專利名稱：一種微量植物鮮樣中茉莉酸和茉莉酸甲酯的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定方法，是一種針對(duì)微量植物鮮樣中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯 (MeJA)含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
茉莉酸類化合物包括JA、MeJA以及其它衍生物是廣泛存在于植物體內(nèi)的植物生 長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。JA作為一類植物激素已得到國(guó)際學(xué)術(shù)界的公認(rèn)，具有誘導(dǎo)植物防御基因的表 達(dá)，誘導(dǎo)多種次生代謝物的合成，抑制光合作用，促進(jìn)呼吸作用、氣孔關(guān)閉、葉片衰老脫落以 及果實(shí)成熟等廣泛的生理功能。近年來(lái)研究表明JA是植物受外界刺激后反應(yīng)最快的信號(hào) 分子，也是信號(hào)途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子。目前植物中JA的研究已成為熱點(diǎn)，而JA含量的測(cè) 定則是限制JA研究的技術(shù)瓶頸。JA和MeJA在植物組織中含量極微，揮發(fā)性很強(qiáng)，增加了對(duì)其進(jìn)行提取和分析的困 難，要求分析手段具有很高的靈敏度和選擇性。Albrecht等(199 運(yùn)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定了 JA的含量，Baldwin等(1997)用氨丙基柱純化樣品，通過(guò)GC-MS技術(shù)測(cè)定了傷誘導(dǎo)植物中 JA的含量。酶聯(lián)免疫法準(zhǔn)確性較差，氨丙基柱不易回收利用，成本高。因此，急需采用微量 植物樣品中JA和MeJA的提取純化和測(cè)定新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是克服原有檢測(cè)技術(shù)中對(duì)樣品需求量大，且操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的不 足，提供一種微量植物鮮樣中的JA和MeJA的檢測(cè)方法。本發(fā)明用于對(duì)微量植物鮮樣中JA 和MeJA的檢測(cè)，具有分析成本低，分析速度快，靈敏度高，且有較好的可重復(fù)性和選擇性， 能夠較好的分離和獲得JA和MeJA的檢測(cè)峰，同時(shí)簡(jiǎn)化提取和純化的步驟。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案主要包括如下步驟1)制備JA和MeJA 的提取純化的反向碳十八固相萃取柱；幻采用固相萃取柱法提取和純化植物鮮樣中JA和 MeJA ；3)樣品檢測(cè)植物樣品提取純化后，LC-MS-MS檢測(cè)其JA和MeJA含量。本發(fā)明所確定的固相萃取法為植物鮮樣中JA和MeJA提取純化最佳方法。所述 的JA和MeJA的提取純化的固相萃取柱的制備，取內(nèi)徑為5. 6mm的SPE柱體，放入聚乙烯篩 板后，添加反向碳十八填料，平衡柱子后即可。所述的固相萃取柱法分離、純化植物鮮樣中 JA和MeJA，樣品置于離心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇浸提過(guò)夜，4800g離心 IOmin,取上清，剩余殘?jiān)?00 μ L 100%的甲醇浸提2h，4800g離心lOmin，取上清，合并兩 次上清液。用3000 μ L超純水稀釋，過(guò)固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲 醇分別洗脫后，用300 μ L 100%甲醇洗脫并收集茉莉酸及茉莉酸甲酯。所述的LC-MS-MS檢 測(cè)樣品中JA和MeJA含量，主要碎片離子為m/z 133 (JA)，m/zl51 (MeJA)，所述的色譜保留 時(shí)間分別為16. 27min和17. 19min。本發(fā)明的檢測(cè)原理本發(fā)明中提取純化方法——固相萃取法，采用固相萃取柱作 為分離媒介，通過(guò)小柱中的填料吸附目的物，采用梯度洗脫的方式，可以有效的去除雜質(zhì)而保留目的物，并使樣品回收率和重現(xiàn)性得到保障。本發(fā)明采用的串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)檢測(cè) 限可達(dá)0. 03PPb (JA)和0. 075PPb (MeJA)，能夠檢測(cè)到微量樣品中極低的JA和MeJA含量， 且分離效果明顯好于HPLC，且HPLC需要較多量的樣品才能檢測(cè)到樣品中的JA和MeJA，因 此，在很難獲得大量植物樣品(如擬南芥突變體等植物材料)的情況下，利用本發(fā)明建立的 固相萃取法分離和串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)就可解決這一難題。本發(fā)明的效果是利用本發(fā)明對(duì)微量植物樣品中的JA和MeJA的提取純化液進(jìn)行 LC-MS-MS分析，在20min中內(nèi)可以完成測(cè)定，檢測(cè)限可達(dá)0. 03PPb (JA)和0. 075PPb (MeJA)， 本法與HPLC法檢測(cè)結(jié)果一致。本文對(duì)36例擬南芥突變體材料、127例水稻樣品材料等的檢 測(cè)表明，本方法獲得的結(jié)果符合要求。本方法介紹的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)是一種快速可靠的方法。 測(cè)定的條件經(jīng)優(yōu)化后，測(cè)定時(shí)間僅需要20min，預(yù)計(jì)測(cè)定成本100元左右，與HPLC法檢測(cè)相 比，檢測(cè)時(shí)間縮短30-40min，成本卻基本一致，而且步驟也簡(jiǎn)化了很多。


圖1是本發(fā)明不同提取純化方法的比較圖，圖中A、B、C、D分別代表標(biāo)準(zhǔn)品，乙酸
乙酯萃取法，二氯甲烷萃取法，固相萃取柱法。圖2是本發(fā)明的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)新方法與高效液相色譜法測(cè)定樣品中JA和MeJA結(jié) 果的比較，上圖為串聯(lián)質(zhì)譜圖譜，下圖為高效液相色譜圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。一.試劑與儀器JA, MeJA標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，色譜純，純度為95% )，甲醇(德國(guó)默克，色譜純)，石油 醚，乙酸乙酯，己烷，二氯甲烷(國(guó)產(chǎn)分析純)，反向碳十八填料。Agilent 1100高效液相色譜儀，G1314A紫外檢測(cè)器，美國(guó)Thermo TSQ Quantum Ultra串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，配有自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱以及電噴霧離子源，Xcalibur 2. 0數(shù)據(jù)處理 系統(tǒng)。二、實(shí)施方法這種微量植物鮮樣中JA(JA)及MeJA(MeJA)的檢測(cè)方法，主要包括以下步驟來(lái)實(shí) 現(xiàn)1.制備JA和MeJA的提取純化的反向碳十八固相萃取小柱；2.采用固相萃取柱法提取和純化植物鮮樣中JA和MeJA ；3. LC-MS-MS檢測(cè)樣品中JA和MeJA含量。本方法檢測(cè)實(shí)例 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品中JA和MeJA回收率的檢測(cè)用移液器移取JA和MeJA標(biāo)準(zhǔn)品各1 μ L于 1. 5mL離心管中，用100%甲醇定容至lmL，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)母液，然后分別取適量混合標(biāo)準(zhǔn) 母液配制成1000ng/mL、100ng/mL、10ng/mL3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。反向碳十八固相萃取柱的制備取內(nèi)徑為5. 6mm的SPE柱體，放入聚乙烯篩板后， 添加反向碳十八填料，平衡柱子后即可。取測(cè)定過(guò)的植物樣品兩份，其中一份加入lOOng/mL的JA和MeJA的混合標(biāo)樣，另 一份不加標(biāo)樣。在1.5mL離心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇，混勻后浸提過(guò)夜，
44800g離心lOmin，取上清液于一新離心管中，剩余殘?jiān)?00 μ L 100 %的甲醇浸提濁， 4800g離心lOmin，取上清，合并兩次上清液，移入一新5mL離心管中。用3000 μ L超純水稀 釋提取液，過(guò)固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250yL 30%甲醇分別洗脫后，用300 μ L 100%甲醇洗脫并收集JA及MeJA，進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)峰面積計(jì)算JA和MeJA的回收率，結(jié)果表 明本方法的回收率分別達(dá)到92. 48% (JA)和94. 3% (MeJA)。對(duì)擬南芥突變體材料中JA和MeJA的檢測(cè)取擬南芥鮮樣0. 5000g，于1. 5mL離心 管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇，混勻后浸提過(guò)夜，4800g離心lOmin，取上清液于 一新離心管中，剩余殘?jiān)?00 μ L 100%的甲醇浸提池，4800g離心lOmin，取上清，合并兩 次上清液，移入一新5mL離心管中。用3000 μ L超純水稀釋提取液，過(guò)固相萃取柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲醇分別洗脫后(流動(dòng)相條件見(jiàn)表1)，用300 μ L 100%甲醇洗脫 并收集JA及MeJA，LC-MS-MS檢測(cè)，20min內(nèi)完成，五次測(cè)定并根據(jù)峰面積計(jì)算的JA和MeJA 的濃度平均值分別為16. 096士2. 103和3. 443士 1. 976。結(jié)果表明，本檢測(cè)方法可以對(duì)微量 擬南芥鮮樣中的JA和MeJA進(jìn)行快速檢測(cè)。表1 JA和MeJA檢測(cè)的流動(dòng)相條件
時(shí)間0.1% 甲酸(％)甲醇(％)流速(mL Tiiin-1)090100.2190100.21010900.21510900.21690100.22890100.權(quán)利要求
1.一種微量植物新鮮樣品中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的檢測(cè)方法，其特征在 于包括以下步驟(1)制備JA和MeJA提取純化的反向碳十八固相萃取柱；(2)固相萃取柱法分離、純化植物鮮樣中JA和MeJA；(3)LC-MS-MS檢測(cè)樣品中JA和MeJA含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的JA和MeJA提取純化反向碳十八固相萃取柱的制備，其特征 在于采用固相萃取柱。取內(nèi)徑為5. 6mm的SPE柱體，放入聚乙烯篩板后，添加反向碳十八 填料，平衡柱子后即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取柱法分離、純化植物鮮樣中JA和MeJA，其特征在 于樣品置于離心管中冰浴研磨，加入600 μ L 100%的甲醇浸提過(guò)夜，4800g離心lOmin，取 上清，剩余殘?jiān)?00 μ L 100%的甲醇浸提ai，4800g離心lOmin，取上清，合并兩次上清 液。用3000 μ L超純水稀釋，過(guò)固相萃取小柱，用200 μ L 20%甲醇和250 μ L 30%甲醇分 別洗脫后，用300yL 100%甲醇洗脫并收集茉莉酸及茉莉酸甲酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的LC-MS-MS檢測(cè)樣品中JA和MeJA含量，其特征在于所述 的主要碎片離子為m/z 133 (JA)，m/zl51 (MeJA)，所述的色譜保留時(shí)間分別為16. 27min和 17.19min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于固相萃取和串聯(lián)質(zhì)譜的微量植物鮮樣中茉莉酸(JA)和茉莉酸甲酯(MeJA)的檢測(cè)方法，主要包括如下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)1)制備JA和MeJA的提取純化的反向碳十八固相萃取小柱；2)采用固相萃取柱法提取和純化植物鮮樣中JA和MeJA；3)樣品檢測(cè)植物樣品提取純化后，LC-MS-MS檢測(cè)其JA和MeJA含量。本發(fā)明的效果是反向碳十八固相萃取柱適合JA和MeJA的分離純化，可實(shí)現(xiàn)二者的同時(shí)提取純化；同時(shí)，基于串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏性，能在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)復(fù)雜樣品中的JA和MeJA進(jìn)行分離檢測(cè)，并獲得比以往檢測(cè)方法相同或更好的結(jié)果，且具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠和樣品需求量低等優(yōu)點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)微量植物鮮樣中JA和MeJA的高靈敏測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N30/72GK102135528SQ20101010106
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者李合松, 童建華, 肖浪濤, 藺萬(wàn)煌, 黃志剛 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)