專利名稱：一種無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組蛋白，尤其是一種無乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白。
背景技術(shù)：
奶牛乳腺炎(Dairy cow mastitis)是影響世界奶牛業(yè)健康、穩(wěn)定發(fā)展的最主要疫病之一。其病原有多種，但是無乳鏈球菌(S. agalactiae)是最主要的致病菌之一,在患乳腺炎牛乳中其檢出率達(dá)到70%左右，主要引起奶牛臨床型和隱性乳腺炎。世界各國科學(xué)家圍繞防制奶牛乳腺炎的疫苗作出了不懈努力，最終得出的結(jié)論是傳統(tǒng)的全菌體裂解疫苗、滅活疫苗、莢膜多糖混合疫苗對(duì)于無乳鏈球菌性乳腺炎均無明顯預(yù)防效果，亞單位(包括單亞單位及多亞單位)免疫制劑的研發(fā)是尋求有效防控該疾病的最好途徑，這是全世界相關(guān)領(lǐng)域認(rèn)可的結(jié)論。無乳鏈球菌是重要的人畜共感染性致病菌，在人類主要在婦女的生殖道內(nèi)居留。國外在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?yàn)榱祟A(yù)防胎兒在妊娠期或在分娩過程中嬰兒的無乳鏈球菌感染造成敗血癥或肺炎，研制的傳統(tǒng)疫苗經(jīng)實(shí)踐證明均無明顯效果，而研制的亞單位疫苗表現(xiàn)良好的免疫保護(hù)作用。而奶牛無乳鏈球菌表面蛋白磷酸甘油酸激酶(Phosphoglyceratekinase,簡稱pgk)是牛乳腺炎無乳鏈球菌重要的表面抗原性蛋白。因此研究和應(yīng)用牛源無乳鏈球菌表面蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種重組蛋白，其是奶牛無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白，相應(yīng)的，本發(fā)明還提供該重組蛋白的編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種重組蛋白，為如下I)或2)所述的蛋白
O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
2)將I)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述重組蛋白的編碼基因。優(yōu)選地，所述編碼基因是序列表中序列I所示的核苷酸序列。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種無乳鏈球菌亞單位重組蛋白的方法，是將編碼重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得重組蛋白。優(yōu)選地，所述大腸桿菌為BL21-DE3大腸桿菌。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白在檢測奶牛無乳鏈球菌性乳腺炎感染抗體和免疫抗體中的應(yīng)用。本發(fā)明的無乳鏈球菌亞單位重組蛋白具有下述效果
I由于本發(fā)明的重組蛋白是奶牛無乳鏈球菌表面蛋白磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase, pgk)亞單位基因片段重組原核表達(dá)蛋白，并非全致病菌細(xì)胞，因此應(yīng)用本發(fā)明的重組蛋白進(jìn)行檢測時(shí)絕無感染、散毒危險(xiǎn)。 本發(fā)明的制備免疫制劑 的生產(chǎn)工藝先進(jìn)、生產(chǎn)成本低，制備的免疫制劑性能穩(wěn)定、產(chǎn)品附加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。


圖1是本發(fā)明的純化后的無乳鏈球菌亞單位重組蛋白電泳 圖2是BALB/c小鼠免疫抗體檢測水平結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
一、重組蛋白的大腸桿菌體外表達(dá)
(I)、設(shè)計(jì)擴(kuò)增牛源無乳鏈球菌表面蛋白亞單位基因Pgk基因的特異性引物；
利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)了 I對(duì)擴(kuò)增Pgk基因主要抗原優(yōu)勢區(qū)序列的引物。上游引物序列為5’ -GGAGGATCCCTAATGGCTAAATTG-3’，下游引物序列為5’ -GACTAAGCTTTTTCAGTCAATGCTG-3’，劃線部分分別為引入的限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)序列。擴(kuò)增片段長度984bp。見序列表I。(2)、通過PCR擴(kuò)增獲得pgk基因片段；
PCR反應(yīng)總體系為50 μ L，其中滅菌超純化水(ddH20) 14μ LUOXPCR buffer (含Mg2+)5 μ L> dNTP mixture 4 μ L、上游引物(lOpmol/ μ L) 4 μ L、下游引物(lOpmol/μ L) 4 μ L、模板DNA 4 μ L、Taq DNA酶(5U/μ I ) I μ L、滅菌超純化水(ddH20) 14 μ L。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 5min ；94°C lmin,55°C lmin,72°C lmin，共 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 鑒定后，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量Marker標(biāo)示，從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，按DNA快速純化膠回收試劑盒操作步驟，回收擴(kuò)增產(chǎn)物。膠回收試劑盒為TAKARA產(chǎn)品。(3)、對(duì)pgk基因進(jìn)打克隆、測序鑒定；
將回收的目的DNA片段與pMD18-T克隆載體于16 °C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，用含Amp的LB瓊脂平板進(jìn)行篩選，提取重組質(zhì)粒pgk-pMD18_T，用BamHl和歷JJJ進(jìn)行單、雙酶切及PCR鑒定。將轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pgk-pMD18_T的JM109感受態(tài)細(xì)胞送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNAStar生物軟件進(jìn)行分析。(4)、將pgk基因定向亞克隆至pET_30a ( + )原核表達(dá)載體；
將測序正確的重組克隆載體pgk-pMD-18與表達(dá)載體pET30a(+)用SaMl I111進(jìn)行雙酶切后膠回收，構(gòu)建重組表達(dá)載體pgk-pET30a(+)，再將酶切及PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒pgk-pET30a(+)按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至宿主菌大腸桿菌BL21 (DE3)，得到重組菌。(5)、pgk基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)
將重組菌在LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)3h，至OD6tltlnm達(dá)到0. 65左右時(shí)，加入濃度1.00 mM/L的IPTG，在37°C下進(jìn)行誘導(dǎo)5h，其表達(dá)量最大。其表達(dá)蛋白約占菌體總蛋白的43. 2%，可溶性表達(dá)量占菌體上清總蛋白的46. 5%。二、重組蛋白的親和層析純化 (I)待純化樣的制備
離心收集表達(dá)細(xì)菌將上述步驟一中得到的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白于10000 rpm條件下離心IOmin,取沉淀，用PBS (lmol/L, ρΗ7· 4)洗滌3次，細(xì)菌沉淀被PBS溶液溶解。
裂解菌體獲取上清可溶性蛋白加入溶菌酶至終濃度為l%(lmg/ml)，冰浴 30min，然后進(jìn)行超聲處理，以懸液趨于透明、用移液槍吸吹時(shí)無明顯凝塊為度。離心取上清 (即為可溶性蛋白)并加入1%的TritionX-1OO (聚乙二醇辛基苯基醚)及l(fā)mmol/L的DTT (二硫蘇糖醇)至終濃度為lmmol/L后于_20°C保存，以備純化。
(2)表達(dá)蛋白的親合層析純化流程參照 N1-NTA His band Resin (His Trap FF crude, GE Heathcare 產(chǎn)品)操作程序進(jìn)行，然后進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot，檢測蛋白純度，如圖1所示，經(jīng)檢測，純度在95% 以上。
Western Blot鑒定使用的一抗為兔抗牛乳腺炎無乳鏈球菌抗體,二抗為羊抗兔 IgG HRP標(biāo)記抗體。
(3)表達(dá)蛋白含量的測定采用紫外線吸收法定量蛋白質(zhì)。將待檢樣品適當(dāng)稀釋后，同時(shí)測定該蛋白質(zhì)溶液在 λ 260ηπι和λ 280nm處的OD值，同時(shí)用稀釋液作為空白對(duì)照，按下列公式計(jì)算蛋白含量(1. 46 X A280 - O. 74 X A260) X 稀釋倍數(shù)=mg/ml 蛋白含量純化的Pgk蛋白的質(zhì)量濃度為彡5. 03mg/mL。
實(shí)施例2應(yīng)用本發(fā)明的重組蛋白作為檢測抗原檢測免疫小鼠免疫抗體的實(shí)驗(yàn)效果如下將本發(fā)明實(shí)施例1中制備的重組蛋白與弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant, FCA)與弗氏不完全佐劑(Freund incomplete adjuvant,FIA)按1:1等體積進(jìn)行乳化,乳化用一次性無菌注射器取稀釋后的抗原，另一支注射器取福氏完全佐劑或福氏不完全佐劑， 排除注射器內(nèi)空氣后用滅菌乳膠管連接接頭連接(防止壓力過大時(shí)乳膠管與注射器滑脫， 乳化前用細(xì)鐵絲擰緊接頭)，首先將稀釋抗原快速推入佐劑，形成油包水，然后反復(fù)快速推拉混合約10 30分鐘。當(dāng)乳化劑呈乳白色、放蒸懼水中水乳相不分離、5000rpm/min離心 5min不分層時(shí)結(jié)束乳化，制備得到牛乳腺炎無乳鏈球菌的免疫疫苗。利用制備的無乳鏈球菌Pgk重組蛋白抗原檢測該免疫疫苗免疫產(chǎn)生的抗體情況。
本發(fā)明的pgk重組蛋白抗原檢測免疫疫苗抗體效果如下將該免疫疫苗對(duì)BALB/c小鼠免疫三次(間隔7d)后，第一次免疫用福氏完全佐劑乳化重組抗原，劑量為ImL/只，背部皮下分3點(diǎn)接種；第二次用福氏不完全佐劑乳化重組抗原， 劑量為ImL/只，背部皮下分3點(diǎn)接種；第三次免疫用非乳化重組蛋白抗原進(jìn)行免疫，劑量為 ImL/只， 背部皮下分3點(diǎn)接種。第三次免疫后35天其抗體滴度達(dá)到1:4000。見圖2(抗體檢測水平效果)。
最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種無乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白為如下I)或2)所述的蛋白 O由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將I)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述的無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白的編碼基因，其特征在于所述編碼基因是序列表中序列I所示的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組菌。
5.一種高效表達(dá)權(quán)利要求1所述無乳鏈球菌Pgk亞單位重組蛋白的方法，是將編碼重組蛋白的基因?qū)氲酱竽c桿菌中，表達(dá)獲得重組蛋白。
6.權(quán)利要求1所述的無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白在檢測奶牛乳腺炎無乳鏈球菌感染抗體及疫苗免疫抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種無乳鏈球菌pgk亞單位重組蛋白及其制備方法。本發(fā)明的重組蛋白為如下1)或2)所述的蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將1)限定的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有與序列表中序列2相同活性的由序列表中序列2衍生的蛋白質(zhì)。應(yīng)用本發(fā)明制備的重組蛋白進(jìn)行檢測時(shí)無感染、散毒危險(xiǎn)；且本發(fā)明的制備免疫制劑的生產(chǎn)工藝先進(jìn)、生產(chǎn)成本低，制備的免疫制劑性能穩(wěn)定、產(chǎn)品附加值高，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。
文檔編號(hào)G01N33/53GK103060284SQ201310007468
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者布日額, 吳金花, 張海寶 申請人:內(nèi)蒙古民族大學(xué)