海豚鏈球菌快速檢測引物及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了海豚鏈球菌快速檢測引物及其方法，海豚鏈球菌快速檢測引物，由外引物和內(nèi)引物組成，外引物由SEQ?ID?NO.1所示的外引物上游引物和SEQ?ID?NO.2所示的外引物下游引物組成；內(nèi)引物由SEQ?ID?NO.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ?ID?NO.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測海豚鏈球菌周期長、檢測成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場檢測等問題，簡單快速。準確性高，靈敏度高，檢測海豚鏈球菌的最低濃度為3×102cfu/ml。檢測成本低，無需PCR儀之類的專業(yè)儀器設(shè)備。不需經(jīng)過細菌培養(yǎng)，檢測所需樣品量少，實現(xiàn)了微創(chuàng)取樣，適用于經(jīng)濟價值較高的觀賞性魚類。
【專利說明】海豚鏈球菌快速檢測引物及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種海豚鏈球菌快速檢測引物及其方法，屬于觀賞魚病原菌快速檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]海豚鏈球菌隸屬于芽孢桿菌綱(Bacilli)、乳桿菌目(Lactobacillales)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、鏈球菌屬(Streptococcus),為一種具溶血性的革蘭氏陽性球菌，是養(yǎng)殖魚類的重要致病菌之一，可以引起羅非魚、澳洲肺魚、虹鱒、斑點叉尾鮰、雜交條紋鱸魚、牙鲆及河豚等的感染，造成很高的死亡率。近年來海豚鏈球菌在養(yǎng)殖的觀賞魚中多次被發(fā)現(xiàn)，引起被感染的圖麗魚、羅漢魚眼睛突起、鰓蓋出血、腹水等癥狀，具有很強的傳染性，死亡率在30%以上。觀賞魚的價值在于其觀賞性，一旦發(fā)生海豚鏈球菌的感染，即便及時治療挽回部分魚的生命，其觀賞價值也大受影響，由此造成的經(jīng)濟損失巨大。因此對于觀賞魚海豚鏈球菌病，病原早期的檢測與及時采取有效的預(yù)防治療措施尤為重要。目前對于海豚鏈球菌的檢測，主要通過細菌分離、生化鑒定、血清學(xué)反應(yīng)及PCR技術(shù)來進行，耗時長，成本高，多以殺死水產(chǎn)動物為前提，操作復(fù)雜，需要專業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，不適用于實際生產(chǎn)中病原的實時監(jiān)測。養(yǎng)殖生產(chǎn)中亟需一種能夠應(yīng)用于養(yǎng)殖現(xiàn)場的、對魚體損傷小的、快速準確、操作簡便的海豚鏈球菌檢測技術(shù)。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedIsothermal Amplification,LAMP)是2000年建立的一種新型核酸擴增技術(shù)，其特征是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，在一種鏈置換DNA聚合酶的作用下，保持等溫條件(60~65°C ) 30~60min即可完成核酸擴增反應(yīng)，加入核酸染料SYBR Green I或鈣黃綠素，有核酸擴增即可顯示顏色反應(yīng)，即時得到檢測結(jié)果。目前尚未有關(guān)于海豚鏈球菌LAMP檢測技術(shù)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種海豚鏈球菌快速檢測引物。
[0005]本發(fā)明的第二個目的是提供一種對魚體損傷小的、快速準確、操作簡便的海豚鏈球菌快速檢測方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0007]—種海豚鏈球菌快速檢測引物，其特征是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0008]一 種海豚鏈球菌快速檢測方法，其特征是包括如下步驟:
[0009](I)提取待檢樣品DNA ；
[0010](2)在裝有19μ1 LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；于60-65 °C放置40-60min，再于85°C放置15min得到檢測液；[0011] (3)采用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖電泳檢測檢測液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽性，或在檢測液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽性，呈橙紅色為陰性，陽性表示待檢樣品中含有海豚鏈球菌；陰性表示不含有海豚鏈球菌；
[0012]所述引物混合液是等體積的濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，濃度為40 μ mol/L由SEQID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
[0013]待檢樣品優(yōu)選為魚血液、魚脾、魚腎組織或細菌。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:
[0015](I)本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)檢測海豚鏈球菌周期長、檢測成本高、不能應(yīng)用于現(xiàn)場檢測等問題，本發(fā)明在2h內(nèi)即可完成所有檢測操作，簡單快速。
[0016](2)本發(fā)明基于檢測海豚鏈球菌共有的溶血基因co-hemolysin gene,可用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中海豚鏈球菌的檢測，準確性高，靈敏度較常規(guī)的PCR高2-3個數(shù)量級，實驗室檢測所能檢測海豚鏈球菌的最低濃度為3X 102cfu/ml。
[0017](3)檢測成本低，無需PCR儀之類的專業(yè)儀器設(shè)備，只需一臺控溫精準的水浴鍋，操作簡便，適合現(xiàn)場檢測。
[0018](4)不需經(jīng)過細菌培養(yǎng)，檢測所需樣品量少，僅需取少量魚類血液或組織即可進行檢測，實現(xiàn)了微創(chuàng)取樣，尤其適用于經(jīng)濟價值較高的觀賞性魚類。
[0019](5)本發(fā)明還可以用于水體中海豚鏈球菌的檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為基于16S rDNA構(gòu)建的海豚鏈球菌系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0021]圖2為一種海豚鏈球菌快速檢測方法檢測結(jié)果示意圖。
[0022]圖3為一種海豚鏈球菌快速檢測方法靈敏性檢測結(jié)果示意圖。
[0023]圖4為海豚鏈球菌快速檢測方法特異性檢測結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖并通過具體實施例來進一步說明本發(fā)明，這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定。
[0025]本發(fā)明所用儀器及試劑:
[0026]電熱恒溫水浴鍋(購自北京三二八科學(xué)儀器有限公司)，BHI培養(yǎng)基(購自美國BD公司)，高速冷凍離心機(SIGMA公司)，Bst DNA聚合酶、甜菜堿、dNTP (購自NEB公司)，引物stin-F3、stin-B3、stin_FIP、stin_BIP均由上海生工生物工程有限公司合成；SYBRGreen I濃縮液(購自SIGMA公司)，Tris、硫酸銨、Triton X-100購自上海生工生物工程有限公司，氯化鉀、硫酸鎂為國產(chǎn)分析純。
[0027]10X 反應(yīng)緩沖液配方:200mmol/L pH8.8 的 Tris-HCl、IOOmmo 1/L 氯化鉀(KCl)、IOOmmoI/L 硫酸銨((NH4) 2S04)，20mmol/L 硫酸鎂(MgSO4)和 I % 曲拉通 X-100 (Tritonx-100)。
[0028]SYBR Green I工作液，為商品化SYBR Green I濃縮液用DEPC水稀釋1000倍獲得。
[0029]Bst DNA聚合酶，每微升含8個活性單位(8U/ μ I)。
[0030]實施例1.圖麗魚源海豚鏈球菌的分離與鑒定
[0031](I)挑取患病圖麗魚眼球及脾、腎組織于BHI培養(yǎng)基平板劃線，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，之后挑取優(yōu)勢菌落進行純培養(yǎng)；
[0032](2)采用革蘭氏染色觀察所分離菌株形態(tài)，參考《常用細菌鑒定手冊》進行細菌生化特性鑒定；擴增細菌的16S rDNA，測序后進行比對分析，構(gòu)建以16S rDNA為遺傳標記的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0033](3)取所分離菌株進行大量培養(yǎng)，收集菌液離心后，調(diào)整菌液濃度為3X IO7Cfu/ml，采取腹腔注射的方式對健康圖麗魚(體長12±2cm)進行人工感染實驗，每尾注射100μ 1，共注射10尾，對照組的10尾健康圖麗魚注射等量無菌生理鹽水。實驗期間保持水溫28°C，每天觀察并記錄魚發(fā)病及死亡情況，并對瀕死病魚再次進行細菌分離。
[0034](4)實驗結(jié)果:從患病圖麗魚體內(nèi)分離到的優(yōu)勢菌落0523經(jīng)革蘭氏染色顯示為革蘭氏陽性球菌，直徑 0.2~0.8 μ m，幾個至十幾個球狀菌排列成鏈狀，生化特性與海豚鏈球菌較為接近，以16S rDNA為遺傳標記，基于N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示菌株0523與海豚鏈球菌(DQ303187.UAB593340.1)聚為一支，置信度為96%，見圖1。將培養(yǎng)的0523菌液注射入健康圖麗魚腹腔，實驗第3天實驗魚開始陸續(xù)死亡，至第11天實驗組魚全部死亡，表現(xiàn)出明顯的海豚鏈球菌的感染病狀，而對照組無一例死亡，證實所分離菌株0523對圖麗魚具有致病性。
[0035]實施例2.海豚鏈球菌快速檢測方法的建立
[0036](I)模板制備:
[0037]采用DNA提取試劑盒(天根的快速DNA提取檢測試劑盒KG203)提取菌株0523的基因組DNA，用作反應(yīng)模板。
[0038]⑵引物設(shè)計合成
[0039]采用blast軟件分析海豚鏈球菌基因序列，篩選出海豚鏈球菌共有的毒力基
因-溶血基因co-hemolysin gene (GenBank登錄號:KC132870.1)的核苷酸序列，根據(jù)
LAMP技術(shù)引物設(shè)計原則，針對該片段設(shè)計出LAMP引物并合成，
[0040]stin-F3:5，-TGCTGTTCAAGCCATTGT-3’ (SEQ ID N0.1)
[0041]stin-B3:5，-GATGACTTCACATAAATTGTAGC-3，(SEQ ID N0.2)
[0042]stinFIP:5’ -TGGATCAGCAATTCGGATAACTAATTTTTAACTCAATTAAGCCACAAAGT-3’ (SEQID N0.3)
[0043]stinBIP:5’-GATGCAATAAAAGCACAAGTCCAAGGATCCTCTATCACTAGCTTTTAAATCTGC-3’ (SEQ ID N0.4)
[0044](3) LAMP反應(yīng)體系的配制
[0045]在裝有19 μ I LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；
[0046]19 μ I LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液包括2.5 μ IlOX反應(yīng)緩沖液，3 μ I濃度為2.5mmol/L的dNTP, 4 μ 11.6mol/L的甜菜堿和9.5 μ I分子生物學(xué)級超純水。
[0047]IOX 反應(yīng)緩沖液配方:200mmol/L ρΗ8.8 的 Tris-HCl、IOOmmo 1/L 氯化鉀(KCl)、100mmol/L硫酸銨((NH4) 2S04)，20mmol/L硫酸鎂MgSOjP I % 曲拉通X-100 (Triton X-100)，溶劑為分子生物學(xué)級超純水。
[0048]4 μ I引物混合液由下述組份組成:1 μ I濃度為5 μ mol/L的外引物上游引物，I μ I濃度為5 μ mol/L的外引物下游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的內(nèi)引物上游引物，I μ I濃度為40 μ mol/L的內(nèi)引物下游引物。
[0049]上述Bst DNA聚合酶，每微升含8個活性單位(8U/ μ I)。
[0050](4) LAMP反應(yīng)條件及優(yōu)化
[0051]設(shè)定外引物與內(nèi)引物濃度比分別為1: 1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10、1:12，反應(yīng)時間從 20min、25min、30min、40min、50min、60min，反應(yīng)溫度為 54°C>57°C>60°C>63°C>65°C>68°C，選擇最佳反應(yīng)參數(shù)建立完善的LAMP檢測技術(shù)。最終確定的反應(yīng)參數(shù)如下:
[0052]外引物與內(nèi)引物的濃度比為1:8，即外引物stin-F3、stin_B3濃度為5 μ mo 1/L，內(nèi)引物stinFIP、stinBIP引物濃度為40 μ mol/L，將配好的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系于63°C放置50min，之后于85°C水浴鍋中放置15min，得到檢測液，采用質(zhì)量濃度I %的瓊脂糖電泳檢測檢測液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽性；或在檢測液中加入Iy I熒光染料SYBR Green I工作液(SYBR Green I濃縮液用DEPC水1:1000稀釋)，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽性，呈橙紅 色為陰性，陽性表示待檢樣品中含有海豚鏈球菌；陰性表示不含有海豚鏈球菌。
[0053]實施例3.—種海豚鏈球菌快速檢測方法，包括如下步驟:
[0054](I)提取待檢樣品DNA:
[0055]在無菌條件下抽取待檢魚血液100 μ 1，采用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒提取待檢樣品的DNA。
[0056](2)采用實施例2步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以海豚鏈球菌0523的全基因組DNA作為陽性對照的模板，以無菌分子生物學(xué)級超純水作為陰性對照的模板，于62°C放置50min，再于85°C放置15min得到檢測液；
[0057](3)采用質(zhì)量分數(shù)I %的瓊脂糖電泳檢測檢測液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽性；
[0058]再用步驟(1) (2)獲得另一份檢測液，在檢測液中加入I μ I熒光染料SYBR GreenI工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽性，呈橙紅色為陰性，陽性表示待檢樣品中含有海豚鏈球菌；陰性表示不含有海豚鏈球菌，結(jié)果見圖2。(圖2中M為分子量Marker DL2000,I為陰性對照，檢測液為橙紅色，電泳無連續(xù)的階梯狀的DNA條帶；2為所分離的海豚鏈球菌的LAMP檢測結(jié)果，呈現(xiàn)明顯的綠色，電泳也出現(xiàn)明顯的連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，為陽性)
[0059]實施例4.一種海豚鏈球菌快速檢測方法，包括如下步驟:
[0060](I)提取待檢樣品DNA:
[0061]在無菌條件下取魚脾lOOmg，加入100 μ I的PBS，勻漿后煮沸l(wèi)Omin，取上清作為待檢樣品DNA模板；
[0062](2)采用實施例2步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以海豚鏈球菌0523的全基因組DNA作為陽性對照的模板，以無菌分子生物學(xué)級超純水作為陰性對照的模板，于60°C放置60min，再于85°C放置15min得到檢測液；
[0063](3)在檢測液中加入I μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色，表示待檢樣品中含有海豚鏈球菌。
[0064]實施例5.—種海豚鏈球菌快速檢測方法，包括如下步驟:
[0065](I)提取待檢樣品DNA:
[0066]取純培養(yǎng)的菌液100 μ 1，用商業(yè)化的DNA抽提試劑盒提取待檢樣品的DNA ；(也可直接將菌液煮沸l(wèi)Omin，取上清作為待檢樣品DNA模板)
[0067](2)采用實施例2步驟(3)中的25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；以海豚鏈球菌0523的全基因組DNA作為陽性對照的模板，以無菌分子生物學(xué)級超純水作為陰性對照的模板。于65°C放置40min，再于85°C放置15min得到檢測液；
[0068](3)采用1%的瓊脂糖電泳檢測檢測液產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，為陽性。
[0069]實施例6.—種海豚鏈球菌快速檢測方法的檢測靈敏度測定
[0070]將所分離的海豚鏈球菌菌株0523接入BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，以無菌生理鹽水洗滌3次，調(diào)整菌液濃度為3X 108cfu/ml，10倍比梯度稀釋，煮沸IOmin后取上清作為LAMP反應(yīng)的模板。按照實施例3所述方法，檢測梯度稀釋的海豚鏈球菌菌液。結(jié)果:可以檢測到的最低海豚鏈球菌濃度為3X102cfu/ml，見圖3 (M為分子量Marker DL2000，樣品 1-9 作為模板的細菌濃度分別為 3X IO1CfVmUX 102cfu/ml、3X 103cfu/ml、3X IO4Cfu/ml>3X 105cfu/ml、3X 106cfu/ml、3X 107cfu/ml、3X 108cfu/ml、陽性對照。檢測結(jié)果顯不當菌液濃度為3X 102cfu/ml時開始有擴增條帶，即該檢測方法所能檢測到的海豚鏈球菌最低濃度為 3X102cfu/ml)。
[0071]實施例7.—種海豚鏈球菌快速檢測方法的檢測特異性測試
[0072]分別取純培養(yǎng)并鑒定后的海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌，煮沸IOmin后取上清作為LAMP反應(yīng)的模板，用已建立的海豚鏈球菌快速檢測方法檢測以上樣品。檢測結(jié)果:樣品I海豚鏈球菌的檢測液呈綠色，為陽性；樣品9為陰性對照，呈陰性；其余樣品均為陰性，見圖4(1-8細菌分別為海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、美人魚發(fā)光桿菌、柱狀黃桿菌、哈維氏菌、嗜水氣單胞菌、諾卡氏菌、愛德華氏菌，9為陰性對照。結(jié)果顯示僅海豚鏈球菌出現(xiàn)特異性擴增，反應(yīng)液呈現(xiàn)綠色，其它菌及陰性對照均為陰性)。
[0073]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會理解，在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，對于上述實施例進行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種海豚鏈球菌快速檢測引物，其特征是由外引物和內(nèi)引物組成，所述外引物由SEQID N0.1所示的外引物上游引物和SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物組成；所述內(nèi)引物由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
2.一種海豚鏈球菌快速檢測方法，其特征是包括如下步驟: (1)提取待檢樣品DNA； (2)在裝有19μ1LAMP反應(yīng)基礎(chǔ)液的200 μ I PCR反應(yīng)管中加入4 μ I引物混合液，I μ I Bst DNA聚合酶，I μ I待檢樣品DNA模板，配成25 μ I的LAMP反應(yīng)體系；于60-65 °C放置40-60min，再于85°C放置15min得到檢測液； (3)采用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖電泳檢測檢測液是否產(chǎn)生連續(xù)的階梯狀的DNA條帶，是則為陽性，或在檢測液中加入1μ I熒光染料SYBR Green I工作液，肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽性，呈橙紅色為陰性，陽性表示待檢樣品中含有海豚鏈球菌；陰性表示不含有海豚鏈球菌； 所述引物混合液是等體積的濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.1所示的外引物上游引物，濃度為5 μ mol/L由SEQ ID N0.2所示的外引物下游引物，濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.3所示的內(nèi)引物上游引物和濃度為40 μ mol/L由SEQ ID N0.4所示的內(nèi)引物下游引物組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種海豚鏈球菌快速檢測方法，其特征是所述待檢樣品為魚血液、魚脾、魚腎組織或細菌。
【文檔編號】C12N15/11GK103966342SQ201410226035
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日
【發(fā)明者】徐曉麗, 姚學(xué)良, 包海巖, 李灝, 丁子元 申請人:天津市水產(chǎn)技術(shù)推廣站