無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物及其方法，無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物，由外引物和內(nèi)引物組成，外引物由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物和SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物組成；內(nèi)引物由SEQ?ID?NO.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ?ID?NO.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題，簡(jiǎn)單快速，無(wú)需PCR儀之類的專業(yè)儀器設(shè)備，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的最低濃度為3×102cfu/ml。檢測(cè)所需樣品量少，可采取微創(chuàng)取樣，適用于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的觀賞性魚類。
【專利說(shuō)明】無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物及其方法，屬于觀賞魚病原菌快速檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]慈鯛科魚類如羅漢、鸚鵡、地圖、皇冠等是我國(guó)重要的觀賞魚養(yǎng)殖品種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來(lái)在高密度養(yǎng)殖模式下，病害發(fā)生頻繁，其中由無(wú)乳鏈球菌引起的細(xì)菌性感染癥是最為嚴(yán)重的疾病之一，造成很高的感染率和死亡率，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。無(wú)乳鏈球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)多數(shù)針對(duì)于革蘭氏陰性菌的水產(chǎn)用抗生素不敏感，且這種細(xì)菌可以在白細(xì)胞內(nèi)存活，屬于所謂的“細(xì)胞內(nèi)寄生菌”，需要適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)用藥程序，進(jìn)一步增加了疾病控制成本，還往往達(dá)不到預(yù)期效果。因此對(duì)于無(wú)乳鏈球菌的防控，早期檢測(cè)及早發(fā)現(xiàn)病原，及時(shí)采取有效措施至關(guān)重要。目前對(duì)于無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)，多采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)及PCR檢測(cè)技術(shù) ，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，需要專業(yè)的技術(shù)人員及儀器設(shè)備，養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟待一種可以用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)的無(wú)乳鏈球菌快速有效的檢測(cè)技術(shù)。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)為一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，其原理是鏈置換型聚合酶在合成新鏈的同時(shí)置換出原鏈，從而為下一輪擴(kuò)增制備模板，因此擴(kuò)增不需變性步驟，可以在等溫條件下進(jìn)行。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，LAMP檢測(cè)技術(shù)已顯示出較好的應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)外近年來(lái)已建立了多種病原生物的LAMP檢測(cè)技術(shù)，60~90min即可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程,通過(guò)加入核酸染料SYBR Green I或韓黃綠素，有核酸擴(kuò)增即可顯示顏色反應(yīng)，即時(shí)得到檢測(cè)結(jié)果，具較強(qiáng)的實(shí)用性，更適合于應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)及大批量樣品的檢疫，靈敏度可與實(shí)時(shí)定量PCR相比。目前尚未有關(guān)于無(wú)乳鏈球菌LAMP檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物。
[0005]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種對(duì)魚體損傷小的、快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007]—種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物，是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQ IDN0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0008]一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0009](I)提取待檢樣品DNA ；
[0010](2)在裝有19μ1 LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；于60-65 °C放置40-60min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液；[0011](3)采用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)檢測(cè)液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽(yáng)性，或在檢測(cè)液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽(yáng)性，呈橙紅色為陰性，陽(yáng)性表示待檢樣品中含有無(wú)乳鏈球菌；陰性表示不含有無(wú)乳鏈球菌；
[0012]所述引物混合液是等體積的濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，濃度為40 μ mol/L由SEQID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0013]19 μ I LAMP 反應(yīng)基礎(chǔ)液組成:4 μ I dNTP，2.5μ IlOXThermopol RoactionBuffer 和 12.5μ I DEPC 水。
[0014]待檢樣品優(yōu)選為魚血液、魚脾、魚腎組織或細(xì)菌。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0016](I)本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌周期長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問(wèn)題，本發(fā)明在2h內(nèi)即可完成所有檢測(cè)操作，簡(jiǎn)單快速。
[0017](2)本發(fā)明基于檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌保守基因一CAMP因子基因序列，可用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)，準(zhǔn)確性高，靈敏度較常規(guī)的PCR高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)所能檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的最低濃度為3 X 102cfu/mL.[0018](3)檢測(cè)成本低，無(wú)需PCR儀之類的專業(yè)儀器設(shè)備，只需一臺(tái)控溫精準(zhǔn)的水浴鍋或恒溫金屬浴，操作簡(jiǎn)便，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
[0019](4)不需經(jīng)過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)所需樣品量少，僅需取少量魚類血液或組織即可進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了微創(chuàng)取樣，尤其適用于經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的觀賞性魚類。
[0020](5)本發(fā)明還可以用于水體中無(wú)乳鏈球菌的檢測(cè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果圖，肉眼觀察，I為陰性對(duì)照，檢測(cè)液為橙紅色，2為無(wú)乳鏈球菌DNA的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)液呈現(xiàn)明顯的綠色，為陽(yáng)性。
[0022]圖2為一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法實(shí)際應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果圖。
[0023]圖3為一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法靈敏性檢測(cè)結(jié)果示意圖。
[0024]圖4為無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，這里所述實(shí)施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實(shí)質(zhì)由權(quán)利要求來(lái)限定。
[0026]本發(fā)明所用儀器及試劑:
[0027] 電熱恒溫水浴鍋(購(gòu)自北京三二八科學(xué)儀器有限公司)，營(yíng)養(yǎng)瓊脂(購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(SIGMA公司)，Bst DNA聚合酶、10 X ThermopolRoaction Buffer、dNTP(購(gòu)自 NEB 公司)，引物 cfbF3、cfbB3、cfbFIP、cfbBIP 均由上海生工生物工程有限公司合成；SYBR Green I濃縮液(購(gòu)自SIGMA公司)，DEPC水購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，無(wú)乳鏈球菌為本站從患病羅漢魚體內(nèi)分離得到。
[0028]SYBR Green I工作液，為商品化SYBR Green I濃縮液用DEPC水稀釋1000倍獲得。
[0029]Bst DNA聚合酶，每微升含8個(gè)活性單位(8U/ μ I)。
[0030]實(shí)施例1.無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法的建立
[0031](I)模板制備:
[0032]取純培 養(yǎng)的無(wú)乳鏈球菌菌液，采用DNA提取試劑盒(天根的快速DNA提取檢測(cè)試劑盒KG203)提取其基因組DNA，用作反應(yīng)模板。
[0033]⑵引物設(shè)計(jì)合成
[0034]采用blast軟件分析無(wú)乳鏈球菌基因序列，篩選出無(wú)乳鏈球菌CAMP因子基因序列(GenBank登錄號(hào)JQ289586.1)的核苷酸序列，根據(jù)LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則，針對(duì)該片段設(shè)計(jì)出LAMP引物并合成，
[0035]cfbB3:5’ -TTGCTTCAATCACATCTGTT-3’ (SEQ ID N0.1)
[0036]cfbF3:5，-ATCAAGCCCAGCAAATGG-3，(SEQ ID N0.2)
[0037]cfbBIP:5’ -TAAAGACTTCATTGCGTGCCAGGATCCGCTTCTACACGACTACCAAT-3’ (SEQ IDN0.3)
[0038]cfbFIP: 5 ’ -CGGTTTTTCATAATCTGTTCCCTGATTTTCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGC-3，(SEQID N0.4)
[0039](3) LAMP反應(yīng)體系的配制
[0040]在裝有19 μ I LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢無(wú)乳鏈球菌樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；
[0041]19 μ I LAMP 反應(yīng)基礎(chǔ)液組成:4 μ I dNTP, 2.5 μ IlOXThermopol RoactionBuffer 和 12.5μ I DEPC 水。
[0042]4 μ I引物混合液由下述組份組成:1 μ I濃度為5 μ mol/L的外引物上游引物，I μ I濃度為5 μ mol/L的外引物下游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的內(nèi)引物上游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的內(nèi)引物下游引物。
[0043]上述Bst DNA聚合酶，每微升含8個(gè)活性單位(8U/ μ I)。
[0044](4) LAMP反應(yīng)條件及優(yōu)化
[0045]設(shè)定外引物與內(nèi)引物濃度比分別為1: 1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，反應(yīng)時(shí)間從 20min、25min、30min、40min、50min、60min，反應(yīng)溫度為 54°C>57°C>60°C>63°C>65°C>
68°C，選擇最佳反應(yīng)參數(shù)建立完善的LAMP檢測(cè)技術(shù)。最終確定的反應(yīng)參數(shù)如下:
[0046]外引物與內(nèi)引物的濃度比為1:8，即外引物cfbF3、cfbB3濃度為5 μ mol/L,內(nèi)引物cfbFIP、cfbBIP引物濃度為40ymol/L，將配好的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系于63°C放置50min，之后于85°C水浴鍋中放置15min，得到檢測(cè)液，在檢測(cè)液中加入I μ I熒光染料SYBRGreen I工作液(SYBR Green I濃縮液用DEPC水1:1000稀釋)，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽(yáng)性，呈橙紅色為陰性，陽(yáng)性表示待檢樣品中含有無(wú)乳鏈球菌；陰性表示不含有無(wú)乳鏈球菌，見圖1。
[0047]實(shí)施例2.—種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0048](I)提取待檢樣品DNA:[0049]在無(wú)菌條件下抽取待檢魚血液100 μ 1，采用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒提取其DNA，作為待檢樣品，或在血液中加入IOOy 10.85%的生理鹽水，煮沸后靜置lOmin，取上清作為待檢樣品。
[0050](2)采用實(shí)施例1步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以無(wú)乳鏈球菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照的模板，以DEPC水作為陰性對(duì)照的模板。于63°C放置50min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液；在檢測(cè)液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽(yáng)性，表示待檢樣品中含有無(wú)乳鏈球菌。
[0051]實(shí)施例3.—種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0052](I)提取待檢樣品DNA:
[0053]在無(wú)菌條件下取人工感染無(wú)乳鏈球菌的患病羅漢魚脾lOOmg，人工感染無(wú)乳鏈球菌的患病羅漢魚腎lOOmg，分別加入100 μ I的PBS，勻漿后煮沸l(wèi)Omin，取上清作為待檢樣品DNA模板；
[0054](2)分別采用實(shí)施例1步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以無(wú)乳鏈球菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照的模 板，以DEPC水作為陰性對(duì)照的模板。于60°C放置60min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液；在檢測(cè)液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，結(jié)果見圖2。
[0055]圖2中1、2分別為人工感染無(wú)乳鏈球菌的患病羅漢魚脾、腎組織檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)液呈現(xiàn)明顯的綠色，為陽(yáng)性，表示樣品中含有無(wú)乳鏈球菌；3為陰性對(duì)照，檢測(cè)液呈橙紅色；4為無(wú)乳鏈球菌DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照，呈綠色。
[0056]實(shí)施例4.一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0057](I)提取待檢樣品DNA:
[0058]取純培養(yǎng)的菌液100 μ I，用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒提取待檢樣品的DNA ;也可直接將菌液煮沸l(wèi)Omin，取上清作為待檢樣品DNA模板。
[0059](2)采用實(shí)施例1步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以無(wú)乳鏈球菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照的模板，以DEPC水作為陰性對(duì)照的模板。于65°C放置40min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液；在檢測(cè)液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽(yáng)性。實(shí)施例5.—種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度測(cè)定
[0060]取純培養(yǎng)的無(wú)乳鏈球菌菌液，以無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，調(diào)整菌液濃度為3X108cfu/ml, 10倍比梯度稀釋，煮沸IOmin后取上清作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板。采用實(shí)施例1步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系，將反應(yīng)液置于63°C放置50min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液；采用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)檢測(cè)液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽(yáng)性；陽(yáng)性表示待檢樣品中含有無(wú)乳鏈球菌；陰性表示不含有無(wú)乳鏈球菌。結(jié)果:可以檢測(cè)到的最低無(wú)乳鏈球菌濃度為3X102cfu/ml，見圖3。
[0061]圖3為采用I %瓊脂糖凝膠電泳觀察靈敏性檢測(cè)結(jié)果。M為分子量MarkerDL2000，樣品1-8作為模板的細(xì)菌濃度分別為SXlOkfu/mUXlOYfu/mUXKfcfu/ml、3X 104cfu/ml、3X 105cfu/ml、3X 106cfu/ml、3X 107cfu/ml、3X 108cfu/ml。檢測(cè)結(jié)果顯不當(dāng)菌液濃度為3X 102cfu/ml時(shí)開始有擴(kuò)增條帶，即該檢測(cè)方法所能檢測(cè)到的無(wú)乳鏈球菌最低濃度為 3X102cfu/ml。
[0062]實(shí)施例6.—種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法的檢測(cè)特異性測(cè)試[0063]分別取純培養(yǎng)并鑒定后的無(wú)乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌，煮沸IOmin后取上清作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板，按照實(shí)施例4所述方法，用已建立的無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法檢測(cè)以上樣品。檢測(cè)結(jié)果:樣品I無(wú)乳鏈球菌呈出現(xiàn)核酸擴(kuò)增，檢測(cè)液呈現(xiàn)綠色為陽(yáng)性，其余樣品均為陰性，見圖4。
[0064]樣品1-9細(xì)菌分別為無(wú)乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌、維氏氣單胞菌、鰻弧菌，10為陰性對(duì)照，結(jié)果顯示僅樣品I無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)液呈綠色，為陽(yáng)性，其它菌及陰性對(duì)照的檢測(cè)液均呈橙紅色，為陰性。 [0065]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒(méi)有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)引物，其特征是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
2.一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，其特征是包括如下步驟: (1)提取待檢樣品DNA； (2)在裝有19μ1LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；于60-65 °C放置40-60min，再于85°C放置15min得到檢測(cè)液； (3)采用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)檢測(cè)液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽(yáng)性，或在檢測(cè)液中加入1μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽(yáng)性，呈橙紅色為陰性，陽(yáng)性表示待檢樣品中含有無(wú)乳鏈球菌；陰性表示不含有無(wú)乳鏈球菌； 所述引物混合液是等體積的濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，濃度為5ymol/L由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種無(wú)乳鏈球菌快速檢測(cè)方法，其特征是所述待檢樣品為魚血液、魚脾、魚腎組 織或細(xì)菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103966341SQ201410226034
【公開日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】姚學(xué)良, 徐曉麗, 李賀密, 崔寬寬, 鐘文慧 申請(qǐng)人:天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站