專利名稱：用于增加植物病原性防御的活性物質(zhì)及其發(fā)現(xiàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物病原防御的化合物的方法，其中單個或多個植物內(nèi)源性基因表達的增強被認作為誘導(dǎo)的標志，所述基因選自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR-蛋白(病原相關(guān)蛋白)和植物殼多糖酶，并且涉及這些化合物單獨或與特異且直接地抵抗植物病原的化合物組合使用的用途，其能夠?qū)崿F(xiàn)同時或間隔施用。
已知植物以特異性的或非特異性的防御機制應(yīng)答自然界的應(yīng)激條件，例如寒冷、熱、干燥、創(chuàng)傷、病原侵襲(病毒、細菌、真菌、昆蟲)等等，也應(yīng)答除草劑[Pflanzenbiochemie，第393-462頁，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，Berlin，Oxford，Hans W.Heldt，1996.；Biochemistry and Molecular Biology of Plants，第1102-1203頁，American Society of Plant Physiologists，Rockville，Maryland，eds.Buchanan，Gruissem，Jones，2000]。其中，例如由創(chuàng)傷產(chǎn)生的細胞壁成分或特異來源于病原的信號物質(zhì)，起植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈誘導(dǎo)物的作用，并最終導(dǎo)致形成直接對抗應(yīng)激物的防御分子。在此，例如涉及(a)低分子量物質(zhì)，如植物抗毒素，(b)非酶的蛋白，如“病原相關(guān)蛋白”(PR-蛋白)，(c)酶蛋白，如殼多糖酶、葡聚糖酶，或(d)基礎(chǔ)蛋白的特異性抑制因子，如蛋白酶抑制因子，木聚糖酶抑制因子，這些物質(zhì)直接攻擊病原或阻斷其繁殖(Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Kessler和Baldwin，2003，Annual Review of Plant Biology，53299-328)。
另一種防御機制是所謂的過敏性反應(yīng)(HR)，其由氧化應(yīng)激介導(dǎo)，導(dǎo)致感染中心周圍的植物組織死亡，阻止依賴于活細胞的植物病原擴散[Pennazio，1995，New Microbiol.18，第229-240頁]。
在進一步的感染過程中，信號由植物信使物質(zhì)傳遞到未感染組織內(nèi)，在未感染組織內(nèi)該信號再次激發(fā)防御應(yīng)答并阻止繼發(fā)性感染的形成(系統(tǒng)獲得性抗性，SAR)[Ryals等，1996，The Plant Cell81809-1819]。
參與應(yīng)激耐受或病原防御的一系列植物內(nèi)源性信號物質(zhì)是已知的。可以提及的有下列物質(zhì)水楊酸、苯甲酸、茉莉酸或乙烯[Biochemistryand Molecular Biology of Plants，第850-929頁，American Societyof Plant Physiologists，Rockville，Maryland，eds.Buchanan，Gruissem，Jones，2000]。這些物質(zhì)或其穩(wěn)定合成衍生物和其衍生結(jié)構(gòu)中的某些物質(zhì)，當外部施用于植物或作種子拌種的情形下也是有效的，并激活導(dǎo)致植物應(yīng)激增強或病原耐受的防御反應(yīng)[Sembdner，和Parthier，1993，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.44569-589]。水楊酸介導(dǎo)的防御能直接特異性地抵抗植物病原性真菌、細菌和病毒[Ryals等，1996，The Plant Cell 81809-1819]。
苯并噻重氮(商品名BionU)是一種已知具備與水楊酸可比效力的合成產(chǎn)品，它能介導(dǎo)對植物病原性真菌、細菌和病毒的保護效力[Achuo等，2004，Plant Pathology 53(1)65-72]。
屬于氧化脂類(Oxylipine)的其它化合物比如，茉莉酸和其觸發(fā)的保護機制，能有效對抗有害昆蟲[Walling，2000，J Plant GrowthRegul.19，195-216]。
已知，植物具備多種的內(nèi)源性反應(yīng)機制，所述機制能產(chǎn)生對各種有害生物體和/或自然非生物應(yīng)激的有效防御。然而，針對何種防御反應(yīng)可通過施用活性成分而引起的預(yù)測，迄今為止還不為所知。
因此需要一種針對性發(fā)現(xiàn)對抗有害生物體和/或自然非生物應(yīng)激(比如，熱、寒冷、干燥、鹽漬和酸/堿應(yīng)激)的植物內(nèi)源性防御機制的分子激活劑的方法，通過該方法可以發(fā)現(xiàn)新的活性成分，鑒定出新的具有已知特性的、也包括其它作用類型的活性物質(zhì)，或可以將其他已知分子或先導(dǎo)結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化用作植物內(nèi)源性防御機制的誘導(dǎo)劑。
本文所用術(shù)語的定義本文所用的術(shù)語“Blast分析”(Blast＝基礎(chǔ)局部對準排列查詢工具(Basic Local Alignment Search Tool))描述了利用適合的計算機程序歸類并發(fā)現(xiàn)潛在的同源序列(Altschul等，J.Mol.Biol.1990，215403-410)，按照以“顯著標準”(得分函數(shù))形式設(shè)定的所期望的一致性，對查詢序列和一個或多個數(shù)據(jù)庫中的全部序列進行比對(對準排列)(R.Rauhut，Bioinformatik，第38-107頁，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2001)。
本文所用術(shù)語“cDNA”(互補DNA)描述互補于RNA且在體外通過酶促反轉(zhuǎn)錄合成的DNA單鏈。該cDNA相應(yīng)于全長RNA或者僅表現(xiàn)為用作模板的RNA的部分序列。
本文中所用術(shù)語“簇分析”意思是指獲取的獨立數(shù)據(jù)通過開發(fā)用于簇分析的計算機程序進行總結(jié)，將編碼相似功能的蛋白的基因群組，或者具有相似表達模式的基因匯總顯示。從而獲得以樹形圖形式顯示的分級最小化的復(fù)合數(shù)據(jù)模式。簇分析使得對獲得的數(shù)據(jù)集進行分類評價成為可能，而所述的獲得的數(shù)據(jù)集明顯建立于對無關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)的單純的累積。
術(shù)語“DNA芯片”、“DNA陣列”和“DNA微陣列”，在本文中含義相同，應(yīng)理解為意指一種支持體，該支持體的基材例如由玻璃或尼龍構(gòu)成，在其基材上固著DNA片段，在此DNA的加載可以例如通過(a)光刻技術(shù)(直接在陣列的支持體上合成DNA)，(b)微點觸(Microspotting)法(將外部合成的寡核苷酸或PCR產(chǎn)物施用到支持體上并共價鍵結(jié)合)，或(c)微噴射法(用墨噴印刷機不接觸地將外部合成的寡核苷酸或PCR產(chǎn)物噴射到支持體上)進行(R.Rauhut，Bioinformatik，第197-199頁，Verlag Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim，2001)。代表生物體基因組序列的DNA芯片稱為“基因組DNA芯片”。使用這些“DNA芯片”獲得的數(shù)據(jù)稱為“DNA芯片分析”。
本文所用術(shù)語“DNA芯片雜交”意思是指兩條單鏈的互補核酸分子配對，一個堿基配對分子固定在DNA芯片上作為DNA(脫氧核糖核酸)，優(yōu)選以共價鍵形式，而另一個以RNA(核糖核酸)或?qū)Υ讼鄳?yīng)的cDNA(互補DNA)形式存在于溶液中。結(jié)合和未結(jié)合的核酸在水性緩沖溶液中的DNA芯片上進行雜交。在存在二甲基亞砜，溫度為30-60℃，優(yōu)選40-50℃，特別優(yōu)選在45℃下持續(xù)晃動10-20小時，優(yōu)選14-18小時，特別優(yōu)選16小時。所述雜交條件可以例如在雜交爐中恒定地實現(xiàn)。按照標準，在所述雜交爐中以60rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))晃動。
本文中的核酸序列，當使用術(shù)語“EST序列”(表達序列標記)時，意思是指200-500個堿基或堿基對的短序列。
如本文中所用，術(shù)語“表達模式”、“誘導(dǎo)模式”和“表達譜”含義相同，描述了植物mRNA的時間性差異的和/或組織特異的表達，該模式借助DNA芯片技術(shù)直接通過由源自該植物的RNA或其相應(yīng)cDNA產(chǎn)生的雜交信號強度獲得。所測定的“表達值”是通過對利用同義芯片與未處理的對照植物雜交而獲得的相應(yīng)信號直接進行計算而得到的。
如本文中所用，術(shù)語“表達狀態(tài)”，是通過所進行的“基因表達譜分析”而獲得的，描述了使用DNA芯片測定的所有細胞基因的轉(zhuǎn)錄活性。
如本文中所用，術(shù)語“全部RNA”描述了可能存在于植物細胞中的能用提取法獲得的不同植物內(nèi)源性RNA群組結(jié)果，如胞質(zhì)rRNA(核糖體RNA)、胞質(zhì)tRNA(轉(zhuǎn)移RNA)、胞質(zhì)mRNA(信使RNA)，和其各自的核前體，ctRNA(葉綠體RNA)和mtRNA(線粒體RNA)，還包括來源自外源生物體如病毒或寄生細菌和真菌的RNA分子。
如本文中所用，術(shù)語“有用植物”是指農(nóng)作物植物，所述植物是被用作獲得食物、飼料或工業(yè)目的的植物。
如本文中所用，術(shù)語“安全劑”表示非植物內(nèi)源性來源的化合物，該化合物能消除或減少殺蟲劑對農(nóng)作物植物的植物毒性，而基本不降低殺蟲劑對有害生物體如雜草、細菌、病毒和真菌的殺蟲活性。
本發(fā)明涉及一種發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物病原防御的化合物的方法，其中單個或多個植物內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄或表達的增強被認作為誘導(dǎo)的標志，所述基因選自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和植物殼多糖酶。
本發(fā)明尤其涉及一種發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)編碼病原-防御植物內(nèi)源性酶的基因轉(zhuǎn)錄的化合物的方法，其中a)將待測植物與合適量的一種或多種待測物質(zhì)接觸，b)另外，將對照植物置于與a)的待測植物相同的條件下，但不接觸待測物質(zhì)，c)從待測植物和對照植物中提取RNA，d)RNA直接進行放射性標記或非放射性標記，或在同時用酶轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA時RNA進行放射性標記或非放射性標記，或?qū)⑾惹八玫姆菢擞浀腸DNA酶促轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的放射性標記或非放射性標記的cRNA，e)步驟d)所得的物質(zhì)與含植物DNA序列的DNA陣列雜交，f)以比較a)和b)中所測植物的方式建立表達茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶的基因表達譜，g)對步驟f)所測定的表達差異進行定量，和h)利用簇分析對g)所歸納的表達譜進行最終的系統(tǒng)分組。
在上述步驟d)的情況下，將所得cDNA酶促轉(zhuǎn)錄為cRNA作為優(yōu)選步驟，因為這樣可以再次對雜交探針進行擴增。同樣，優(yōu)選用非放射性核苷酸標記，特別優(yōu)選用生物素化的UTP和/或CTP來標記，一旦雜交反應(yīng)開始，就可以通過作熒光團的鏈霉抗生物素-藻紅蛋白與生物素化cRNA的結(jié)合來檢測出。雜交后，在激光掃描器的幫助下，對作為測定表達差異量化基礎(chǔ)的特異性藻紅素熒光性進行檢測。
本發(fā)明的優(yōu)選對象是遵循上述步驟a)-h)的方法過程的方法，其中(i)脂酶樣蛋白，12-氧代植物二烯酸酯(Oxophytodienoate)還原酶(EC 1.3.1.42)，烯二烴氧化物環(huán)化酶(Allene-oxide Cyclase)，12-氧代植物二烯酸還原酶的基因表達譜，和/或(ii)植物蛋白酶抑制劑的基因表達譜，該抑制劑與PIR蛋白數(shù)據(jù)庫登記號S71555的蛋白酶抑制劑有顯著同源性，和/或(iii)植物木聚糖酶抑制蛋白的基因表達譜，和/或(iv)植物的病原誘導(dǎo)的過氧化物酶(EC 1.11.1.7)的基因表達譜，該蛋白是與PIR蛋白數(shù)據(jù)庫中T06168號大麥病原相關(guān)的(PR)蛋白有顯著同源性的蛋白，和/或(v)植物殼多糖酶的基因表達譜，相比未處理的對照植物提高2倍或更多，優(yōu)選提高2-100，更優(yōu)選2-20，特別優(yōu)選2-10，尤其非常優(yōu)選2-5，其中各基因彼此獨立的經(jīng)改變的表達譜的提高可以在不同的上述范圍之內(nèi)。
本發(fā)明進一步涉及某些DNA微陣列的用途，該微陣列基于來自植物的遺傳信息，優(yōu)選來自有用植物的遺傳信息，特別優(yōu)選從有用植物如大麥、玉米、小麥、水稻、燕麥、油菜、甜菜的遺傳信息中發(fā)現(xiàn)改變的基因表達模式。在本文中，與未處理的對照植物相比，在用待測化合物處理的植物中觀察到了茉莉酸生物合成基因、植物蛋白酶抑制因子基因、植物木聚糖酶抑制因子基因、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)基因和/或植物殼多糖酶基因的基因模式的相對改變。
本發(fā)明進一步還涉及在上述方法中鑒定為陽性的化合物的用途，即在它們對作為在有用植物中提高應(yīng)激耐受和/或病原防御的活性成分的茉莉酸生物合成基因、植物蛋白酶抑制因子基因、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)基因和/或植物殼多糖酶基因的誘導(dǎo)效力方面的表達提高。
因此，本發(fā)明還涉及化合物在植物中，如由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈直接或間接賦予對植物病原性生物體的增強防御的用途，所述植物病原性生物體例如具有至少一種基因，優(yōu)選選自下組蛋白中的蛋白的多個基因的昆蟲、真菌、細菌或病毒，所述蛋白選自具有增強表達譜的茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶蛋白。
在本文中優(yōu)選已知在農(nóng)作物保護中用作熟知安全劑的化合物，例如吡咯二酸二甲酯(Mefenpyr-dimethyl)、吡唑解草酯、吡咯二酸酯類似物、雙苯唑乙酸、解草酯、解草酯衍生物和吡啶羧酰胺(Pyridincarboxamid)。
使用上述化合物，很可能能有效保護農(nóng)作物植物防御植物病原性生物體(昆蟲、真菌、細菌、病毒)，還能例如獲得更高產(chǎn)量。對于直接針對這些生物體的活性成分而言，優(yōu)勢在于由于它們不會激發(fā)相應(yīng)防御反應(yīng)而保護了有用植物(Nützlinge)。
因此，本發(fā)明還涉及保護有用植物農(nóng)作物中的有用植物抵抗植物病原性生物體，尤其是針對昆蟲、真菌、細菌和病毒的方法，其通過施用借助于DNA陣列考慮茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶的基因表達譜而鑒定出的化合物。特別優(yōu)選所述保護針對植物病原性生物體，尤其針對昆蟲，特別是針對未成熟昆蟲。
通過借助于DNA陣列鑒定的化合物，例如也通過已知作為安全劑的化合物所激發(fā)的上述機制還能夠?qū)е逻@些化合物和特異且直接抵抗植物病原有效的其它化合物之間的協(xié)同效力，所述其它化合物諸如殺蟲劑和殺真菌劑，尤其當與殺真菌劑和殺蟲劑同時或間隔施用時，尤其是殺蟲劑，例如來自酮-烯醇組的化合物[例如EP 528156；EP 596298中]，或煙堿乙酰膽堿受體的激動劑或拮抗劑組中的化合物。最后提及的化合物歸組于術(shù)語硝基亞甲基或硝基亞胺和相關(guān)化合物內(nèi)(如EP 464830中)。
因此，本發(fā)明還涉及通過借助DNA陣列考慮茉莉酸生物合成、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶的基因表達譜而篩選鑒定出的化合物與特異且直接對抗植物病原的現(xiàn)有技術(shù)化合物組合的用途，例如吡咯二酸衍生物(如“農(nóng)藥手冊，第13版，2003”中所列Nr.506化合物)和直接作用于有害生物體的殺蟲劑組合，特別優(yōu)選和來自酮-烯醇組或硝基亞甲基/硝基亞胺組的殺蟲劑組合，或者使用雙苯唑酸衍生物(如“農(nóng)藥手冊，第13版，2003”中所列Nr.478化合物)和直接作用于有害生物體的殺蟲劑的用途，在此可同時或間隔施用。當不采用同時施用時，可在施用采用本文所述DNA陣列方式鑒定出的化合物之前或之后施用直接作用于有害生物體的殺蟲劑，優(yōu)選隨后施用直接作用于有害生物體的殺蟲劑。
下面將通過實施例進一步詳細描述本發(fā)明。
實施例1安全劑通過進行基因表達譜(GEP)對植物中防御機制的作用的驗證在有土的盆內(nèi)(直徑10cm)，在環(huán)境柜內(nèi)，于設(shè)定的光照、濕度和溫度條件下(白光、70％大氣濕度、24℃)種植大麥植物(Baronesse變種)10天。在進行噴灑時，幼苗大小約15cm。本實施例中選定的待測物質(zhì)是結(jié)構(gòu)顯著不同且具備良好安全劑效應(yīng)的分子，和從文獻已知具備植物應(yīng)激和病原耐受效應(yīng)的其它分子(表1)。以DMSO(二甲基亞砜)為c＝10mg/ml制備待測物質(zhì)原液。用該原液制備含作濕潤劑的0.2％Agrotin(包含聚乙烯醇、硅酮、多糖和pH調(diào)節(jié)劑，生產(chǎn)商BayerCropScience AG，Monheim，德國)的水稀釋液，以獲得表中所示的施用量。噴灑施用的液體量相應(yīng)于800l/ha是每盆800μl。每800μl噴灑混合物中，另外添加16μl的EC預(yù)混物∶二丙酮醇＝1∶6作輔助制劑。用氣壓噴槍將表1所列物質(zhì)施于葉片上。分別以2倍劑量噴灑，所有實驗都重復(fù)實施(每種物質(zhì)噴灑2盆)。用無活性成分的空白制劑噴灑作為對照。6小時后，采集葉片，在液氮中驟凍，-80℃保存?zhèn)溆?。按照Affymetrix(Affymetrix Inc.，3380 Central Expressway，SantaClara，CA，USA)的方案(Expression Analysis，Technical Manual)制備DNA芯片雜交所用的經(jīng)標記的RNA探針。首先，從各500mg采集葉片中分離總RNA。各10μg總RNA用于第一鏈和第二鏈cDNA合成。用T7聚合酶進行cDNA擴增，同時用生物素-UTP進行標記。各20μg所述生物素化的cDNA用于Affymetrix的大麥基因組陣列(基因芯片大麥1，編號511012)的雜交。該DNA微陣列包含22840個基因的DNA序列，所述基因組成了總共400000個EST序列。然后，在AffymetrixFluidicsStation中洗滌該DNA微陣列，用鏈霉抗生物素/藻紅蛋白(分子探針，P/N S-866)染色，并用匹配的Agilent激光掃描儀掃描(Agilent基因陣列掃描儀)。用Affymetrix的Microarray Suite 5軟件分析獲得的熒光數(shù)據(jù)。在核實特性后，將所有DNA芯片分析都存于數(shù)據(jù)庫中。為了測定基因的相對表達值(誘導(dǎo)因素，抑制因素)，將檢測芯片和對照芯片相互進行對比，以Affymetrix軟件設(shè)定的顯著標準為依據(jù)。用各2個對照芯片(空白制劑)對一個實驗中的生物重復(fù)的兩個樣品進行比較，所獲得的每個基因各4個表達值通過中值計算表示。這些中值在表格中作為誘導(dǎo)因素給出。利用Applied Maths的GeneMaths通過1.5軟件(Applied Maths，Keistraat 120，9830 Sint-Martens-Latem，Belgium)進行不同實驗的表達譜的相似性比較和簇分析。
來自特定代謝途徑和信號傳導(dǎo)鏈的基因群組通過在Affymetrix提供的基因注釋中的關(guān)鍵詞搜索以及DNA靶序列的Blast分析而被整理在一起，所述DNA靶序列，即在DNA芯片上鑒定出的陽性(通過表達譜的改變而被鑒定出來)序列來自其它生物體，優(yōu)選植物生物體的具有功能性特征的基因序列。
表1
上述表1中所用檢測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式
對源自與應(yīng)激耐受和病原防御相關(guān)的信號傳導(dǎo)鏈和代謝途徑的基因群組的檢查，揭示了至今已知作用為安全劑(S1-S6)的一組化合物尤其針對蛋白酶和木聚糖酶的抑制因子的基因和茉莉酸生物合成基因(表2a)，以及PR蛋白和殼多糖酶基因(表2b)的高水平誘導(dǎo)。
表2a
對以下經(jīng)測定的表達值(未處理對照表達值的x倍)(a)植物茉莉酸生物合成基因(1.1-1.20)(b)編碼植物蛋白酶抑制因子的基因(2.1-2.4)(c)編碼植物木聚糖酶抑制因子的基因(3.1)“探針組”編號對應(yīng)于Affymetrix芯片上的相應(yīng)DNA芯片位置。
利用Blast分析，可將最可能來自其它注釋序列數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)已知序列順序賦值給“探針組”編號。Blast分析中所示數(shù)據(jù)顯示如下。
“探針組”編號 來自公開DNA或蛋白數(shù)據(jù)庫具備注釋功能的相應(yīng)序列1.1脂酶樣蛋白(稻(Oryza sativa)；japonica cultivar組)1.2脂肪氧化酶(EC 1.13.11.12)大麥gbAAB708651.3烯二烴氧化物合酶(大麥亞屬大麥(Horedeum vulgaresubsp.vulgare))1.4可能的12-氧代植物二烯酸酯還原酶(EC 1.3.1.42)1.5烯二烴氧化物環(huán)化酶(稻；japonica cultivar組)1.6烯二烴氧化物環(huán)化酶(稻；japonica cultivar組)1.712-氧代植物二烯酸還原酶(稻)1.812-氧代植物二烯酸酯還原酶3(番茄(Lycopersiconesculentum))1.9GDSL-基元脂酶/類水解酶蛋白，At5g55050.11.10脂肪氧化酶1pir T05941(EC 1.13.11.12)大麥1.11推定的脂肪氧化酶(稻；japonica cultivar組)1.12類似于脂酶(擬南芥(Arabidopsis thaliana)；gbAAM20450.1)1.13推定的脂酶同系物(稻；japonica cultivar組)1.14茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的脂肪氧化酶gbAAC12951.11.15可能的脂肪氧化酶gbAAB60715.11.16烯二烴氧化物合酶(大麥亞屬大麥(Hordeum vulgaresubsp.vulgare))1.17類似于脂酶(擬南芥；gb AAM20450.1)1.1812-氧代植物二烯酸還原酶(稻)1.1912-氧代植物二烯酸還原酶(稻)1.2012-氧代植物二烯酯還原酶(OPR1)At1g76680.1“探針組”編號 來自公開DNA或蛋白數(shù)據(jù)庫具備注釋功能的相應(yīng)序列2.1Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑2.2推定的蛋白酶抑制劑(大麥亞屬大麥(Hordeum vulgaresubsp.Vulgare))2.3推定的蛋白酶抑制劑(大麥亞屬大麥(Hordeum vulgaresubsp.Vulgare))2.4蛋白酶-抑制劑(pir S71555，大麥)3.1木聚糖酶抑制劑蛋白(小麥(Triticum aestivum))表2b
對以下經(jīng)測定的表達值(未處理對照表達值的x倍)(a)編碼植物PR蛋白的基因(4.1-4.3)(b)編碼植物殼多糖酶的基因(5.1-5.3)“探針組”編號對應(yīng)Affymetrix芯片上的相應(yīng)DNA芯片位置。利用Blast分析，可將最可能來自其它注釋序列數(shù)據(jù)庫的相應(yīng)已知序列順序賦值給“探針組”編號。Blast分析中所示數(shù)據(jù)顯示如下。
“探針組”編號 來自公開DNA或蛋白數(shù)據(jù)庫具備注釋功能的相應(yīng)序列4.1過氧化物酶(EC 1.1 1.1.7)，病原誘導(dǎo)的(大麥)4.2病原-相關(guān)蛋白；(稻；gbAAL74406.1)4.3病原-相關(guān)蛋白(大麥；PirT06168)5.1殼多糖酶(EC 3.2.1.14)(大麥；embCAA55344.1)5.2殼多糖酶(EC 3.2.1.14)(大麥；embCAA55344.1)5.3III類殼多糖酶(稻亞屬粳稻；gbAAM08773.1)由這些表格衍生而成并且直接以所得表達值顯示的誘導(dǎo)模式顯示了安全劑和抗性誘導(dǎo)劑之間的特性區(qū)別，在雙苯唑酸情況下最能判斷對茉莉酸生物合成酶的作用。建立的表達模式能夠發(fā)現(xiàn)具有相似特征的物質(zhì)，并且能夠預(yù)見這些物質(zhì)具備植物病原防御活性方面的相似效力。
實施例2安全劑處理的植物對植物病原性昆蟲的驅(qū)避效力如實施例1所述培養(yǎng)大麥植物(Baronesse種)，10天后，以150ga.i./ha雙苯唑乙酸(S3)或空白制劑噴施處理。每次實驗重復(fù)處理各10盆。
施用物質(zhì)6小時或24小時后，統(tǒng)一用植物病原性蚜蟲禾谷縊管蚜(Rhopalosiphum padi)群侵襲每盆植物。7天和14天后通過計算葉片上的動物數(shù)量對實驗進行評價。
7天后，安全劑處理的植物上的蚜蟲數(shù)量比對照平均少50％，14天后少70％。
在未處理植物Sachez試驗中，未檢測到雙苯唑乙酸(S3)對蚜蟲的直接毒性。
實施例3在雙苯唑酸-處理的植物中提高氧代植物二烯酸酯(OPDA)和茉莉酸酯(JA)濃度的驗證在如實施例1所述條件下培養(yǎng)大麥植物(Baronesse變種)，并用安全劑雙苯唑乙酸(S3)噴施處理。
施用量選擇如下(1)30[g a.i./ha]；(2)150[g a.i./ha]；(3)空白制劑(無活性成分)在處理(h＝小時)，即1h，2h，4h，6h，12h，24h和48h后，在各時間點采集植物葉片。將所有樣品各重復(fù)3盆。
按照文獻(Müller A，Düchting P and Weiler EW(2002)，Amultiplex GC-MS/MS technique for the sensitive and quantitativesingle-run analysis of acidic phytohormones and relatedcompounds，and its application to Arabidopsis thaliana.Planta，216，44-56))中所述步驟從葉片中加工獲得十八烷酸鹽(Octadecanoide)和茉莉酸酯。
從各測定點提取300mg植物材料。
50pmol[13C]2-JA和100pmol[17，17，17，18，18-2H]-順-OPDA用于內(nèi)標準化。提取物通過在內(nèi)部制備的微型固相交換柱中的氨丙基陰離子交換層析進行純化。
結(jié)果示于表3a至3d，所示各值是3次重復(fù)的平均值。
表3a葉組織中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)濃度pmol/g
表3b葉組織中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)濃度pmol/g
表3c葉組織中的茉莉酸酯(JA)濃度pmol/g
表3d葉組織中的茉莉酸酯(JA)濃度pmol/g
當葉片組織中的茉莉酸酯(JA)濃度在70-800pmol/g范圍內(nèi)時，葉片組織中的氧代植物二烯酸酯(OPDA)濃度在1800-9000pmol/g范圍內(nèi)。用雙苯唑酸(S3)處理后，測定的兩物質(zhì)濃度都顯著提升至約為無活性成分的空白制劑樣品的5倍。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物病原防御的化合物的方法，其中單個或多個植物內(nèi)源性基因表達的增強被認作為誘導(dǎo)的標志，所述基因選自茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和植物殼多糖酶。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，a) 將待測植物與合適量的一種或多種待測物質(zhì)接觸，b) 另外，將對照植物置于與a)的待測植物相同的條件下，但不接觸待測物質(zhì)，c) 從待測植物和對照植物中提取RNA，d) RNA直接進行放射性標記或非放射性標記，或RNA在同時用酶轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)cDNA時進行放射性標記或非放射性標記，或?qū)⑾惹八玫姆菢擞浀腸DNA酶促轉(zhuǎn)錄為相應(yīng)的放射性標記或非放射性標記的cRNA，e) 步驟d)所得的物質(zhì)與含植物DNA序列的DNA陣列雜交，f) 以比較a)和b)中所測植物的方式建立表達茉莉酸合成基因、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶的基因表達譜，g) 對步驟f)所測定的表達差異進行定量，和h) 利用簇分析對g)所歸納的表達譜進行最終的系統(tǒng)分組。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中(i)脂酶樣蛋白，12-氧代植物二烯酸酯還原酶(EC 1.3.1.42)，烯二烴氧化物環(huán)化酶，12-氧代植物二烯酸還原酶的基因表達譜，和/或(ii)植物蛋白酶抑制劑的基因表達譜，該抑制劑與PIR蛋白數(shù)據(jù)庫登記號S71555的蛋白酶抑制劑有顯著同源性，和/或(iii)植物木聚糖酶抑制蛋白的基因表達譜，和/或(iv)植物病原誘導(dǎo)的過氧化物酶(EC 1.11.1.7)的基因表達譜，該蛋白是與PIR蛋白數(shù)據(jù)庫中T06168號大麥病原相關(guān)蛋白有顯著同源性的蛋白，和/或(v)植物殼多糖酶的基因表達譜，相比未處理的對照植物被提高2倍或更多。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中(i)-(v)中所述的一種或多種基因的表達譜被提高2-20倍。
5.在植物中直接或間接有助于針對植物病原性生物體的防御力增強的化合物的用途，其中至少一種，優(yōu)選多種編碼下述蛋白的基因具有增強的表達譜茉莉酸合成蛋白、植物蛋白酶抑制因子、植物木聚糖酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶。
6.權(quán)利要求5所述的化合物用途，所述化合物已知在農(nóng)作物保護中用作所謂的安全劑。
7.權(quán)利要求5或6所述的用途，其中所述化合物由權(quán)利要求2-4所述方法鑒定出。
8.權(quán)利要求6所述的化合物用途，其中所述化合物是吡咯二酸二甲酯、吡唑解草酯、吡咯二酸酯類似物、雙苯唑乙酸、解草酯、解草酯衍生物和吡啶羧酰胺。
9.權(quán)利要求5-8中任一項所述的用途，其中所述化合物在有用植作物中與針對植物病原特異且直接有效的已知化合物組合施用，以改善對植物病原性生物體的防御力，且所述施用可以同時或間隔進行。
10.權(quán)利要求9所述的用途，其中吡咯二酸酯衍生物或雙苯唑酸衍生物與直接對有害生物體起作用的殺蟲劑組合。
11.權(quán)利要求10所述的用途，其中，在吡咯二酸酯衍生物的情況下，直接對有害生物體起作用的殺蟲劑相應(yīng)于酮-烯醇或硝基亞甲基/硝基亞胺。
12.通過施用用于在植物中直接或間接提高對抗植物病原性生物體的防御力的化合物，保護有用植物農(nóng)作物中的有用植物抵抗植物病原性生物體的方法，所述至少一種，優(yōu)選多種編碼下述蛋白的基因具有增強的表達譜茉莉酸合成蛋白、植物木聚糖酶抑制因子、植物蛋白酶抑制因子、植物PR蛋白(病原相關(guān)蛋白)和/或植物殼多糖酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)植物病原防御的化合物的方法，其中單個或多個植物內(nèi)源性基因表達的增強被認作為誘導(dǎo)的標志，所述基因選自茉莉酸合成基因，植物蛋白酶抑制因子，植物木聚糖酶抑制因子，植物PR－蛋白(病原相關(guān)蛋白)和植物殼多糖酶，并且涉及這些化合物單獨或與特異且直接地抵抗植物病原的化合物組合使用的用途，其能夠?qū)崿F(xiàn)同時或間隔施用。
文檔編號G01N33/50GK1985008SQ200580023479
公開日2007年6月20日 申請日期2005年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者K·巴爾奇, A·舒爾茨 申請人:拜爾作物科學(xué)有限公司