烴合成酶基因及其利用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供具有烷烴等烴合成能力優(yōu)異的新功能的烴合成酶基因。所述烴合成酶基因編碼包含具有序列號(hào)1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】烴合成酶基因及其利用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及具有新特征的烴合成酶基因及該基因的利用。

【背景技術(shù)】
[0002] 已知能夠合成烷烴等烴的微生物。通過(guò)由該具有烴合成能力的微生物確定、分 離參與烴合成的基因，可以期待開(kāi)發(fā)出烴合成能力優(yōu)異的重組微生物、開(kāi)發(fā)出利用該重組 微生物的烴合成系統(tǒng)等。例如，在專(zhuān)利文獻(xiàn)1(W02006/109558)中，公開(kāi)了通過(guò)培養(yǎng)具有烴 生產(chǎn)能力的新微細(xì)藻類(lèi)橢圓微細(xì)綠藻（Pseudochoricystis ellipsoidea)、屬于微細(xì)綠藻 (Pseudochoricystis)屬或索囊藻（Choricystis)屬并具有經(jīng)生產(chǎn)能力的微細(xì)藻類(lèi)而從培 養(yǎng)物中提取烴的方法。
[0003] 另外，在專(zhuān)利文獻(xiàn)2(日本特開(kāi)2010-528627號(hào)公報(bào)）中，公開(kāi)了在酵母等中插入 有將醛轉(zhuǎn)換為烷烴的基因的重組酵母、以及利用該重組酵母的烷烴的制造方法。進(jìn)而，在專(zhuān) 利文獻(xiàn)3(日本特表2011-520455號(hào)公報(bào)）中，公開(kāi)了來(lái)源于細(xì)長(zhǎng)聚球藻（Synechococcus elongatus)的烷烴合成酶基因、醛合成酶基因，并公開(kāi)了利用它們來(lái)制造烷烴、醛的方 法。進(jìn)而另外，在專(zhuān)利文獻(xiàn)4(日本特開(kāi)平09-322780號(hào)公報(bào)）中，公開(kāi)了來(lái)源于擬南芥 (Arabidopsis thaliana)的編碼參與脂肪醛脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的基因，并公開(kāi)了利用該 基因而顯示改變的表皮蠟組成的轉(zhuǎn)化植物。
[0004] 進(jìn)而，在非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 (Process Biochemistry, 41，（2006)，ρ· 1001-1014)中， 關(guān)于微生物中的烴合成途徑進(jìn)行了記載。另外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2(Appl. Microbiol. Biotechnol.，（2005)，66:p. 486-496)中，與專(zhuān)利文獻(xiàn)1同樣地關(guān)于藻類(lèi)的一種布朗葡萄藻 (Botryococcus braunii)中的經(jīng)的生物合成進(jìn)行了記載。并且，在專(zhuān)利文獻(xiàn)3(Proc. Natl. Acad. Sci.，（1994)，Vol. 91，p. 10000-10004)中，公開(kāi)了一種來(lái)源于家蠅的、將醛轉(zhuǎn)換為烴 ((Z)-9-二十三烯）的細(xì)胞色素 P450基因。
[0005] 然而，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)的微生物、在非專(zhuān)利文獻(xiàn)3中公開(kāi)的家蠅由于烷烴 生產(chǎn)量低而無(wú)法期待在實(shí)用水平中的應(yīng)用。另外，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2、專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)的藻 類(lèi)，烷烴生成反應(yīng)的速度緩慢，而且在細(xì)胞內(nèi)蓄積烷烴。因此，即使利用在非專(zhuān)利文獻(xiàn)2、專(zhuān) 利文獻(xiàn)1中公開(kāi)的藻類(lèi)，也會(huì)存在生產(chǎn)烷烴需要長(zhǎng)時(shí)間、并且需要從細(xì)胞內(nèi)純化烷烴的工 序，因而不能以低成本合成烷烴這樣的的問(wèn)題。進(jìn)而，即使利用了在專(zhuān)利文獻(xiàn)4中公開(kāi)的基 因而制作重組體，也沒(méi)有能合成烷烴的實(shí)例，由于需要未知的基因等其他因子，因此無(wú)法實(shí) 用。另外，還存在即使將來(lái)源于植物的基因用于微生物也很可能無(wú)法充分發(fā)揮功能這樣的 問(wèn)題。另外，即使利用在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中公開(kāi)的來(lái)源于藍(lán)藻的烷烴合成酶基因，烷烴合成的生 產(chǎn)性也低，實(shí)用性非常低。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0008] 專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 :W02006/109558
[0009] 專(zhuān)利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2010-528627號(hào)公報(bào)
[0010] 專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :日本特表2011-520455號(hào)公報(bào)
[0011] 專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :日本特開(kāi)平09-322780號(hào)公報(bào)
[0012] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0013] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 :Process Biochemistry, 41，（2006)，ρ· 1001-1014
[0014] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :Appl. Microbiol. Biotechnol.，（2005)，66: ρ· 486-496
[0015] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Proc. Natl. Acad. Sci·，（1994)，Vol. 91，ρ· 10000-10004


【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 發(fā)明要解決的課題
[0017] 于是，鑒于上述實(shí)際情況，本發(fā)明的目的在于，提供具有烷烴等烴合成能力優(yōu)異的 新功能的烴合成酶基因及其利用。
[0018] 用于解決課題的方法
[0019] 為了達(dá)到上述目的，本
【發(fā)明者】們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有規(guī)定的基序序列 的一組蛋白質(zhì)的由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性優(yōu)異，并發(fā)現(xiàn)，可以將編碼該 蛋白質(zhì)的基因在烴合成中利用，從而完成了本發(fā)明。
[0020] (1)基因，編碼包含具有序列號(hào)1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合 物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)。
[0021] (2)根據(jù)（1)所述的基因，其特征在于，所述蛋白質(zhì)在所述序列號(hào)1所示的基序序 列的C末端側(cè)進(jìn)一步具有序列號(hào)2所不的基序序列。
[0022] (3)根據(jù)⑴所述的基因，，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是下述（a)?⑷的任一種：
[0023] (a)包含序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
[0024] (b)包含在序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列中替換、 缺失、插入或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子數(shù)少 一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)，
[0025] (c)包含與序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列具有 70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋 白質(zhì)，
[0026] (d)由與包含序列號(hào)3?32和65?170中任一奇數(shù)號(hào)所記載的堿基序列的互補(bǔ) 鏈的多核苷酸的至少一部分在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼、且具有由醛化合物合成碳 原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)。
[0027] (4)根據(jù)⑶所述的基因，其特征在于，所述序列號(hào)3?32和65?170中任一偶 數(shù)號(hào)是序列號(hào)6或12,所述序列號(hào)3?32和65?170中任一奇數(shù)號(hào)是序列號(hào)5或11。
[0028] (5)根據(jù)（1)所述的基因，其特征在于，來(lái)源于克雷伯氏菌屬的微生物或來(lái)源于大 腸桿菌。
[0029] (6)表達(dá)載體，具有上述⑴?（5)的任一項(xiàng)所述的基因。
[0030] (7)轉(zhuǎn)化體，是導(dǎo)入上述⑴?（5)的任一項(xiàng)所述的基因而形成的。
[0031] (8)根據(jù)（7)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，以大腸桿菌或酵母為宿主。
[0032] (9)蛋白質(zhì)，由上述⑴?（5)的任一項(xiàng)所述的基因編碼。
[0033] (10)烴的制造方法，使由上述⑴?（5)的任一項(xiàng)所述的基因編碼的蛋白質(zhì)、參與 所述蛋白質(zhì)的由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的輔酶、與成為所述蛋白質(zhì)的所 述活性的底物的醛化合物共存，由該醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴。
[0034] (11)根據(jù)（10)所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將導(dǎo)入上述⑴?（5)的 任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體在包含所述醛化合物的溶液中培養(yǎng)，從而使所述蛋白 質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
[0035] (12)根據(jù)（10)所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將從導(dǎo)入上述⑴?（5) 的任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體提取到的酶液與包含所述醛化合物的溶液混合，從而 使所述蛋白質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
[0036] (13)根據(jù)（10)所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將從導(dǎo)入上述⑴?（5) 的任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體中分離到的所述蛋白質(zhì)與包含所述醛化合物和所述 輔酶的溶液混合，從而使所述蛋白質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
[0037] (14)根據(jù)（10)所述的烴的制造方法，其特征在于，所述醛化合物是碳原子數(shù)為 11?21的醛化合物。
[0038] (15)根據(jù)（10)所述的烴的制造方法，其特征在于，所述輔酶是還原型煙酰胺腺嘌 呤二核苷酸即NADH。
[0039] 本說(shuō)明書(shū)包含作為本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)2012-040141號(hào)的說(shuō)明 書(shū)和/或附圖中記載的內(nèi)容。
[0040] 發(fā)明的效果
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供與現(xiàn)有公知的醛脫羧酶基因相比，將醛化合物轉(zhuǎn)換為碳原 子數(shù)少一個(gè)的烴的活性優(yōu)異的烴合成酶基因。通過(guò)利用本發(fā)明的烴合成酶基因，能夠以醛 化合物作為底物，高效率且低成本地制造烴。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1是顯不對(duì)于來(lái)源于克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.)的10種基因制作成的轉(zhuǎn) 化體的"由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性"的測(cè)定結(jié)果的特性圖。
[0043] 圖2是對(duì)于載體對(duì)照株與gene02導(dǎo)入株的GC/MS分析圖。
[0044] 圖3是顯示對(duì)于大腸桿菌（E. coli)W3110株的5種基因制作成的轉(zhuǎn)化體的"由醛 化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性"的測(cè)定結(jié)果的特性圖。
[0045] 圖4是顯示利用導(dǎo)入了來(lái)源于克雷伯氏菌屬的gene02的轉(zhuǎn)化體的破碎液上清、以 各種醛化合物為底物的"由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性"的測(cè)定結(jié)果的特性 圖。
[0046] 圖5是對(duì)于載體對(duì)照株和gene02導(dǎo)入株，以碳原子數(shù)為14的醛化合物為底物來(lái) 測(cè)定碳原子數(shù)13的烷烴的GC/MS分析圖。
[0047] 圖6是顯示轉(zhuǎn)化大腸桿菌的破碎液、純化后的His-tag蛋白質(zhì)溶液的SDS-PAGE結(jié) 果的照片。
[0048] 圖7是顯示利用純化后的His-tag蛋白質(zhì)的體外（in vitro)燒經(jīng)合成的結(jié)果的 GC/MS分析圖。
[0049] 圖8是顯示使用NADH或NADPH作為輔酶時(shí)的烷烴合成能力的比較結(jié)果的特性圖。
[0050] 圖9是對(duì)于導(dǎo)入了 gene02基因的轉(zhuǎn)化酵母的GC/MS分析圖。
[0051] 圖10-1是顯示對(duì)于來(lái)源于各種生物種的53種基因制作成的轉(zhuǎn)化體的"由醛化合 物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性"的測(cè)定結(jié)果的特性圖。
[0052] 圖10-2是顯示對(duì)于來(lái)源于各種生物種的53種基因制作成的轉(zhuǎn)化體的"由醛化合 物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性"的測(cè)定結(jié)果的特性圖。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 以下，利用附圖和實(shí)施例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。
[0054] 本發(fā)明的烴合成基因，是編碼包含具有序列號(hào)1所示的基序序列的氨基酸序列、 且具有"由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性（以下將本活性稱(chēng)為烴合成活性）"的 蛋白質(zhì)的基因。烴合成活性，是能夠由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的酶活性，可以換 句話說(shuō)成從醛化合物中去除羰基的酶活性。此時(shí)，烴合成活性中也可以包含作為副生成物 而生成一氧化碳、二氧化碳、碳酸、甲酸以及水等的反應(yīng)。
[0055] 在此，序列號(hào)1所示的基序序列是被稱(chēng)為醛脫氫酶的谷氨酸活性部位（描述： Aldehyde dehydrogenases glutamic acid active site)的序列。在序列號(hào) 1 所不的氨基 酸序列中，第1個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為L(zhǎng)、I、V、M、F、G或A的任一種。另外，在序 列號(hào)1所示的氨基酸序列中，第3個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為L(zhǎng)、I、M、S、T、A或C的任 一種。進(jìn)而，在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，第4個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為G或S 的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，第6個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào) 為K、N、L或Μ的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，第7個(gè)Xaa是氨基 酸的單字母符號(hào)為S、A、D或N的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)1所示的氨基酸序列中，第8 個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為T(mén)、A、P、F或V的任一種。
[0056] 特別是本發(fā)明的烴合成基因優(yōu)選為編碼包含在序列號(hào)1所示的基序序列的C末 端側(cè)進(jìn)一步具有序列號(hào)2所示的基序序列的氨基酸序列、且具有烴合成活性的蛋白質(zhì)的基 因。在此，序列號(hào)2所示的基序序列，對(duì)應(yīng)于下述氨基酸序列：在對(duì)于由作為本發(fā)明的烴合 成基因的來(lái)源于克雷伯氏菌屬微生物的基因所編碼的多種蛋白質(zhì)，將它們的氨基酸序列進(jìn) 行多重比對(duì)分析時(shí)，高度保守的區(qū)域的氨基酸序列。在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，第1 個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為P、A或F的任一種。另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸序列 中，第2個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為F、H或V的任一種。進(jìn)而，在序列號(hào)2所示的氨基 酸序列中，第3個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為G或A的任一種。在序列號(hào)2所示的氨基 酸序列中，第5個(gè)Xaa可以是任意氨基酸。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，第 6個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為K、G或R的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基 酸序列中，第7個(gè)Xaa可以是任意氨基酸。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，第 10個(gè)Xaa可以是任意氨基酸。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，第11個(gè)Xaa是 氨基酸的單字母符號(hào)是G或Η的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸序列中，第12 個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為R、Κ或G的任一種。進(jìn)而另外，在序列號(hào)2所示的氨基酸 序列中，第13個(gè)Xaa是氨基酸的單字母符號(hào)為F、D、P或A的任一種。
[0057] 進(jìn)而，作為本發(fā)明的烴合成基因，可以是來(lái)源于任何生物的基因，例如，可以 從革蘭氏陰性細(xì)菌、革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物中確定、分離本發(fā)明的烴合成基 因。例如，作為革蘭氏陰性細(xì)菌，可以舉出大腸桿菌（Escherichia coli)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)。作為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可以舉出枯草桿菌（Bacillus subtilis)、 谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum)、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)。另外，作為真菌，可以舉出釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、熱帶假絲酵 母（Candida tropicalis)、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)、畢赤酵母（Pichia pastoris)、米曲霉（Aspergillus oryzae)。進(jìn)而，作為植物，可以舉出玉米（Zea mays)、 擬南芥（Arabidopsis thaliana)。進(jìn)而另外，作為動(dòng)物，可以舉出黑腹果蠅（Drosophila melanogaster)、褐鼠 （Rattus norvegicus)、人（Homo sapiens)?？梢詮母鞣N生物中分離 本發(fā)明的烴合成基因而適當(dāng)使用。
[0058] 更具體而言，上述的編碼具有序列號(hào)1所示的基序序列的蛋白質(zhì)的醛脫氫酶基 因，可以由NCBI(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心，National Center for Biotechnology Information)這樣的收納基因信息的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索。檢索的基因可以通過(guò)ACCESSION號(hào)如 下特定。
[0059] 即，作為來(lái)源于大腸桿菌（Escherichia coli)K_12W3110的基因，可以將 BAE77705、BAA35791、BAA14869、BAA14992、BAA15032、BAA16524、BAE77705、BAA15538 和 BAA15073確定為本發(fā)明的經(jīng)合成基因。另外，作為來(lái)源于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)_Fl 的基因，可以將 YP_001268218、YP_001265586、YP_001267408、YP_001267629、 ΥΡ_001266090, ΥΡ_001270490, ΥΡ_001268439, ΥΡ_001267367, ΥΡ_001267724, ΥΡ_001269548、 ΥΡ_001268395、 ΥΡ_001265936、 ΥΡ_001270470、 ΥΡ_001266779 和 ΥΡ_001270298確定為本發(fā)明的烴合成基因。
[0060] 另夕卜，作為來(lái)源于枯草桿菌（Bacillus subtilis) 168株的基因，可以將 NP_388129、NP_389813、NP_390984、NP_388203、NP_388616、NP_391658、NP_391762、 NP_391865和NP_391675確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC13032 的基因，可以將 NP_599351、NP_599725、 NP_601988、NP_599302、NP_601867和NP_601908確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái)源于 羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)DSM20016的基因，可以將YP_001270647確定為本 發(fā)明的烴合成基因。
[0061] 進(jìn)而，作為來(lái)源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的基因，可以將 NP_010996、NP_011904、NP_015264、NP_013828、NP_009560、NP_015019、NP_013893、 NP_013892和NP_011902確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái)源于熱帶假絲酵母（Candida tropicalis)MYA-3404 的基因，可以將XP_002548035、XP_002545751、XP_002547036、 XP_002547030、XP_002550712、XP_002547024、XP_002550173、XP_002546610 和 XP_002550289確定為本發(fā)明的經(jīng)合成基因。作為來(lái)源于漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii)CBS767 的基因，可以將 XP_460395、XP_457244、XP_457404、XP_457750、 XP_461954、XP_462433、XP_461708和XP_462528確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái) 源于畢赤酵母（Pichia pastoris)GS115 的基因，可以將 XP_002489360、XP_002493450、 XP_002491418、XP_002493229、XP_002490175、XP_002491360 和 XP_002491779 確定為本 發(fā)明的經(jīng)合成基因。作為來(lái)源于粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)的基因，可 以將NP_593172、NP_593499、NP_594582確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái)源于米曲霉 (Aspergillus oryzae)RIB40 的基因，可以將XP_001822148、XP_001821214、XP_001826612、 XP_001817160, XP_001817372, XP_001727 192, XP_00182664U XP_00182750U XP_001825957, XP_001822309, XP_001727308, XP_001818713, XP_001819060, XP_001823047、XP_001817717和XP_001821011確定為本發(fā)明的烴合成基因。
[0062] 進(jìn)而另夕卜，作為來(lái)源于玉米（Zea mays)的基因，可以將NP_001150417、 ΝΡ_001105047, ΝΡ_001147173, NP_001169123, NP_00110578U NP_001157807, NP_001157804、 NP_001105891、 NP_001105046、 NP_001105576、 NP_001105589、 NP_001168661、NP_001149126和NP_001148092確定為本發(fā)明的烴合成基因。作為來(lái)源于 擬南芥（Arabidopsis thaliana)的基因，可以將 NP_564204、NP_001185399、NP_178062、 NP_001189589、NP_566749、NP_190383、NP_187321、NP_190400、NP_001077676 和 NP_175812 確定為本發(fā)明的烴合成基因。
[0063] 進(jìn)而另外，作為來(lái)源于黑腹果蠅（Drosophila melanogaster)的基因，可以將 NP_733183、NP_609285、NP_001014665、NP_649099、NP_001189159、NP_610285 和 NP_610107 確定為本發(fā)明的經(jīng)合成基因。作為來(lái)源于褐鼠 （Rattus norvegicus)的基因，可以將 NP_001006999、XP_001067816、XP_001068348、XP_001068253、NP_113919、XP_001062926、 NP_071609、 NP_071852、 NP_058968、 NP_001011975、 NP_115792、 NP_001178017、 NP_001178707、NP_446348、NP_071992、XP_001059375、XP_001061872 和 NP_001128170 確 定為本發(fā)明的經(jīng)合成基因。作為來(lái)源于人（Homo sapiens)的基因，可以將NP_036322、 ΝΡ_001193826、ΝΡ_001029345、ΝΡ_000684、ΝΡ_000680、ΝΡ_000683、ΝΡ_000681、ΝΡ_001071、 NP_000687、NP_001180409、NP_001173、NP_000682、NP_000373、NP_001154976、NP_000685 和NP_000686確定為本發(fā)明的烴合成基因。
[0064] 另一方面，對(duì)于上述的編碼具有序列號(hào)1所示的基序序列的蛋白質(zhì)的基因，可以 將沒(méi)有在NCBI這樣的數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的基因組序列未知的生物的基因組序列弄清楚，基于 基因組序列信息來(lái)特定。更具體而言，可以按照常規(guī)方法對(duì)克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp. )NBRC100048株的基因組序列進(jìn)行分析，基于該基因組序列信息來(lái)特定編碼具有序列號(hào) 1所不的基序序列的蛋白質(zhì)的基因。
[0065] 作為本發(fā)明的烴合成基因的來(lái)源于克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.)的基因，可以 特定10種基因。將這10種基因方便地命名為geneOl?genelO。將這些geneOl?10中 的編碼區(qū)的堿基序列以及由其編碼的氨基酸序列總結(jié)于下述表1。
[0066] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 基因，編碼包含具有序列號(hào)1所示的基序序列的氨基酸序列、且具有由醛化合物合 成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述蛋白質(zhì)在所述序列號(hào)1所示的基序序 列的C末端側(cè)進(jìn)一步具有序列號(hào)2所不的基序序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是下述（a)?（d)的任一種： (a) 包含序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列的蛋白質(zhì)， (b) 包含在序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列中替換、缺失、 插入或添加了 1個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的 烴的活性的蛋白質(zhì)， (c) 包含與序列號(hào)3?32和65?170中任一偶數(shù)號(hào)所記載的氨基酸序列具有70%以 上的同一性的氨基酸序列、且具有由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)， (d) 由與包含序列號(hào)3?32和65?170中任一奇數(shù)號(hào)所記載的堿基序列的互補(bǔ)鏈的 多核苷酸的至少一部分在嚴(yán)格條件下雜交的多核苷酸編碼、且具有由醛化合物合成碳原子 數(shù)少一個(gè)的烴的活性的蛋白質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，所述序列號(hào)3?32和65?170中任一偶 數(shù)號(hào)是序列號(hào)6或12,所述序列號(hào)3?32和65?170中任一奇數(shù)號(hào)是序列號(hào)5或11。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，來(lái)源于克雷伯氏菌屬的微生物或來(lái)源于 大腸桿菌。
6. 表達(dá)載體，具有權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的基因。
7. 轉(zhuǎn)化體，是導(dǎo)入權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的基因而形成的。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，以大腸桿菌或酵母為宿主。
9. 蛋白質(zhì)，由權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的基因編碼。
10. 烴的制造方法，使由權(quán)利要求1?5的任一項(xiàng)所述的基因編碼的蛋白質(zhì)、參與所述 蛋白質(zhì)的由醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴的活性的輔酶、與成為所述蛋白質(zhì)的所述活 性的底物的醛化合物共存，由該醛化合物合成碳原子數(shù)少一個(gè)的烴。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將導(dǎo)入權(quán)利要求1?5 的任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體在包含所述醛化合物的溶液中培養(yǎng)，從而使所述蛋白 質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將從導(dǎo)入權(quán)利要求1?5 的任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體提取到的酶液與包含所述醛化合物的溶液混合，從而 使所述蛋白質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的烴的制造方法，其特征在于，通過(guò)將從導(dǎo)入權(quán)利要求1? 5的任一項(xiàng)所述的基因而形成的轉(zhuǎn)化體中分離到的所述蛋白質(zhì)與包含所述醛化合物和所述 輔酶的溶液混合，從而使所述蛋白質(zhì)、所述輔酶與所述醛化合物共存。
14. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的烴的制造方法，其特征在于，所述醛化合物是碳原子數(shù)為 11?21的醛化合物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的烴的制造方法，其特征在于，所述輔酶是還原型煙酰胺腺 嘌呤二核苷酸即NADH。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104093836SQ201380008257
【公開(kāi)日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月27日
【發(fā)明者】村松正善, 伊藤正和 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車(chē)株式會(huì)社