專利名稱:禽Ⅰ型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禽I型馬立克病病毒疫苗株基因工程通用載體的構(gòu)建方法和在獲得的 重組禽I型馬立克病病毒疫苗毒株方方面的應(yīng)用，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
技術(shù)背景
馬立克病病毒(Marek's Disease Virus, MDV)，學(xué)名為禽皰疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，是雞的重要傳染病病原，并具有致腫瘤特性(陸承平主編.獸醫(yī)微生物學(xué). 第四版，中國農(nóng)業(yè)出版社，2007， 359)。馬立克病病毒Marek's Disease Virus, MDV)引起 雞一種高度接觸性傳染性腫瘤病，以外周神經(jīng)、虹膜、皮膚、肌肉和各內(nèi)臟器官的淋巴樣 細胞浸潤、增生和腫瘤形成為特征，傳播速度快、潛伏期長。它在世界范圍內(nèi)流行，使嚴(yán) 重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的三種主要疫病之一。利用血清學(xué)技術(shù)，可將馬立克病病毒其分為3個 血清型I型馬立克病病毒強病毒株及其致弱毒株(MDV)，天然不致瘤株(MDV2)，天 然不致病的HVT。在MDV基因組中含有許多病毒復(fù)制的非必須區(qū)，這為重組馬立克病病 毒的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。
在MDV三個血清型的疫苗毒株中，禽I型馬立克病病毒更適于構(gòu)建重組疫苗病毒， 如CVI988株比火雞皰疹病毒(HVT)更具優(yōu)越性，因為其與流行毒株抗原性更接近，除 此以外作為重組病毒載體還具有如下優(yōu)點(1) MDV為細胞結(jié)合性病毒，可持續(xù)感染。經(jīng) 疫苗免疫的雞可終生帶毒，產(chǎn)生持久的免疫力。(2)MDV疫苗接種后，病毒在細胞間傳播， 因而不受母源抗體的干擾。(3) MDV的基因組較大，可插入多個外源基因，現(xiàn)在已經(jīng)研究 清楚US區(qū)有多個外源基因插入位點，在US基因中插入外源基因片段不會影響病毒的復(fù)制。 (4)該病毒的自然宿主只有禽類，對其它家畜和人類是安全的。
隨著對MDV的毒力相關(guān)的基因或分子位點和結(jié)構(gòu)研究的深入，研究方向轉(zhuǎn)向馬立克 病病毒基因工程重組疫苗，即利用己有的馬立克病病毒疫苗毒株作為活載體，表達其它病 原的保護性抗原基因，如以HVT為載體表達IBDV的VP2基因及NDVF基因等。其技術(shù)
3核心是利用同源重組原理，將外源抗原基因插入MDV中并表達，具有抗多種病毒的效果。 重組MDV構(gòu)建中最關(guān)鍵的一步，是構(gòu)建MDV轉(zhuǎn)移載體。李永清、周雪媚、張培君等發(fā)明 的是一種轉(zhuǎn)移載體pUS2-LacZ,其特征在于重組質(zhì)粒pUS2上的US2基因片段由CMV立 即早期啟動子、LacZ基因、轉(zhuǎn)錄終止信號SV40polyA、氨芐青霉素和新霉素標(biāo)記基因以及 一個多克隆位點基因替換。通過與MDV疫苗病毒同源重組并純化篩選，獲得LacZ標(biāo)記基 因的重組病毒MDV (《重組雞馬立克氏病病毒轉(zhuǎn)移載體及應(yīng)用》(公開號CN1763205;)。
現(xiàn)在已有報道的MDV轉(zhuǎn)移載體，篩選基因和標(biāo)記基因都是單獨使用，這造成現(xiàn)有的 MDV轉(zhuǎn)移載體，在應(yīng)用中存在一些問題和缺點。如果單獨使用篩選基因，如氨芐青霉素、 新霉素標(biāo)記基因，其缺點在于無法直觀顯示重組病毒的數(shù)量和重組病毒的純度，造成實驗 的盲目性。若是單獨采用標(biāo)記基因，如李永清;周雪媚;張培君等單獨使用的標(biāo)記基因是 LacZ，缺點在于重組病毒篩選過程中，無法抑制母源MDV的污染，導(dǎo)致不能有效區(qū)分重 組病毒和母源MDV，影響篩選效率，造成篩選時間長，易失敗。另一方面，已有的載體只 能允許一個外源抗原基因的插入表達(《重組雞馬立克氏病病毒轉(zhuǎn)移載體及應(yīng)用》(公開號 CN1763205;)。以上的缺點限制了現(xiàn)在已有轉(zhuǎn)移載體的應(yīng)用，無法快速構(gòu)建重組病毒，阻 礙了重組MDV的生產(chǎn)應(yīng)用。
本發(fā)明設(shè)計所構(gòu)建禽I型MDV疫苗株基因工程通用載體，可以克服已有MDV轉(zhuǎn)移載 體的缺點，從而可以快速構(gòu)建、篩選獲得重組MDV，有利于重組MDV疫苗的研究和應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用載體，為重組馬立 克病毒基因工程疫苗生產(chǎn)用毒株的研制提供新的可靠技術(shù)保障。 發(fā)明簡述
本發(fā)明公開了一種高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體構(gòu)建方法及其在 構(gòu)建疫苗生產(chǎn)用重組馬立克氏病病毒上的應(yīng)用。
本發(fā)明公開了構(gòu)建高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選基 因(S-g-n)的如序列l(wèi)所示的核苷酸序列。
本發(fā)明公開了構(gòu)建高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的篩選同源臂 (U)，如序列6所示的核苷酸序列。
本發(fā)明公開了構(gòu)建高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的的表達盒基因，(C-M-A)，如序列9所示的核苷酸序列。
本發(fā)明將以上元件的核苷酸序列連接后構(gòu)建禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載
體質(zhì)粒，命名為T-Us;將該質(zhì)粒與禽I型馬立克病病毒共轉(zhuǎn)染，獲得重組病毒，同時還 可以驗證載體的有效性。
本發(fā)明通過基因工程的方法構(gòu)建高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體， 可通過如下步驟實現(xiàn)-
1) 由設(shè)計合成的序列2， 3和序列4， 5所示的兩對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列1所示
的報告和篩選基因核苷酸序列；
2) 由設(shè)計合成的序列7， 8所示的一對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列6所示的同源臂基 因(U)的核苷酸序列，連入pMD18-T質(zhì)粒中，構(gòu)建通用載體同源臂質(zhì)粒T-U;
3) 由設(shè)計合成的序列IO， 11所示的一對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列9所示的表達盒 核苷酸序列；
4) 將以上元件的核苷酸序列在體外連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，構(gòu)建 成通用載體T-Us。
5) 與禽I型馬立克病病毒共轉(zhuǎn)染，獲得重組MDV同時也進一步驗證了通用載體(T-Us) 的有效性。
本發(fā)明還涉及獲得綠色熒光標(biāo)記基因和新霉素抗性基因的重組MDV，同時通用載體上 具有多克隆位點，可插入多個外源病毒基因，通過同源重組得到的重組病毒，可不受母源 抗體影響，刺激機體產(chǎn)生對多種病毒的抗體，且能有效保護禽類免遭禽馬立克病毒的攻擊。 發(fā)明詳述
本發(fā)明公開了一種高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體構(gòu)建方法及其在 構(gòu)建疫苗生產(chǎn)用重組馬立克氏病病毒上的應(yīng)用。
本發(fā)明公開了構(gòu)建高效的禽I型MDV疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選基因，
該基因是本發(fā)明人設(shè)計合成了綠色熒光和新霉素基因(S-g-n)，在SV40早期啟動子調(diào)控下
高效融合表達作為通用載體的報告和篩選基因，如序列1所示的核苷酸序列。
本發(fā)明選擇了 MDV復(fù)制非必需區(qū)US10作為外源基因插入位點，同時篩選了通用載體 同源臂的最適長度，左、右長度分別為1000 2000bp之間，如序列6所示的核苷酸序列。 將擴增得到的同源臂基因(U)連入T質(zhì)粒(T即為質(zhì)粒pMD18-T，是TAKARA公司產(chǎn)品， 由pUC18質(zhì)粒改建，是用于克隆基因的專用質(zhì)粒)中，構(gòu)建通用載體同源臂質(zhì)粒(T-U)。 本發(fā)明新合成改造了多克隆位點，并引入合適的間隔子，構(gòu)建表達盒(C-M-A),如序 列9所示的核苷酸序列。將以上元件連接后構(gòu)建通用載體(T-Us)。
與禽I型MDV共轉(zhuǎn)染，獲得重組病毒驗證載體的有效性。
本發(fā)明將增強型綠色熒光基因(來源于pEGFP-Cl載體，經(jīng)擴增改造獲得)和新霉素 基因(來源于pCDNA3.1(+)質(zhì)粒，經(jīng)擴增改造獲得)共同作為禽I型MDV疫苗株基因工 程通用載體的報告和篩選基因，以獨立的早期啟動子調(diào)控，高效融合表達，這樣獲得的重 組病毒既可進行藥物篩選，同時可以方便直觀的檢測病毒滴度和含量。為擴增如上所述的 報告篩選基因(S-g-n)，本發(fā)明設(shè)計并合成了如下相應(yīng)引物
序列2 (Gl): 5'-GTGGGTCGACTAGTTATTAATAGTAATC-3';
序列3 (G2): 5'-TGAGATCTACGCGTTAAGATACATTG-3';
序列4 (Nl): 5'-GGATCCATGATTGAACAAGATGGA-3';
序列5 (N2): 5'-CTCGAGTCAGAAGAACTCGTCAAG-3';
構(gòu)建過程如下將以引物G1/ G2經(jīng)PCR擴增得到的增強型綠色熒光基因經(jīng)限制性內(nèi) 切酶Bgin和SalI酶切后，回收；以引物N1/N2經(jīng)PCR擴增得到的新霉素基因經(jīng)限制性內(nèi) 切酶BamHI和Xhol酶切后，回收(因基因經(jīng)BglII和BamHI、 Xhol和Sail酶切后可分別 產(chǎn)生具有互補的序列，因此可以相互連接)與前面回收的增強型綠色熒光基因連接后作為 PCR模板，使用引物G1和G2擴增即得到通用載體的報告和篩選基因(S-g-n)。
本發(fā)明分析了禽I型馬立克病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能，篩選病毒復(fù)制的非必需區(qū)，在 對這些非必需區(qū)分析基礎(chǔ)上選擇基因組中的US10基因作為外源基因的插入位點。這樣既 能保證不影響禽I型馬立克病毒的復(fù)制，同時又能保證外源基因的高效、穩(wěn)定表達，增強 了重組馬立克病毒的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明選取US10基因兩側(cè)的序列作為禽I型馬立克病 毒疫苗株基因工程通用載體的同源臂(U)，設(shè)計合成了一對PCR引物，優(yōu)選序列7 (Ml) 和序列8(M2)所示序列的引物進行擴增后，將擴增產(chǎn)物連入T載體(T即為載體pMD18-T， 是TAKARA公司產(chǎn)品，由pUC18載體改建，是用于克隆基因的專用載體)構(gòu)建通用載體 的同源臂質(zhì)粒(T-U)。
為擴增通用載體的同源臂(U)設(shè)計合成了如下引物
序列7 (Ml): 5'-GAGTATTGTGAAGCACT-3';
序列8 (M2): 5'-GAAACTGGTCAGTGGAG-3';
本發(fā)明采用基因工程的方法構(gòu)建禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的表達盒
6(C-M-A)。具體過程如下設(shè)計一對PCR引物，優(yōu)選序列9 (Cl)和序列IO (C2)所示 序列的引物進行擴增得到的產(chǎn)物，包含有巨細胞病毒(CMV)早期啟動子(Promoter)、多克 隆位點(MCS)和轉(zhuǎn)錄終止信號polyA基因，在下游引入SalI酶切位點；同時選擇合適的 間隔子(IR)經(jīng)EcoRV酶切后連入多克隆位點(MCS)內(nèi)，構(gòu)建成表達盒(C-M-A)，這 樣保證在一個啟動子的調(diào)控下同時高效表達多個外源基因。
為擴增通用載體的通用載體的表達盒設(shè)計合成了如下PCR引物,如序列10 (Cl)和序 列11 (C2):
序列10 (Cl): 5'-GTTCTGCTGGTTGACATTGATTATTGA-3'; 序列11 (C2): 5'-TAGTCGACCCATAGAGCCCACCGC-3';
如上所述禽I型MDV疫苗株基因工程通用載體的核苷酸序列連接后構(gòu)建通用載體 (T-Us)，具體過程如下
將PCR擴增得到的具有序列1所示的報告基因和篩選基因(S-g-n)和PCR擴增得到 的具有序列9所示的表達盒基因(C-M-A)，分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI酶切，回收，體外連 接后作為PCR模板，使用如上引物G1和G2，用可產(chǎn)生平端的T叫酶，經(jīng)PCR擴增得到 包含報告基因和篩選基因(S-g-n)以及表達盒基因(C-M-A)的基因序列(具有平末端)， 將報告基因和篩選基因(S-g-n)、表達盒基因(C-M-A)回收；用限制性內(nèi)切酶Pstl酶切 并用DNA聚合酶I將兩端補平，得到了同源臂基因質(zhì)粒(T-U) (T即為載體pMD18-T， 是TAKARA公司產(chǎn)品，由pUC18載體改建，是用于克隆基因的專用載體)，最后將報告基 因和篩選基因(S-g-n)、表達盒基因(C-M-A) —同連入同源臂基因質(zhì)粒(T-U),連接產(chǎn) 物再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，獲得禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體(T-Us)。
禽I型MDV的重組方法如下
將通用載體(T-Us)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染CVI988的雞胚成纖維細胞。待病毒蝕斑出現(xiàn)后， 熒光顯微鏡下觀察綠色的熒光病毒蝕斑，結(jié)果表明外源性的基因已經(jīng)被重組到馬立克病毒 基因組中。經(jīng)藥物篩選5代后(用含0.4mg/mlG418培養(yǎng)液加壓24h的CEF細胞，接種重 組病毒，37t:繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換50。/。的培養(yǎng)液維持G418篩選壓力不變，于第5天將 感染的細胞消化下來，再接種于新鮮的細胞上，如此重復(fù)4次)，即獲得純化的禽I型重組 MDV CVI988-26株(或稱GalUd herpesvirus 2 CV麵-26， 2009年06月18日已將本 病毒株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo. 3132)。
以上結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體(T-Us)可以 調(diào)控外源基因的高效表達，具備高效、快捷、穩(wěn)定的特點，克服了己有轉(zhuǎn)移載體的缺點。 本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明構(gòu)建了禽I型馬立克病毒的通用載體(T-Us)，只需幾代藥物篩選和熒光篩選， 實現(xiàn)了在短時間內(nèi)即獲得穩(wěn)定高效表達外源基因重組病毒的設(shè)計目標(biāo)。同時，本發(fā)明也提 供了一套重組馬立克病毒篩選純化的工藝，獲得了一株重組禽I型馬立克病病毒CVI988-26 株，該病毒攜帶有禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體T-Us，用該病毒免疫動物可 不受母源抗體影響，刺激機體產(chǎn)生對多種病毒的抗體，且能有效保護禽類免遭禽馬立克病 毒的攻擊。為新型馬立克病疫苗的研制奠定了堅實的基礎(chǔ)。


圖1綠色熒光蛋白基因的擴增結(jié)果該圖是本發(fā)明實施例通用載體綠色熒光蛋白基因 的擴增結(jié)果圖，其結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，約1600bp，表明成功擴增得到標(biāo)記基因綠色熒光 蛋白基因。
圖2通用載體的表達盒(C-M-A)基因的擴增結(jié)果該圖顯示表達盒(C-M-A)基因 的擴增結(jié)果的與預(yù)期結(jié)果一致，片段大小約lOOObp，表明成功擴增得到表達盒。
圖3同源臂的PCR擴增結(jié)果該圖顯示結(jié)果表明成功擴增得到同源臂，約2000bp。
圖4重組馬立克病毒通用載體鑒定是本發(fā)明實施例重組馬立克病毒通用載體鑒定 圖，結(jié)果與預(yù)期片段大小一致，表明成功構(gòu)建了通用載體。
圖5重組MDV通用載體的構(gòu)建是本發(fā)明實施例重組MDV通用載體的構(gòu)建圖，由圖 可見重組病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的技術(shù)路線。
圖6重組MDV在CEF細胞上形成的熒光蝕斑是重組馬立克病毒在CEF細胞上形成 的熒光蝕斑圖，結(jié)果表明獲得了表達熒光的重組馬立克病毒，說明禽I型馬立克病毒疫苗 株基因工程通用載體是有效的，設(shè)計合理，可用于重組病毒的構(gòu)建。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施進行具體說明 1.禽I型馬立克病毒的繁殖自液氮中取出凍存的禽I型馬立克病毒(毒株名CVI988-1，青島易邦生物工程有限公司 保存提供)，快速置于37X:水浴，快速溶化，低速離心棄上清，以含有8%犢牛血清的1640 培養(yǎng)液懸浮細胞，取適量的病毒接種已經(jīng)長滿單層的雞胚成纖維細胞(CEF)(按常規(guī)方法 制備的)上，37'CC02溫箱培養(yǎng)，待70%病變出現(xiàn)后收集細胞，凍存細胞于液氮中。
2. PCR擴增通用載體的報告篩選基因(S-g-n)、表達盒基因(C-M-A)、同源臂基因(U) 克隆與序列測定。(參考附圖l、圖2、圖3)，圖l為報告篩選基因(S-g-n)的擴增結(jié)果， 與預(yù)期結(jié)果一致，約2400bp，電泳結(jié)果表明成功得到報告篩選基因。圖2為表達盒基因的 擴增結(jié)果，由圖可見擴增得到約1000bp的目的片段(C-M-A)。圖3為同源臂(U)的擴增 結(jié)果，預(yù)期的片段大小一致，約2700bp，瓊脂糖電泳結(jié)果表明成功擴增同源臂。
3. 禽I型馬立克病毒的通用載體(T-Us)的構(gòu)建
將擴增得到的同源臂基因(T-U)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pstl酶切用DNA凝膠回收試劑盒(購 自上海生物工程有限公司)回收，再使用DNA聚合酶I (Klenow Fragment)將兩端補平； 報告篩選基因(S-g-n)、表達盒基因(C-M-A)分別經(jīng)SalI酶切后，回收，16。C定向連接， 再與補平的同源臂基因(T-U)連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選出陽性克隆 質(zhì)粒，構(gòu)建成通用載體(T-Us)，結(jié)果見圖4、 5。
圖4為通用載體的酶切鑒定結(jié)果。圖4中第1道為標(biāo)準(zhǔn)marker (TAKATADL15000)， 具體條帶大小見圖；第2、 3道為通用載體的酶切結(jié)果與預(yù)期片段大小一致，分別約為650bp 和9000bp;第4道為標(biāo)準(zhǔn)marker (TAKATADL2000)，具體條帶大小見圖。酶切電泳結(jié)果 證明，構(gòu)建的通用載體正確。
測序驗證序列和讀碼框。測序結(jié)果表明，構(gòu)建的禽I型馬立克病毒的通用載體(T-Us) 與試驗設(shè)計一致正確，含有完整的報告篩選基因(S-g-n)，同時將CMV啟動子及其多克隆 位點(C-M-A)與之連接，構(gòu)成CMV啟動子和增強子控制下的外源基因表達盒，插入到 含有馬立克病毒(MDV)復(fù)制非必需區(qū)基因(短獨特區(qū)US10)的克隆片段(T-U)中，構(gòu) 建成重組MDV的通用載體。在該載體中，表達盒的兩端分別與兩段約1000bp的MDV同 源片段連接，用于在病毒內(nèi)的同源重組。構(gòu)建成重組馬立克病毒的通用載體(T-Us)經(jīng)測 序證明各部件正確連接，且未發(fā)生突變和讀碼框錯位。具體構(gòu)建過程和結(jié)果見圖5。
堿裂解法(按照《分子克隆》第二版中的方法)大量提取質(zhì)粒并純化，用于轉(zhuǎn)染細胞
9獲得重組病毒。
4. 按照脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(依照Lipfectin2000,InvitrogenCorp.的產(chǎn)品說明書操作)用重組MDV的通用載體質(zhì)粒(T-Us)轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染CVI988的雞胚成纖維細胞獲得重組MDV:
(1) 轉(zhuǎn)染前l(fā)天，傳代CEF，接種6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞單層長至80%融合準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
(2) 用無血清培養(yǎng)液洗滌，然后用禽I型馬立克病毒疫苗株(毒株號CVI988-1)感染細胞，感染量為200PFU，在37'C感作2h，其間每20min搖動病毒感作液一次，然后倒掉感染液，洗滌細胞；
(3) 取兩只1.5 ml無菌E卯endorf管。管A加入2 10pL LIPOFECTIN 2000 (購自Invitrogen公司)和100pL無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM (購自Invitrogen公司)，混勻后室溫靜置5rnin。其間于管B中加入lOOpL無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM和2.0ng/nL的重組MDV的通用載體質(zhì)粒(T-Us)。
(4) 將管A中的LIPOFECTIN 2000和OPTI-MEM混合液滴加至管B中，混勻后于室溫靜置20 min。加入已經(jīng)感染禽I型馬立克病毒的CEF細胞上，37°C 5% C02培養(yǎng)箱5 8小時，吸棄轉(zhuǎn)染液，加入含5%牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37。C培養(yǎng)至72h出現(xiàn)典型的細胞病變，于熒光顯微鏡下觀察熒光(附圖6)。出現(xiàn)80%的細胞出現(xiàn)細胞病變后收獲病毒。
5. 重組馬立克病毒的篩選、純化
將部分收獲的重組馬立克病毒繼續(xù)感染用含0.4mg/mlG418培養(yǎng)液(Sigma)篩選重組病毒，重組病毒可表達抗G418的酶因此可以良好增殖，而母源病毒CVI988-1的生長被G418抑制而無法增殖，這樣經(jīng)過4輪的篩選獲得純化的重組馬立克病病毒，命名為馬立克病病毒CVI988-26株。
具體的篩選、純化方法如下
以常規(guī)方法使用SPF雞胚制備原代雞胚成纖維細胞(CEF) ,37'C培養(yǎng)24h后胰酶消化傳代，細胞接入六孔細胞培養(yǎng)板，每孔接入6X106CEF細胞，37'C繼續(xù)培養(yǎng)細胞長滿至80。/。 90%，接入0.4mg/mlG418， 12h后接入收獲的重組馬立克病毒，37。C繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換50。/。的培養(yǎng)液維持G418篩選壓力(濃度為0.4mg/ml)不變，于第5天將感染的細胞消化下來,再接種于新鮮的細胞上，如此重復(fù)4次，篩選到重組病毒(見圖6)。
10序列表
<110>青島易邦生物工程有限公司
<120>禽I型馬立克病病毒疫苗株基因工程通用載體
<130>
<160> 11
< 170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 2422
<212> DNA<213>人工序列
<220><223>因基因<400>
對人工序列的描述禽I型馬立克病病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選基
11720780
90096010201080114012001260AGTTGTGGTT TGTCCAAACT CA 2422
<210> 2
<211> 28
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述:擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選
基因基因的引物G1:
<400> 2
GTGGGTCGAC TAGTTATTAA TAGTAATC 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述:擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選
基因基因的引物G2:
<400> 3
TGAGATCTAC GCGTTAAGAT ACATTG 26<210> 4<211> 18<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選
基因基因的引物Nl-
<400> 4
ATGATTGAAC AAGATGGA
18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA<213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的報告和篩選
基因基因的引物N2:
<400> 5
TCAGAAGAAC TCGTCAAG 20
<210> 6
<211> 2730
<212> DNA<213>人工序列
<220><formula>formula see original document page 15</formula>GTTGTGGTTT GTCCAAACTC A
1560
1680 1740 1800
1860 1920
1980
2160 2220 2280 2340 2400 2421
<210> 7
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的同源臂(T-U)
的引物Ml:
<400> 7
GAGTATTGTGAAGCACT 17
16<210> 8
<211> 17
<212> DNA <213>人工序列
<220〉
<223>對人工序列的描述擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的同源臂
(T-U)的引物M2:
<400> 8
GAAACTGGTCAGTGGAG 17
<210> 9
<211> 1529
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的表達盒基因 <400> 9GCATGCTGGG GATGCGGTGG GCTCTATGG
1529
<210> 10
<211> 21
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述:擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的表達盒基因
18的引物C1:
<400> 10
GACGGATCGG GAGATCTCCC G
21
<210> 11
<211> 22
<212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>對人工序列的描述擴增禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的表達盒基因 的引物C2:
<400> 11
CCATAGAGCC CACCGCATCC CC 22
19
權(quán)利要求
1.一種高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體T-Us，其特征在于該通用載體含有
1)如序列1所示的核苷酸序列的報告和篩選基因S-g-n；
2)如序列6所示的核苷酸序列的同源臂U；
3)如序列9所示的核苷酸序列的表達盒基因C-M-A。
2. —種高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體T-Us的構(gòu)建方法，其特征在于構(gòu)建方法包括以下步驟1) 由設(shè)計合成的序列2， 3和序列4， 5所示的兩對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列1所示的報告和篩選基因核苷酸序列；2) 由設(shè)計合成的序列7， 8所示的一對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列6所示的同源臂基因U的核苷酸序列，連入pMD18-T質(zhì)粒中，構(gòu)建通用載體同源臂質(zhì)粒T-U;3) 由設(shè)計合成的序列IO， 11所示的一對引物經(jīng)擴增后獲得具有序列9所示的表達盒核苷酸序列；4) 將以上元件的核苷酸序列在體外連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，構(gòu)建成通用載體T-Us。
3. —種高效的禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體T-Us的應(yīng)用，其特征在于是將通用載體T-Us與禽I型馬立克病病毒共轉(zhuǎn)染，獲得重組MDV CVI988-26株，2009年06月18日已將本病毒株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 3132。
4. 如權(quán)利要求
3所述的一種高效的禽1型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體丁- Us的應(yīng)用，其特征在于提供了一種重組禽I型馬立克病毒的篩選方法是用含0.4mg/mlG418培養(yǎng)液加壓24h的CEF細胞，接種重組病毒，37。C繼續(xù)培養(yǎng)，每24h更換50%的培養(yǎng)液維持G418篩選壓力不變，于第5天將感染的細胞消化下來，再接種于新鮮的細胞上，如此重復(fù)4次，篩選到重組病毒，同時，結(jié)合熒光觀察重組病毒的含量和純度。
5. 如權(quán)利要求
3所述的一種高效的禽1型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體1- Us的應(yīng)用，其特征在于所得到的重組禽I型馬立克病病毒CGMCC No. 3132病毒攜帶有禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體T-Us，用該病毒免疫動物可不受母源抗體影響，刺激機體產(chǎn)生對多種病毒的抗體，且能有效保護禽類免遭禽馬立克病毒的攻擊。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種禽I型馬立克病毒疫苗株基因工程通用載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。包括該通用載體(T-Us)的構(gòu)建主要包括設(shè)計合成了綠色熒光和新霉素基因(S-g-n)，在SV40早期啟動子調(diào)控下高效融合表達作為通用載體的報告和篩選基因；選擇了MDV復(fù)制非必須區(qū)US10作為外源基因插入位點，同時篩選了通用載體同源臂(U)的最適長度，左、右長度分別為1000-2000bp之間；新合成改造了多克隆位點，并引入合適的間隔子，構(gòu)建表達盒(C-M-A)，以上元件連接后構(gòu)建通用載體(T-Us)。應(yīng)用該通用載體與禽I型馬立克病毒共轉(zhuǎn)染，獲得了一株重組禽I型馬立克病病毒CVI988-26株，為新型馬立克病疫苗的研制奠定了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/85GKCN101659966SQ200910087701
公開日2010年3月3日 申請日期2009年6月24日
發(fā)明者劉新文, 李明義, 范根成 申請人:青島易邦生物工程有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan