專(zhuān)利名稱(chēng)：利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的合成方法，該方法利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系 統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
目前，已廣泛利用基因重組技術(shù)并使用酵母活細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng) (以下簡(jiǎn)稱(chēng)細(xì)胞系統(tǒng))作為蛋白質(zhì)的生產(chǎn)方法。但是，活細(xì)胞由于其功能保 留而表現(xiàn)出外源蛋白質(zhì)消失的傾向，并且由于活細(xì)胞中細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的表達(dá) 阻止了細(xì)胞生長(zhǎng)而存在許多不能被容易表達(dá)的蛋白質(zhì)。而體外表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)而 言沒(méi)有上述細(xì)胞系統(tǒng)蛋白質(zhì)合成上的限制，并能在不傷害生物體的情況下合成 蛋白質(zhì)。另外由于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)不伴有培養(yǎng)等操作，因而與細(xì)胞系統(tǒng)相比，可 在短時(shí)間內(nèi)合成蛋白質(zhì)。此外，由于體外表達(dá)系統(tǒng)還用來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)由不被生 物體利用的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，因而有望成為有前途的表達(dá)方法。
桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可使高表達(dá)的外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行正確折疊、二硫鍵 的搭配及寡聚物的形成提供良好的環(huán)境，可使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天 然蛋白。在桿狀病毒極晚期基因表達(dá)過(guò)程中，有種高效表達(dá)的蛋白，是pio蛋 白高效表達(dá)的極晚期蛋白為P10蛋白。P10基因現(xiàn)在已被定位和克隆這個(gè)基 因的啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的啟動(dòng)能力，使外源基因能高水平表達(dá)。目前，利用桿狀 病毒P10基因啟動(dòng)子進(jìn)行體外蛋白表達(dá)的方法還未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)
合成蛋白質(zhì)的方法在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及 蛋白酶抑制劑，25-29'C水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括取蠶蛹，接種桿狀病毒，待
蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于L5 ml EP管中，-80°C、 2(TC反復(fù)凍 融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，取上清，重復(fù)兩次后，35000 rpm 超速離心30-60 min，吸取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul管子分裝， 每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括接種桿狀病毒于家蠶細(xì)胞， 待細(xì)胞發(fā)病后，_80°C、 20。C反復(fù)凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的1. 5 ml EP 管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備方法包括 (O以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增P10啟動(dòng)子序列，PCR 所用的兩種引物為
L-l: 5，-atgaatcctgccggccgctccgtgtacggg-3， EcoRI位點(diǎn)； 2: 5，-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位點(diǎn)；
(2) 以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，PCR擴(kuò)增GFP報(bào)告基因序列，PCR所用的 兩種引物為
L-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位點(diǎn)； 4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位點(diǎn)；
(3) 將P10啟動(dòng)子序列片段和質(zhì)粒pUC19進(jìn)行EcoRI、 BamHI雙酶切，37 'C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10載體；
(4) 分別對(duì)GFP序列和載體pUC19-P10進(jìn)行BamHI、 Pael雙酶切，37°C 反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒。
所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。
本發(fā)明的有益之處在于傳統(tǒng)的蛋白表達(dá)方法有兩個(gè)途徑， 一是原核表 達(dá)，它具有許多的優(yōu)點(diǎn)，如表達(dá)周期短，成本低，但有些基因在原核系統(tǒng)中的
持續(xù)表達(dá)可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo) 致產(chǎn)物純化困難，且不利于蛋白形成正確的構(gòu)象；二是真核表達(dá)，它能誘導(dǎo)基 因高效表達(dá)，且能?chē)?yán)格調(diào)控基因表達(dá)，但它受細(xì)胞培養(yǎng)的限制。本發(fā)明所述的 方法不受細(xì)胞的限制，可在短時(shí)間內(nèi)(3 — 6小時(shí)內(nèi))合成蛋白質(zhì)，以溶解狀態(tài) 存在，這有利于蛋白的分離純化，同時(shí)它屬于真核表達(dá)體系，有利于蛋白形成 正確的構(gòu)象。


圖l、本發(fā)明的實(shí)施例的重組質(zhì)粒pUC19-P10-GFP。 圖2、本發(fā)明的實(shí)施例的蛋白表達(dá)電泳圖2: M，標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1， 0小時(shí)取樣；2， 3小時(shí)取樣；3， 6小時(shí)取 樣；4， 12小時(shí)取樣。
具體實(shí)施例方式
一、 家蠶桿狀病毒提取液的準(zhǔn)備
1、 用家蠶蠶蛹制備桿狀病毒提取液
取蠶蛹若干，接種家蠶桿狀病毒(BraNPV，購(gòu)自上海生化研究所)，待蠶 蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5 ml EP管中，-80°C、 20。C反復(fù)凍融3 次，4 °C， 18000 rpm離心20 min，取上清，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離 心30 min，吸取上清至新的1.5 ml EP管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。
2、 用家蠶Bm5細(xì)胞制備桿狀病毒提取液
接種桿狀病毒(BmNPV，購(gòu)自上海生化研究所)于家蠶Bm5細(xì)胞，待細(xì)胞 發(fā)病后，-80°C、 20。C反復(fù)凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心20 min，重復(fù)兩 次后，35000 rpm超速離心30 min，取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul 管子分裝，每管50ul，即為桿狀病毒提取液，即用或存放于液氮中。
二、 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 1.引物設(shè)計(jì)
LI: 5， -at卵a(bǔ)tcctgccggccgctccgtgtacggg-3， (EcoRI位點(diǎn))
L2: 5， -gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， (BamHI位點(diǎn)) 綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)報(bào)告基因的引物 L-3: 5'- atggatccgtatgcatggtgagcaag -3'; (BamHI位點(diǎn)) L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc -3'。 (PaeI位點(diǎn))
2.P10啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增
以家蠶桿狀病毒基因組DAN (NC-001875)為模板，以L-1、 L一2為引物， PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C預(yù)變性5min， 94。C變性30s， 68。C復(fù)性延伸lmin， 30個(gè)循 環(huán)，68。C延伸5min。
在一個(gè)無(wú)菌的0.5ml離心管中，混合下列成分
10xPCR Buffer 10nl 25mmol MgC12 8|il
2. 5 mmol dNTPs 8|il L-1
L-2 l^il
模板 1^1 KOD-Plus DNA聚合酶 (T0Y0B0公司，日本)lpl 加無(wú)菌雙蒸水至lOOiil
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段，獲得P10啟動(dòng)子。
3. GFP報(bào)告基因序列的擴(kuò)增
以質(zhì)粒pEGFP-Nl (GE公司，Genbank U55762)為模板，PCR反應(yīng)參數(shù)為94。C 預(yù)變性5min， 94'C變性30s， 68'C復(fù)性延伸lmin， 30個(gè)循環(huán)，68。C延伸5min。 在一個(gè)無(wú)菌的0.5ml離心管中，混合下列成分 10xPCR Buffer 10^1 25mmol MgC12 8|il 2. 5 ,1 dNTPs 8^1 L-3 l^il
L-4 模板
KOD-Plus DNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本) 加無(wú)菌雙蒸水至100pl
各組分混勻后，放入PCR儀中，按上述反應(yīng)參數(shù)設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)。待反應(yīng)結(jié) 束后，電泳鑒定擴(kuò)增片段，同時(shí)切膠回收目的片段。 4. pUC19-P10載體的構(gòu)建
分別對(duì)P10啟動(dòng)子序列片段和質(zhì)粒pUC19 (promega公司)進(jìn)行&oy I、 5aMH雙酶切，37'C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。 在一個(gè)無(wú)菌的0.2ml離心管中，混合下列成分
P10啟動(dòng)子序列片段 2pl
質(zhì)粒pUC19 0.5^1
2xRapid Ligation buffer 5(il
T4 DNA ligase (購(gòu)自promage公司) lpl
加無(wú)菌雙蒸水至10pl，混勻。25i:反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì) 胞E.coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測(cè)序，序 列完全正確，得pUC19-P10載體。
5. pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備
分別對(duì)GFP序列和質(zhì)粒pUC19-P10進(jìn)行勘WI、尸ael雙酶切，37。C反應(yīng)2小時(shí) 后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接。
在一個(gè)無(wú)菌的0. 2ml離心管中，混合下列成分
GFP序列片段 2pl
質(zhì)粒pUC19-P10 0. 5^1
2xRapid Ligation buffer 5(al
T4 DNA ligase (購(gòu)自promage公司) ljxl
加無(wú)菌雙蒸水至10pl，混勻。25。C反應(yīng)lh后，反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至感受態(tài) 細(xì)胞E.coli DH5a中。挑取單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切初步鑒定，經(jīng)測(cè)序， 序列完全正確，得pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒(圖l)。
本發(fā)明僅以P10啟動(dòng)子、GFP為例，但P10啟動(dòng)子可以用多角體 (polyhedrin)啟動(dòng)子代替，GFP也可用其他可用于分子標(biāo)記的基因代替，如 綠色熒光蛋白。
三、反應(yīng)體系
在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)?；蚝型庠椿虻?pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒、PMSF蛋白酶抑制劑，25-29。C水浴，分0， 3h， 6h， 12h， 18h， 24h取樣。見(jiàn)圖2，在3小時(shí)后蛋白的表達(dá)量就可達(dá)到所需的量，6 小時(shí)表達(dá).量最大，隨后，蛋白表達(dá)量將會(huì)降低。
三、電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物
電泳結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察，在488nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察綠色熒光蛋 白GFP的表達(dá)，或用考染法觀測(cè)蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明(圖2)，約在6小時(shí) 蛋白表達(dá)量較大。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實(shí)施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實(shí)施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
SEQ ID NO 1:
30 atgaatcctg
SEQ ID NO 2:
30 gtggatccga
SEQ ID NO 3: 26 atggatccgt SEQ ID NO 4:
23 tcgcatgctt
ccggccgctc
tgatattgca atgcatggtg acttgtacag
序列表
cgtgtacggg gtcagtttgg
3gC犯g
etc
權(quán)利要求
1、一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法，其特征在于在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括取蠶蛹，接種桿狀 病毒，待蠶蛹發(fā)病后，冰上勻漿，吸取勻漿液于1.5mlEP管中，-8(TC、 20°C 反復(fù)凍融3次，4°C， 18000rpm離心15-30min，取上清，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，吸取上清至新的L5 ml EP管中，用500 ul管子分 裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述家蠶桿狀病毒提取液的制備方法包括接種桿狀病毒于家 蠶細(xì)胞，待細(xì)胞發(fā)病后，-80°C、 20。C反復(fù)凍融3次，4 。C， 18000 rpm離心15-30 min，重復(fù)兩次后，35000 rpm超速離心30-60 min，取上清至新的1.5 ml EP 管中，用500 ul管子分裝，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒的制備方法包括(1) 以家蠶桿狀病毒基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增P10啟動(dòng)子序列，PCR所用的兩種引物為5，-atgaa"tcctgccggccgctccg"tgtacggg-3' EcoRI位點(diǎn)； L-2.' 5'-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位點(diǎn)；(2) 以質(zhì)粒pEGFP-Nl為模板，PCR擴(kuò)增GFP報(bào)告基因序列，PCR所用的兩 種引物為L(zhǎng)-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位點(diǎn)；L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位點(diǎn)；(3) 將P10啟動(dòng)子序列片段和質(zhì)粒pUC19進(jìn)行EcoRI、 BamHI雙酶切，37 "C反應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10載體；(4) 分別對(duì)GFP序列和載體pUC19-P10進(jìn)行BamHI、 Pael雙酶切，37"C反 應(yīng)2小時(shí)后分別回收酶切產(chǎn)物，再進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coUDH5a， 得到pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方 法，其特征在于所述的蛋白酶抑制劑為PMSF蛋白酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用家蠶桿狀病毒體外表達(dá)系統(tǒng)合成蛋白質(zhì)的方法在家蠶桿狀病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重組質(zhì)粒及蛋白酶抑制劑，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表達(dá)。本發(fā)明所述的方法不受細(xì)胞的限制，可在短時(shí)間內(nèi)(3-6小時(shí)內(nèi))合成蛋白質(zhì)，以溶解狀態(tài)存在，這有利于蛋白的分離純化，同時(shí)它屬于真核表達(dá)體系，有利于蛋白形成正確的構(gòu)象。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101358205SQ20081012047
公開(kāi)日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者呂正兵, 夏佳音, 張耀洲, 清 盛, 聶作明, 健 陳, 琴 陳 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)