一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體，所述骨干質(zhì)粒載體中，向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框位于同一雙元載體中，向?qū)NA表達(dá)框由水稻U6啟動(dòng)子，壯觀霉素抗性基因、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T終止子依次構(gòu)成；Cas9核酸酶表達(dá)框由ZmUBI啟動(dòng)子，水稻偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列和35s終止子依次構(gòu)成。本發(fā)明還提供了利用所述質(zhì)粒載體構(gòu)建的含有靶標(biāo)序列的重組載體，及其在水稻基因打靶中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】—種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于植物基因打靶的基因工程載體及在水稻基因改造中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上最主要的作物之一。水稻的生產(chǎn)與國(guó)民經(jīng)濟(jì)生活密切相關(guān)，持續(xù)不斷的培育具有更加優(yōu)良農(nóng)藝形狀的品種對(duì)于水稻生產(chǎn)至關(guān)重要。相對(duì)于傳統(tǒng)育種方法，近十年內(nèi)發(fā)展出的基因打靶技術(shù)為水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等關(guān)鍵形狀的提升提供了便捷和高效的手段。傳統(tǒng)的基因打靶方法包括同源重組技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄因子激活物技術(shù)(TALEN)，其中同源重組技術(shù)在植物中打靶效率極低，而ZFN和TALEN技術(shù)都存在基因工程載體構(gòu)建復(fù)雜，周期長(zhǎng)，成本高，不適于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化等技術(shù)問題，極大的限制了基因打靶技術(shù)在水稻育種改良過程中的實(shí)用性。
[0003]近2年發(fā)展出的CRISPR/Cas9技術(shù)為基因打靶提供了新手段。CRSIPR/Cas9系統(tǒng)是存在于細(xì)菌中的一種先天性免疫系統(tǒng)。CRSIPR RNA(crRNA)在與tracrRNA(trans-activation RNA)組裝后，引導(dǎo)Cas9核酸酶切割與crRNA匹配的序列。利用這一原理，在真 核生物細(xì)胞中，通過人工合成包含crRNA和tracrRNA的單鏈向?qū)NA (SgRNA)，同樣可以引導(dǎo)Cas9切割基因組中的靶點(diǎn)序列，在細(xì)胞啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制后，切割位點(diǎn)會(huì)出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或缺失，從而實(shí)現(xiàn)了位點(diǎn)特異性的基因打靶。目前，在酵母、人類細(xì)胞、小鼠、果蠅、大鼠、斑馬魚等物種中都已成功實(shí)現(xiàn)了基因組的CRISPR/Cas9定向基因打靶。
[0004]在植物中，也有利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因組編輯的研究。但是，目前有限的報(bào)道主要側(cè)重于機(jī)理研究，尚沒有對(duì)水稻基因工程載體進(jìn)行優(yōu)化，主要表現(xiàn)為現(xiàn)有載體使用的SgRNA和Cas9組合效率有限(Shan等，2013年Nature Biotechnology文章報(bào)道的通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化法進(jìn)行CRISPR/Cas9打靶效率僅為4.0%~9.4% );操作繁瑣，需要分別構(gòu)建SgRNA和Cas9兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)化(Xie等,2013年Molecular Plant)或進(jìn)行兩次克隆才能將SgRNA和Cas9表達(dá)框整合到一個(gè)質(zhì)粒上(Miao等,2013年，Cell Research);適用性單一，大多數(shù)現(xiàn)有植物CRISPR/Cas9系統(tǒng)載體是分子量過大不適于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定表達(dá)載體(Miao等,2013年,Cell Research),抑或是缺乏T-DNA邊界不能用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的瞬時(shí)載體；以及缺乏合適水稻內(nèi)源啟動(dòng)子和適于水稻表達(dá)的編碼方式等等問題(Mao等，2013年Molecular Plant)，極大的限制了 CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因打靶技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在水稻品種改良中的發(fā)揮。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種用于水稻基因打靶的基因工程骨干載體。
[0006]具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體，包含向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框，所述向?qū)NA表達(dá)框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表達(dá)框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至8215位所示，
[0007]其特征在于，
[0008]a、所述向?qū)NA(SgRNA)表達(dá)框包括:水稻U6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第107至352位所示；壯觀霉素抗性基因(SpR)，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第412至1442位所示；人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1574至1657位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1658至1665位所示，
[0009]b、所述Cas9核酸酶表達(dá)框包括:玉米ZmUBI啟動(dòng)子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至3739位所示；水稻偏好密碼子改造后的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第3758至7888位所示和35s終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第7889至8215位所示。
[0010]優(yōu)選地，所述骨干質(zhì)粒載體還包括:c T-DNA的左、右邊界序列，其中，所述左邊界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第10464至10487位所示，所述右邊界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至25位所示,所述向?qū)NA表達(dá)框和所述Cas9表達(dá)框位于所述左邊界序列和所述右邊界序列之間。
[0011 ] 優(yōu)選地，在所述骨干質(zhì)粒載體的骨架上具有卡那霉素抗性基因結(jié)構(gòu)。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，所述骨干質(zhì)粒載體的核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，文中稱為pHUN4cl6。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供一種用于水稻目的基因打靶的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括如下步驟:
[0014]按照目的基因的編碼序列，選擇雙鏈靶標(biāo)片段，其中所述靶標(biāo)片段位于所述目的基因上，所述雙鏈靶標(biāo)片段的一條鏈具有以下5’ _(N)x-NGG-3’結(jié)構(gòu)，(N)x表示數(shù)目為X的
一條堿基序列(N1, N2......Nj ,N1, N2......Nx中的每一個(gè)表不堿基A、G、C、T中的任意一個(gè),NGG
中的N也代表堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)(優(yōu)選地，X為19或20)；
[0015]將所述靶標(biāo)片段整合到上述的骨干質(zhì)粒載體中，與SgRNA骨架序列連接形成帶有所述標(biāo)靶片段的向?qū)NA。
[0016]優(yōu)選地，所述載體構(gòu)建包括，
[0017]按照靶標(biāo)序列的核酸排列順序，分別合成具有5’ -TGTG-(N)X_3’特征的正向寡核苷酸鏈和具有5’ -AAAC-(NJ )x-3’特征的反向寡核苷酸鏈，其中正向寡核苷酸鏈中的(N)x和反向寡核苷酸中的(N’)x具有反向互補(bǔ)特征；用BsaI內(nèi)切酶切開所述骨干質(zhì)粒載體，將所述正向寡核苷酸鏈和所述反向寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈核苷酸替換壯觀霉素抗性基因，通過卡那霉素正向選擇和壯觀霉素負(fù)向選擇，篩選形成用于水稻目的基因打靶的重組載體。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供一種上述重組載體在水稻基因打靶中的應(yīng)用，其特征在于，包括步驟如下，
[0019]將所述重組載體轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，使所述水稻細(xì)胞同時(shí)含有針對(duì)靶標(biāo)基因的向?qū)NA和Cas9核酸酶；在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的雙鏈靶標(biāo)片段，誘發(fā)所述水稻細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能，實(shí)現(xiàn)目的基因中靶標(biāo)片段的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。[0020]優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞是指將所述重組載體經(jīng)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞或組織中。
[0021]優(yōu)選地，所述應(yīng)用用于獲得在靶標(biāo)片段上具有隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的水稻植株。
[0022]另一方面，本發(fā)明提供一種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含上述的重組載體。
[0023]本發(fā)明所述的基因工程骨干載體是包含T-DNA邊界序列的雙元載體，在T-DNA左右兩個(gè)邊界內(nèi)，包含2個(gè)表達(dá)框:Cas9基因表達(dá)框和向?qū)NA表達(dá)框，還可以包括潮霉素抗性基因表達(dá)框。在T-DNA邊界外的載體骨架序列中，可以包含卡那霉素抗性基因等結(jié)構(gòu)(圖1)。
[0024]在本發(fā)明中，SpR基因兩端分別存在反向排列的BsaI內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(剪切位點(diǎn)如Seq ID N0.1第349位和1547位所示)，用于插入靶標(biāo)片段。
[0025]本發(fā)明還提供包含攜帶所述重組載體的轉(zhuǎn)化子，其中，所用宿主為微生物，具體的為大腸桿菌和農(nóng)桿菌。 [0026]本發(fā)明的一個(gè)目的是應(yīng)用所述重組載體，實(shí)現(xiàn)目的基因靶標(biāo)片段的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。具體而言，是通過重組載體轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，使細(xì)胞同時(shí)含有針對(duì)靶標(biāo)基因的向?qū)NA和Cas9核酸酶；在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，目的基因的雙鏈靶標(biāo)片段被剪切，誘導(dǎo)水稻細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能，最終實(shí)現(xiàn)目的基因中靶標(biāo)片段的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。
[0027]所述應(yīng)用中，向?qū)NA由能夠與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段和SgRNA骨架片段連接而成，所述sgRNA骨架片段可與Cas9核酸酶結(jié)合。所述向?qū)NA中能與所述靶標(biāo)片段互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段為能與所述5’ _(N)x-NGG-3’中(N)x互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段。
[0028]所述向?qū)NA中sgRNA骨架片段由SEQ ID N0.1中第1574至1657位核苷酸所示DNA轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA片段。所述Cas9核酸酶由SEQ ID N0.1中第3758至7888位核苷酸所示DNA轉(zhuǎn)錄的RNA片段翻譯而成的蛋白質(zhì)。
[0029]所述重組載體轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞的方法為:向植物細(xì)胞直接導(dǎo)入重組載體的DNA序列，具體如PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。
[0030]所述再生植株，由轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞或組織，如原生質(zhì)體或愈傷組織分化再生而來(lái)。所述應(yīng)用可獲得帶有目的基因中靶標(biāo)片段上的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的水稻植株。
[0031 ] 為了提高水稻的打靶效率，在本發(fā)明中，采用了水稻U6啟動(dòng)子表達(dá)sgRNA (采用該啟動(dòng)子，在水稻中的表達(dá)效率顯著高于其它啟動(dòng)子)和ZmUBI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)水稻偏好密碼子化改造的Cas9基因的組合，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種組合能夠顯著提高對(duì)靶標(biāo)序列剪切的穩(wěn)定性和效率，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，其達(dá)到了目前已知在水稻內(nèi)最為穩(wěn)定高效的對(duì)靶標(biāo)序列的剪切的目的。同時(shí)，本發(fā)明預(yù)先將sgRNA表達(dá)框和Cas9表達(dá)框預(yù)置與同一質(zhì)粒骨架上，同時(shí)在靶標(biāo)序列插入位置預(yù)置了壯觀霉素抗性基因，在重組載體構(gòu)建過程中，僅需一次酶切連接，在壯觀霉素反向篩選和骨干質(zhì)粒載體的骨架上的卡那霉素正向篩選的作用下，可以高效簡(jiǎn)潔的獲得完整的打靶重組載體。從而，簡(jiǎn)化了針對(duì)某一基因構(gòu)建重組打靶載體的流程，相對(duì)于目前部分采用兩個(gè)分別轉(zhuǎn)化包含SgRAN表達(dá)框和Cas9表達(dá)框載體的打靶方法，也具有能更高效向水稻細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入完整CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特點(diǎn)。[0032]在一種實(shí)現(xiàn)方式中，本發(fā)明的骨干質(zhì)粒載體的核苷酸序列如下(與序列表中SEQID N0.1 相同):
【權(quán)利要求】
1.一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體，包含向?qū)NA表達(dá)框和Cas9核酸酶表達(dá)框，所述向?qū)NA表達(dá)框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第107至1665位所示，所述Cas9核酸酶表達(dá)框的核苷酸序列如Seq ID N0.1第1708至8215位所示， 其特征在于， a、所述向?qū)NA表達(dá)框包括:水稻U6啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SeqIDN0.1第107至352位所示；壯觀霉素抗性基因，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第412至1442位所示；人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1574至1657位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第1658至1665位所示， b、所述Cas9核酸酶表達(dá)框包括:玉米ZmUBI啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SeqID N0.1第1708至3739位所示；Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第3758至7888位所示和35s終止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.1第7889至8215位所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，所述骨干質(zhì)粒載體還包括:c、T-DNA的左、右邊界序列，其中，所述左邊界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第10464至10487位所示,所述右邊界序列的核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至25位所示,所述向?qū)NA表達(dá)框和所述Cas9表達(dá)框位于所述左邊界序列和所述右邊界序列之間。
3.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，所述骨干質(zhì)粒載體還包括潮霉素抗性基因表達(dá)框。
4.一種用于基因工程的骨干質(zhì)粒載體，其特征在于，所述骨干質(zhì)粒載體的核苷酸序列如 Seq ID N0.1 所示。
5.一種用于水稻目的基因打靶的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括如下步驟: 按照目的基因的編碼序列，選擇雙鏈靶標(biāo)片段，其中所述靶標(biāo)片段位于所述目的基因上，所述雙鏈靶標(biāo)片段的一條鏈具有5’ _(N)x-NGG-3’結(jié)構(gòu)，(N)x表示數(shù)目為X的一條堿基序列(N1, N2......Nx}，N1, N2......Nx中的每一個(gè)表示堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)，NGG中的N也代表堿基A、G、C、T中的任意一個(gè)； 將所述靶標(biāo)片段整合到權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的骨干質(zhì)粒載體中，與SgRNA骨架序列連接形成帶有所述標(biāo)靶片段的向?qū)NA。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括:按照靶標(biāo)序列的核酸排列順序，分別合成具有5’ -TGTG-(N)x-3’特征的正向寡核苷酸鏈和具有5’ -AAAC-(N’)x-3’特征的反向寡核苷酸鏈，其中正向寡核苷酸鏈中的(N)x和反向寡核苷酸中的(N’)x具有反向互補(bǔ)特征；用BsaI內(nèi)切酶切開所述骨干質(zhì)粒載體，將所述正向寡核苷酸鏈和所述反向寡核苷酸鏈退火后形成的雙鏈核苷酸替換壯觀霉素抗性基因，通過卡那霉素正向選擇和壯觀霉素負(fù)向選擇，篩選形成用于水稻目的基因打靶的重組載體。
7.—種權(quán)利要求6所述的重組載體在水稻基因打靶中的應(yīng)用，其特征在于，包括步驟如下， 將所述重組載體轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞，使細(xì)胞同時(shí)含有針對(duì)靶標(biāo)基因的向?qū)NA和Cas9核酸酶；在向?qū)NA和Cas9核酸酶的共同作用下，剪切目的基因的雙鏈靶標(biāo)片段，誘發(fā)所述水稻細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能，實(shí)現(xiàn)目的基因中靶標(biāo)片段的隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)入水稻細(xì)胞是指將所述重組載體經(jīng)原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到水稻細(xì)胞或組織中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用用于獲得在靶標(biāo)片段上具有隨機(jī)插入和/或隨機(jī)缺失的水稻植株。
10.一種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權(quán)利要求5所述的重組載體。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103981215SQ201410225911
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】秦瑞英, 楊劍波, 李莉, 魏鵬程, 李 浩, 楊亞春, 倪大虎, 倪金龍, 宋豐順, 陸徐忠, 馬卉 申請(qǐng)人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所