掉雜交液。
(10).加入200ml洗膜液1，65℃持續(xù)震蕩洗膜20分鐘。重復這一過程4次。
(11).然后加入200ml 55℃預熱的洗膜液2，55℃持續(xù)震蕩洗膜20分鐘。重復這一過程2-3次，洗膜的程度可用mintor來檢測。
(12).洗膜完畢后，將膜置于3M的濾紙上，去掉多余的水分，但不要使膜干。并將膜包入塑料薄膜中。
(13).將步驟1中處理好的膜與X光片一同置入壓片盒中，-70℃壓片7天。
(14).x光片顯影，分析結果。
三、結果1.探針的制備和純化以人LHX4基因的質粒為模板，經(jīng)過PCR擴增和純化后，得到人LHX4 cDNA表達序列全長，以其做為MTE Array膜雜交的探針(結果見圖12)。
2.雜交及結果分析經(jīng)過多次反復雜交后，我們得到較為穩(wěn)定的雜交結果，并將雜交信號的位置與MTE Array膜上不同組織RNA的位置相比較，發(fā)現(xiàn)有雜交信號出現(xiàn)的位置依次是全腦，大腦皮層，脊髓，胎腦。其中尤以胎腦信號最強，其次信號由強到弱依次為脊髓，全腦，大腦皮層(結果見圖13)。
上述結果表明，我們所克隆到的人LHX4 cDNA全長序列在神經(jīng)組織具有特異性表達，而且這種表達主要局限在成人的神經(jīng)系統(tǒng)，但在成人神經(jīng)系統(tǒng)各組織的表達程度均明顯低于胎腦中的表達。由此我們可以推測人LHX4基因的表達并不止局限在胚胎組織中，在成人的神經(jīng)組織中也有特異性的表達。
權利要求
1.人同源盒基因LHX4全長cDNA序列，包含如下序列的6個外顯子，AGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTT
2.按照權利要求1的人同源盒基因LHX4全長cDNA，其特征在于其序列為GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCGCGGCCGCGTCGACCGGAGAGCGAGATCAAAGGGATTGGAAACAGACTGGGGACTGGCGGGGGGAGGGGGCCGGCCAGCCTGTGGAGTCCTCCCTGAGAAGCGGAGGGCCCGGCTTCCACCGTGACTCCAGCGGCCTGCTTGGGGTTTTAATTATTATTTTGAAATTTCTGAATCGAGCTAGAGCGAGAGAGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGCAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTTTAAACTTCTCTCCTCCCCACCCTACCTGCCCCCCTGGCTTGAGAGAATATCTTCAAGGATCAAAAGAGACTTGCCTTTTAAGGATCGAAAGTACGCCAATGTGAATTTCCATTATTTTCAATGGAAGTCCTCCGCTGATTCCTAGAAGGCTGTGAGACCACACTAGGGCATTGTTTCCCTGGGGAAGCAGTGGGAGAGCAGACTCATCTCAGAACACAGCACAGGGGGTAATGGCCTAGAGCTCTAGGGACACTGGCTTGTTGGGTCTCTCCCCTGCTGTTCTGCTTAGGGGCTTGGCTGCTCAGTGCTTTGGTAGCACAAGGTGACTGTGATAGGCCCCCTTGGCCTTTGGGAACTTTGCTCCAACTGGTGTGTCTCACACAATGCCTCGTCGACGCGGCCGCGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC
全文摘要
本發(fā)明涉及人同源盒基因LHX4的全長cDNA序列。該序列包含6個外顯子。其表達產(chǎn)物在軀體運動神經(jīng)元發(fā)育和分化過程中發(fā)揮重要作用,是調節(jié)運動神經(jīng)元發(fā)育分化和軸突投射模式形成的一類重要轉錄因子。
文檔編號C07H21/00GK1353186SQ00133460
公開日2002年6月12日 申請日期2000年11月7日 優(yōu)先權日2000年11月7日
發(fā)明者劉耀波, 范明, 于順, 周嚴, 袁建剛, 強伯勤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所