用于增加編碼的致病抗原表達(dá)的包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信 ...的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種核酸序列，所述核酸序列包含或編碼：編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼至少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白，至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)。此外，本發(fā)明提供所述核酸用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)的應(yīng)用。還公開(kāi)了其用于制備藥物組合物、特別是疫苗(例如，用于治療傳染病)的應(yīng)用。本發(fā)明還描述了利用包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)的核酸增加包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白的表達(dá)的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于增加編碼的致病抗原表達(dá)的包含或編碼組蛋白莖環(huán)和 聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)的核酸
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸序列，所述核酸序列包含或編碼：編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼至 少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白，至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)和聚腺苷 酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)。此外，本發(fā)明提供所述核酸用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá) 的應(yīng)用。還公開(kāi)了其用于制備藥物組合物、特別是疫苗（例如，用于治療傳染?。┑膽?yīng)用。 本發(fā)明還描述了利用包含或編碼組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)的核酸增 加包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白的表達(dá)的方法。
[0002] 通過(guò)接種增強(qiáng)適應(yīng)性免疫性目的在于促進(jìn)針對(duì)體內(nèi)病原體中存在的特定抗原的 有效的應(yīng)答。使用活的減毒或加熱滅活的病原體的傳統(tǒng)接種方法已經(jīng)成功地預(yù)防和治療了 傳染病，諸如天花（smallpox)、脊髓灰質(zhì)炎（polio)和白喉（diphtheria),但是存在一些主 要的疾病對(duì)其尚沒(méi)有有效的疫苗可用（例如，瘧疾（malaria)和HIV)，或者可用的疫苗僅提 供短暫的或部分的保護(hù)（例如，霍亂（cholera)和流感（flu))。較新的策略目的是使所選 的抗原靶向抗原呈遞細(xì)胞亞組并且引導(dǎo)免疫系統(tǒng)成為與針對(duì)該特定病原體的保護(hù)作用相 關(guān)的Thl和/或Th2型免疫應(yīng)答。這些目的精確的策略還導(dǎo)致治療性疫苗的開(kāi)發(fā)，所述治 療性疫苗能夠克服病原體誘導(dǎo)的用于免疫逃避的一些免疫缺陷（Gamvrellis，A.，D.Leong 等人.（2004),ImmunologyandCellBiology(免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)）82, 506-516.)。這 些新策略中的一種是基因接種。
[0003] 基因治療和基因接種是已經(jīng)在疾病的治療和預(yù)防中得到證明的分子醫(yī)學(xué)方法，并 且所述方法通常表現(xiàn)出對(duì)日常醫(yī)學(xué)實(shí)踐、特別是對(duì)上文提及的疾病的治療的相當(dāng)大的作 用。這兩種方法，即基因治療和基因接種，都是基于將核酸引入到患者細(xì)胞或組織中然后處 理由已經(jīng)引入到細(xì)胞或組織中的核酸編碼的信息，也就是說(shuō)，處理所需要的多肽的（蛋白） 表達(dá)。
[0004] 在基因治療方法中，典型地是使用DNA，盡管在最近的開(kāi)發(fā)過(guò)程中RNA也是已知 的。重要的是,在所有這些基因治療方法中，不管是使用DNA、病毒RNA還是mRNA，mRNA作 用為所編碼的蛋白的序列信息的信使。
[0005] 通常，認(rèn)為RNA是不穩(wěn)定分子：RNA酶是普遍存在的，并且眾所周知其是難于滅活 的。此外，與DNA相比，RNA還是更化學(xué)不穩(wěn)定的。因此，可能令人驚訝的是，真核細(xì)胞中 mRNA的"默認(rèn)狀態(tài)"特征在于相對(duì)的穩(wěn)定性，并且需要特定的信號(hào)來(lái)加速個(gè)體mRNAs的分 解。關(guān)于這一發(fā)現(xiàn)的主要原因似乎是細(xì)胞內(nèi)mRNA分解幾乎專(zhuān)門(mén)由核酸外切酶催化。然而， 真核mRNAs的末端是通過(guò)下述特定的末端結(jié)構(gòu)及其相締合的蛋白針對(duì)這些酶進(jìn)行保護(hù)的： 在5'端的m7GpppNCAP和典型地在3'端的聚腺苷酸序列。由此認(rèn)為這兩種末端修飾的去 除是mRNA分解的速度限制。盡管穩(wěn)定元件已經(jīng)表征為a-珠蛋白mRNA的3'UTR，但是影 響真核mRNAs的更新的RNA序列典型地通過(guò)加速脫腺苷作用而作用為分解的啟動(dòng)劑（在 Meyer，S.，C.Temme，等人?（2004),CritRevBiochemMolBiol(生物化學(xué)分子生物學(xué)重 要綜述）39(4) : 197-216.中綜述）。
[0006] 如上文提及的，真核mRNAs的5'端典型地在轉(zhuǎn)錄后修飾，以攜帶甲基化的CAP結(jié) 構(gòu)，例如，m7GpppN。除了在RNA剪接、穩(wěn)定和轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，在翻譯起始過(guò)程中，CAP結(jié)構(gòu)顯 著增強(qiáng)40S核糖體亞基向mRNA的5'端的募集。后一種功能需要由真核起始因子復(fù)合物 eIF4F來(lái)識(shí)別該CAP結(jié)構(gòu)。聚腺苷酸序列另外通過(guò)增加40S亞基到mRNAs的募集而刺激翻 譯，這是一種需要聚腺苷酸結(jié)合蛋白（PABP)的干預(yù)的作用。PABP，最近又證明與eIF4G物理 相互作用，eIF4G是CAP-結(jié)合的eIF4F復(fù)合物的一部分。因此，假設(shè)了對(duì)加帽的、聚腺苷化 的mRNAs的翻譯起始的閉環(huán)模型（Michel，Y.M.，D.Poncet，等人.（2000)，JBiolChem(生 物化學(xué)雜志）275 (41) :32268-76.)。
[0007] 幾乎所有的真核mRNAs的末端都是通過(guò)遍在切割/聚腺苷化機(jī)制添加在其3'末 端的聚腺苷酸序列。在3'末端存在聚腺苷酸序列是真核mRNAs的最顯著的特征之一。在 切割后，除了復(fù)制依賴(lài)性組蛋白轉(zhuǎn)錄物之外，大部分前mRNAs都獲得聚腺苷化的尾部。在這 種情形中，3'末端加工是促進(jìn)mRNAs從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)并且影響mRNAs的穩(wěn)定性和翻 譯的核共轉(zhuǎn)錄過(guò)程。該3'末端的信息以由切割/聚腺苷化機(jī)制引導(dǎo)的兩步反應(yīng)發(fā)生，并且 取決于在mRNA前體（前mRNAs)中存在兩種序列元件：高度保守的核苷酸六聚體AAUAAA(聚 腺苷酸化信號(hào)）和下游的富含G/U的序列。在第一步中，前mRNAs在這兩個(gè)元件之間被切 割開(kāi)。在與第一步緊密偶聯(lián)的第二步中，剛形成的3'端通過(guò)添加由200-250個(gè)腺苷酸組成 的聚腺苷酸序列而延伸，所述聚腺苷酸序列基本上影響mRNA代謝的所有方面，包括mRNA輸 出、穩(wěn)定性和翻譯〇〇1^1181^，2.和1卩.]\&^111打(2007)，66116(基因）396(2) :373-90.)。
[0008] 這一法則唯一已知的例外是復(fù)制依賴(lài)性組蛋白mRNAs，其末端是組蛋白莖環(huán)而 不是聚腺苷酸序列。示例性的組蛋白莖環(huán)序列記述在Lopez等人.（DdvilaL6pez，M.， &Samuelsson，T. (2008)，RNA(紐約，N.Y. )，14(1)，1-10.doi:10. 1261/rna. 782308.)中。
[0009] 組蛋白前mRNAs中的莖環(huán)典型地接著富含嘌呤的序列，其稱(chēng)為組蛋白下游元件 (HDE)。這些前mRNAs在細(xì)胞核中在該莖環(huán)下游的大約5個(gè)核苷酸處由單次內(nèi)切核酸水解切 割而進(jìn)行加工，該單次內(nèi)切核酸水解切割由U7snRNP通過(guò)U7snRNA與HDE的堿基配對(duì)進(jìn) 行催化。包含組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)和組蛋白下游元件（HDE) (U7snRNP的結(jié)合位點(diǎn)）的3'-UTR 序列通常稱(chēng)為組蛋白3' -加工信號(hào)（例如，參見(jiàn)Chodchoy，N.，N.B.Pandey，等人.（1991). MolCellBiol(分子細(xì)胞生物學(xué)）11(1) :497-509.)。
[0010] 由于需要將剛合成的DNA包裝成染色質(zhì)，組蛋白合成與細(xì)胞周期相適應(yīng)地進(jìn)行調(diào) 節(jié)。在S期過(guò)程中增加的組蛋白類(lèi)蛋白（histoneproteins)合成通過(guò)組蛋白基因的轉(zhuǎn)錄 激活以及組蛋白mRNA水平的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控而實(shí)現(xiàn)。這可能表明，組蛋白莖環(huán)對(duì)于組蛋白表達(dá) 調(diào)節(jié)的所有轉(zhuǎn)錄后步驟都是重要的。其是有效加工、mRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中、負(fù)載到多核糖 體上和對(duì)mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)所必需的。
[0011] 在上述情形中，鑒定一種32kDa的蛋白，其在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中在組蛋白信使的 3'端與組蛋白莖環(huán)相締合。該莖環(huán)結(jié)合蛋白（SLBP)的表達(dá)水平是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的，并且在S期最高，此時(shí)組蛋白mRNA水平增加。SLBP是U7snRNP對(duì)組蛋白前mRNA的有效的3'端 加工所必需的。在加工完成后，SLBP保持與成熟的組蛋白mRNAs的末端的莖環(huán)締合，并且 在刺激其細(xì)胞質(zhì)中翻譯成組蛋白類(lèi)蛋白。（X*ominski，Z.和W.F.Marzluff(2007)，Gene(基 因）396(2) :373-90)。有趣的是，SLBP的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在后生動(dòng)物和原生動(dòng)物中都是 保守的G)dvilaL6pez，M.，&Samuelsson，T. (2008)，RNA(紐約，N.Y. )，14(1)，1-10.doi: 10. 1261/rna. 782308)，并且能夠表明，其與組蛋白莖環(huán)序列的結(jié)合取決于莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且 最小的結(jié)合位點(diǎn)包含所述莖環(huán)的至少3個(gè)5'核苷酸和2個(gè)3'核苷酸（Pandey，N.B.，等 人?（1994)，MolecularandCellularBiology(分子和細(xì)胞生物學(xué)），14 (3) ,1709-1720 和 Williams，A.S.,&Marzluff，W.F., (1995)，NucleicAcidsResearch(核酸研究），23 (4)， 654-662.)。
[0012] 盡管組蛋白基因通常分類(lèi)為"復(fù)制依賴(lài)性的"，其產(chǎn)生末端是組蛋白莖環(huán)的mRNA， 或是"置換型的"，其相反產(chǎn)生攜帶聚腺苷酸-尾的mRNA，但是，在一些非常少見(jiàn)的情形中已 經(jīng)鑒定了其天然存在的包含組蛋白莖環(huán)和聚腺苷酸或寡腺苷酸3'的mRNAs。Sanchez等人 使用熒光素酶作為報(bào)道蛋白在爪蟾（Xenopus)卵子發(fā)生過(guò)程中檢驗(yàn)了附著在組蛋白mRNA 的組蛋白莖環(huán)的3'的天然存在的寡腺苷酸尾的作用，并且發(fā)現(xiàn)寡腺苷酸尾是在卵子發(fā)生過(guò) 程中使組蛋白mRNA沉默的翻譯抑制機(jī)制的活性部分，并且去除其是激活組蛋白mRNAs翻 譯的機(jī)制的一部分（Sanchez，R.和W.F.Marzluff(2004)，MolCellBiol(分子細(xì)胞生物 學(xué)）24(6) :2513-25)。
[0013] 此外，已經(jīng)使用編碼標(biāo)記蛋白a珠蛋白的人工構(gòu)建體研究了在前mRNA加工和 mRNA穩(wěn)定性水平上對(duì)復(fù)制依賴(lài)性組蛋白的調(diào)節(jié)的需要，這是利用與內(nèi)含子較少的組蛋白 基因相比珠蛋白基因含有內(nèi)含子的事實(shí)。對(duì)于這一目的，產(chǎn)生這樣的構(gòu)建體，其中a珠蛋 白編碼序列之后接著組蛋白莖環(huán)信號(hào)（組蛋白莖環(huán)之后接著組蛋白下游元件）和聚腺苷 酸化信號(hào)（Whitelaw，E.，等人?（1986).NucleicAcidsResearch(核酸研究），14 (17)， 7059-7070. ;Pandey,N.B.,&Marzluff,W.F. (1987).MolecularandCellularBiology(分 子和細(xì)胞生物學(xué)），7 (12)，4557-4559. ;Pandey，N.B.，等人?（1990) ?NucleicAcids Research(核酸研究），18(11) ,3161-3170)。
[0014] Lilscher等人以另一種方法研究了重組組蛋白H4基因的細(xì)胞周期依賴(lài)性調(diào)節(jié)。 產(chǎn)生這樣的構(gòu)建體，其中H4編碼序列之后接著組蛋白莖環(huán)信號(hào)和聚腺苷酸化信號(hào)，這兩種 加工信號(hào)臨時(shí)由半乳糖激酶編碼序列隔開(kāi)（Liischer，B.等人.，（1985).Proc.Natl.Acad. Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)），82 (13)，4389-4393)。
[0015] 另外，Stauber等人鑒定了在組蛋白H4mRNA水平上賦予細(xì)胞周期調(diào)節(jié)所需要 的最小序列。對(duì)于這些研究，使用這樣的構(gòu)建體，其包含在組蛋白莖環(huán)信號(hào)（其后接著 聚腺苷酸化信號(hào)）之前的選擇標(biāo)記黃嘌呤：鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（GPT)的編碼序列 (Stauber，C?等人?，（1986).EMB0J，5 (12) ,3297-3303)。
[0016] 檢驗(yàn)組蛋白前mRNA加工，Wagner等人使用在組蛋白莖環(huán)信號(hào)與聚腺苷酸化信號(hào) 之間放置EGFP的報(bào)道子構(gòu)建體（以使EGFP僅在組蛋白前mRNA加工被破壞的情形中表達(dá)） 鑒定了組蛋白前mRNAs切割所需要的因子（Wagner，E.J.等人.，（2007).M〇1Cell(分子細(xì) 胞）28 (4)，692-9)。
[0017] 應(yīng)該注意，聚腺苷化的mRNA的翻譯通常需要使得3'聚腺苷酸序列接近5'CAP。 這通過(guò)聚腺苷酸結(jié)合蛋白與真核起始因子eIF4G之間的蛋白-蛋白相互作用而調(diào)控。關(guān)于 復(fù)制依賴(lài)性的組蛋白mRNAs，已經(jīng)揭示了類(lèi)似的機(jī)制。在這種情形中，Gallie等人表明組蛋 白莖環(huán)在功能上與聚腺苷酸序列類(lèi)似，原因在于其提高翻譯效率并且共同依賴(lài)于5' -CAP， 從而建立有效的翻譯水平。他們表明組蛋白莖環(huán)足以增加報(bào)道m(xù)RNA在轉(zhuǎn)染的中國(guó)倉(cāng)鼠 卵巢細(xì)胞中的翻譯并且是必需的，但是為了最理想地行使功能，必須位于3' -端。因此， 與其他mRNAs上的聚腺苷酸尾相似，這些組蛋白mRNAs的3'端似乎是在體內(nèi)翻譯所必需 的，并且在功能上與聚腺苷酸尾相似（Gallie，D. R.，Lewis，N. J.，&Marzluff，W. F. (1996)， Nucleic Acids Research (核酸研究），24(10)，1954-1962)。
[0018] 另外，可以顯示，SLBP結(jié)合在細(xì)胞質(zhì)組蛋白mRNA上，并且是其翻譯所需要的。即 使SLBP不直接與eIF4G相互作用，但是組蛋白mRNA翻譯所需要的結(jié)構(gòu)域與最近鑒定的蛋 白SLIP1相互作用。在另一個(gè)步驟中，SLIP1與eIF4G相互作用，并且允許組蛋白mRNA循 環(huán)并通過(guò)與聚腺苷化mRNAs翻譯相似的機(jī)制支持組蛋白mRNA的有效的翻譯。
[0019] 如上文提及，基因治療方法通常使用DNA將編碼信息轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，然后其轉(zhuǎn)錄 成mRNA，所述mRNA攜帶天然存在的mRNA元件，特別是5' -CAP結(jié)構(gòu)和3'聚腺苷酸序列以 確保所編碼的治療性蛋白或抗原性蛋白的表達(dá)。
[0020] 然而，在多種情形中，不管是使用DNA還是RNA，基于將所述核酸引入到患者細(xì)胞 或組織中并且隨后通過(guò)表達(dá)由這些核酸編碼的需要的多肽的表達(dá)系統(tǒng)沒(méi)有表現(xiàn)出合乎需 要的、或者甚至是必需的可能允許有效的治療的表達(dá)水平。
[0021] 在現(xiàn)有技術(shù)中，迄今已經(jīng)進(jìn)行了不同的嘗試在體外和/或體內(nèi)增加編碼的蛋白的 表達(dá)產(chǎn)率，特別是使用改善的表達(dá)系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術(shù)中通常所述的增加表達(dá)的方法常規(guī)上是 基于使用包含特定啟動(dòng)子和相應(yīng)的調(diào)節(jié)元件的表達(dá)載體或盒。由于這些表達(dá)載體或盒典型 地局限于特定的細(xì)胞系統(tǒng)，因此這些表達(dá)系統(tǒng)必須進(jìn)行修改才能用于不同的細(xì)胞系統(tǒng)。然 后通常將所述修改的表達(dá)載體或盒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并且典型地依賴(lài)于特定的細(xì)胞系進(jìn)行處 理。因此，優(yōu)選主要產(chǎn)生對(duì)不依賴(lài)于對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型特異性的啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)元件、能夠通過(guò) 細(xì)胞中固有的系統(tǒng)在靶細(xì)胞中表達(dá)編碼的蛋白的那些核酸分子。在這種情形中，在mRNA穩(wěn) 定元件和增加mRNA翻譯效率的元件之間可以區(qū)分。
[0022] 在其編碼序列進(jìn)行優(yōu)化并且通常適用于這樣的目的的mRNAs記述在申請(qǐng)TO 02/098443(CureVacGmbH)中。例如，W0 02/098443描述了以通用形式穩(wěn)定并且在其編碼 區(qū)翻譯優(yōu)化的mRNAs。W0 02/098443還公開(kāi)了確定序列修飾的方法。W0 02/098443另外 描述了為增加序列中的鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶（G/C)含量而取代mRNA序列中的腺嘌呤和尿嘧啶 核苷酸的可能性。依據(jù)W0 02/098443,所述為增加G/C含量的取代和修改可以用于基因治 療應(yīng)用，而且還可以用作遺傳疫苗用于癌癥或傳染病的治療。在這一情形中，W0 02/098443 通常提及作為用于所述修飾的基礎(chǔ)序列的序列，其中修飾的mRNA編碼至少一種生物活性 肽或多肽，所述肽或肽在待治療的患者中例如全然不翻譯或不充分翻譯的或具有錯(cuò)誤的翻 譯。備選地，W0 02/098443提議編碼抗原（例如，致病抗原或病毒抗原）的mRNAs作為所 述修飾的基礎(chǔ)序列。
[0023] 在另一種增加所編碼的蛋白的表達(dá)的方法中，申請(qǐng)W0 2007/036366記述了長(zhǎng)的 聚腺苷酸序列（特別是長(zhǎng)于120bp)以及0珠蛋白基因的至少兩個(gè)3'非翻譯區(qū)的組合對(duì) mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性的陽(yáng)性作用。
[0024] 然而，即使所有這些近來(lái)的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)已經(jīng)嘗試提供非常有效的用于基因治療 方法以及另外改善的mRNA穩(wěn)定性和翻譯活性的工具，但是，相對(duì)于DNA疫苗和基于DNA的 基因治療方法，仍然存在基于RNA的應(yīng)用穩(wěn)定性通常較低的問(wèn)題。因此，在本領(lǐng)域中仍然存 在提供用于基因治療方法和基因接種或作為上文討論的常規(guī)治療的補(bǔ)充治療法的改善的 工具，其允許在體內(nèi)更好地提供所編碼的蛋白，例如，通過(guò)進(jìn)一步改善的mRNA穩(wěn)定性和/或 翻譯活性，優(yōu)選用于基因治療和基因接種。
[0025] 此外，盡管本領(lǐng)域中的所有進(jìn)展，在不含細(xì)胞的系統(tǒng)、細(xì)胞或生物體中有效表達(dá)所 編碼的肽或蛋白（重組表達(dá)）仍然是具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。
[0026] 因此，本發(fā)明基本目的是提供另外的和/或備選的增加所編碼的蛋白的表達(dá)的方 法，優(yōu)選地，通過(guò)相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中已知用于傳染病的治療性或預(yù)防性治療中的基因接種 的所述核酸進(jìn)一步穩(wěn)定mRNA和/或增加所述mRNA的翻譯效率而進(jìn)行。
[0027] 該目的通過(guò)后附權(quán)利要求的主題來(lái)解決。具體地，按照第一方面，本發(fā)明基本目的 通過(guò)本發(fā)明的核酸序列而解決，所述核酸序列包含或編碼 ：
[0028] a)編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼至少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽 或蛋白；
[0029] b)至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)，和
[0030]c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)，
[0031] 優(yōu)選地用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)。
[0032] 備選地，除組蛋白莖環(huán)序列之外的任意適宜的莖環(huán)序列（來(lái)源于組蛋白基因，特 別是Hl，H2A，H2B，H3和H4家族的組蛋白基因）都可以由本發(fā)明用于其所有的方面和實(shí)施 方案中。
[0033] 在這一情形中，特別優(yōu)選的是本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸至少部分通過(guò) DNA或RNA合成產(chǎn)生，優(yōu)選如本文所述，或是分離的核酸。
[0034] 本發(fā)明是基于本發(fā)明人的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)與至 少一種組蛋白莖環(huán)的組合（盡管二者均代表自然中的擇一機(jī)制）協(xié)同作用，原因在于該組 合增加蛋白的表達(dá)，高于使用任一種單獨(dú)的元件所觀(guān)察到的水平數(shù)倍（manifold)。觀(guān)察到 聚腺苷酸與至少一種組蛋白莖環(huán)的組合的協(xié)同作用與聚腺苷酸和組蛋白莖環(huán)的順序無(wú)關(guān)， 并且與聚腺苷酸序列的長(zhǎng)度無(wú)關(guān)。
[0035] 因此，特別優(yōu)選的是，本發(fā)明的核酸序列包含或編碼：a)編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼 至少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽或蛋白；b)至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)，和 c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化序列；優(yōu)選地用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)，其中所編 碼的蛋白優(yōu)選不是組蛋白類(lèi)蛋白，特別不是H4,H3,H2A和/或H2B組蛋白家族的組蛋白類(lèi) 蛋白或其保留組蛋白（_樣）功能（即，形成核小體）的片段、衍生物或變體。此外，所編碼 的蛋白典型地不對(duì)應(yīng)于H1組蛋白家族的組蛋白接頭蛋白。本發(fā)明的核酸分子典型地不包 含任何調(diào)節(jié)信號(hào)（小鼠組蛋白基因的5'和/或，特別是3'，特別不是小鼠組蛋白基因H2A 的5'和/或，特別是3'，并且進(jìn)一步最優(yōu)選不是小鼠組蛋白基因H2A614的5'和/或，特別 是3'）。特別地，其不包含來(lái)自小鼠組蛋白基因的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工信號(hào)， 特別地不是小鼠組蛋白基因H2A的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工信號(hào)，最優(yōu)選不是小 鼠組蛋白基因H2A614的組蛋白莖環(huán)和/或組蛋白莖環(huán)加工彳目號(hào)。
[0036] 此外，本發(fā)明的核酸在其元件（a)中典型地不提供報(bào)道蛋白（例如，熒光素酶， GFP，EGFP，0 -半乳糖苷酶，特別是EGFP)，半乳糖激酶（galK)和/或標(biāo)記或選擇蛋白（例 如，a-珠蛋白，半乳糖激酶和黃嘌呤：鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（GPT))或細(xì)菌報(bào)道蛋白， 例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)或其他細(xì)菌抗生素抗性蛋白，例如，來(lái)源于細(xì)菌neo基因的細(xì) 菌抗生素抗性蛋白。
[0037] 報(bào)道、標(biāo)記或選擇蛋白典型地理解為不是本發(fā)明所述的抗原性蛋白。報(bào)道、標(biāo)記或 選擇蛋白或其基礎(chǔ)基因（underlyinggene)通常用作細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)物、動(dòng)物或植物中的研 究工具。它們賦予表達(dá)其的生物體（優(yōu)選是異源表達(dá)）容易鑒別的特性，所述特性可以測(cè) 量或允許進(jìn)行選擇。具體地，標(biāo)記或選擇蛋白表現(xiàn)出可選擇的功能。典型地，所述選擇、標(biāo) 記或報(bào)道蛋白在人或其他動(dòng)物中不是天然存在的，而是來(lái)源于其他生物體，特別是來(lái)源于 細(xì)菌或植物。因此，來(lái)源于低等物種（例如，細(xì)菌）的具有選擇、標(biāo)記或報(bào)道功能的蛋白優(yōu) 選排除被理解為本發(fā)明所述的"抗原性蛋白"。在這一點(diǎn)上，抗原性蛋白意指對(duì)應(yīng)這樣的蛋 白，所述蛋白引發(fā)允許免疫學(xué)性保護(hù)受試者抵抗在受試者中發(fā)生導(dǎo)致疾病狀態(tài)的病理學(xué)反 應(yīng)的生物體或病毒的感染的免疫學(xué)反應(yīng)。特別地，選擇、標(biāo)記或報(bào)道蛋白允許通過(guò)例如基于 熒光或其他分光光度計(jì)技術(shù)以及針對(duì)抗生素的抗性的體外測(cè)定來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此， 賦予轉(zhuǎn)化的細(xì)胞所述特性的選擇、報(bào)道或標(biāo)記基因典型地不被理解為本發(fā)明所述的致病抗 原性蛋白。
[0038] 在任何情形中，報(bào)道、標(biāo)記或選擇蛋白通常不發(fā)揮任何（待治療的受試者）針對(duì)致 病抗原的免疫學(xué)應(yīng)答導(dǎo)致的抗原性作用。如果任一種單獨(dú)的報(bào)道、標(biāo)記或選擇蛋白仍然發(fā) 揮抗原性作用（除了其報(bào)道、選擇或標(biāo)記功能之外），則所述報(bào)道、標(biāo)記或選擇蛋白優(yōu)選不 被理解為本發(fā)明意義內(nèi)的"致病抗原"。
[0039] 相比之下，本發(fā)明所述的致病抗原（包括其片段、變體和衍生物），特別排除H1、 H2A、H2B、H3和H4家族的組蛋白基因，典型地不表現(xiàn)出選擇、標(biāo)記或報(bào)道功能。如果任一單 個(gè)"致病抗原"仍然應(yīng)該表現(xiàn)出選擇、標(biāo)記或報(bào)道功能（除了其抗原功能之外），所述致病抗 原優(yōu)選不被理解為本發(fā)明意義內(nèi)的"選擇、標(biāo)記或報(bào)道蛋白"。
[0040] 最優(yōu)選地理解為本發(fā)明所述的致病抗原來(lái)源于發(fā)揮免疫學(xué)功能的致病生物體，優(yōu) 選來(lái)源于細(xì)菌或病毒。典型地，所述抗原不適合作為選擇、標(biāo)記或報(bào)道蛋白。
[0041] 因此，優(yōu)選的是，編碼至少一種肽或蛋白的編碼區(qū)（a)與至少一種組蛋白莖環(huán)的 至少（b)，或更廣泛地，與任意適當(dāng)?shù)那o環(huán)是異源的。換言之，在本發(fā)明的情形中，"異源"意 指至少一種莖環(huán)序列不是天然存在為編碼本發(fā)明核酸的元件（a)的（致?。┛乖缘鞍谆?肽的特定基因的（調(diào)節(jié)）序列（例如，在3'UTR)。因此，本發(fā)明核酸的（組蛋白）莖環(huán)優(yōu)選 來(lái)源于不同于包含本發(fā)明核酸的元件（a)的編碼區(qū)的基因的基因的3'UTR。例如，如果本 發(fā)明核酸是異源的，則元件（a)的編碼區(qū)不編碼組蛋白類(lèi)蛋白或其（保留組蛋白類(lèi)蛋白的 功能的）片段、變體或衍生物，而是編碼發(fā)揮生物學(xué)功能、優(yōu)選不同于組蛋白（_樣）功能的 抗原功能的任意其他的（相同物種或另一種物種的）肽或序列，例如，編碼抗原性蛋白（發(fā) 揮抗原功能，例如，通過(guò)引發(fā)受試者免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，例如，通過(guò)抗體反應(yīng)，由此允許本發(fā)明 的核酸在例如哺乳動(dòng)物、特別是人中作用為疫苗）。
[0042] 在這一情形中，特別優(yōu)選的是本發(fā)明的核酸在5' -至3' -方向上包含或編碼：
[0043] a)編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼至少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生物的肽 或蛋白；
[0044] b)至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)，任選地沒(méi)有所述組蛋白莖環(huán)3'的組蛋白下游元件 (HDE)，
[0045] c)聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)。
[0046] 術(shù)語(yǔ)"組蛋白下游元件（HDE) "是指在天然存在的組蛋白莖環(huán)3'的約15-20個(gè)核苷 酸的富含嘌呤的多核苷酸片段，其表示參與將組蛋白前mRNA加工為成熟的組蛋白mRNA的 U7snRNA的結(jié)合位點(diǎn)。例如，在海膽（seaurchins)中，所述HDE為CAAGAAAGA(Dominski，Z?和W.F.Marzluff(2007)，Gene(基因）396(2) :373-90)。
[0047] 此外，優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸不包含內(nèi)含子。
[0048] 在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸序列從5' 到3'包含或編碼：
[0049] a)編碼區(qū)，優(yōu)選地所述編碼區(qū)編碼至少一種包含致病抗原或其片段、變體或衍生 物的肽或蛋白；
[0050] C)聚腺苷酸序列；和
[0051] b)至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)。
[0052] 本發(fā)明第一實(shí)施方案所述的本發(fā)明的核酸序列包含任意適當(dāng)?shù)暮怂?，例如，選自 任意（單鏈或雙鏈）DNA，優(yōu)選地，但不限于此，例如，基因組DNA，質(zhì)粒DNA，單鏈DNA分子，雙 鏈DNA分子，或可以選自例如任意PNA(肽核酸）或可以選自例如任意（單鏈或雙鏈）RNA， 優(yōu)選信使RNA(mRNA);等等。本發(fā)明的核酸序列還可以包含病毒RNA(vRNA)。然而，本發(fā)明 的核酸序列可以不是病毒RNA或者可以不包含病毒RNA。更具體地，本發(fā)明的核酸序列可以 不包含病毒序列兀件，例如，病毒增強(qiáng)子或病毒啟動(dòng)子（例如，沒(méi)有滅活的病毒啟動(dòng)子或序 列元件，更具體地不是通過(guò)更換策略滅活），或其他病毒序列元件，或病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒核 酸序列。更具體地，本發(fā)明的核酸序列可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒或病毒載體或修飾的反轉(zhuǎn)錄病 毒或病毒載體。
[0053] 在任意情形中，本發(fā)明的核酸序列可以或可以不包含增強(qiáng)子和/或啟動(dòng)子序列， 其可以被修飾或不被修飾或者其可以是激活的或不被激活。所述增強(qiáng)子或啟動(dòng)子可以是植 物可表達(dá)的或不可表達(dá)的，和/或在真核生物中可表達(dá)或不可表達(dá)和/或在原核生物中可 表達(dá)或不可表達(dá)。本發(fā)明的核酸序列可以包含或不包含編碼（自我剪接）核酶的序列。
[0054] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸序列可以是或可以包含自我復(fù)制的RNA(復(fù) 制子）。
[0055] 優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列是質(zhì)粒DNA或RNA，特別是mRNA。
[0056] 在本發(fā)明第一方面的具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸是包含在適于體外轉(zhuǎn)錄的 核酸中的核酸序列，特別是包含在適當(dāng)?shù)捏w外轉(zhuǎn)錄載體中的核酸序列（例如，包含用于體 外轉(zhuǎn)錄的特定啟動(dòng)子（諸如T3、17或Sp6啟動(dòng)子）的質(zhì)?；蚓€(xiàn)性核酸序列）。
[0057] 在本發(fā)明第一方面的其他特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸包含在適于 在表達(dá)系統(tǒng)中（例如，在表達(dá)載體或質(zhì)粒中）、特別是在原核（例如，細(xì)菌，如大腸桿菌 (E.coli)，或真核（例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CH0細(xì)胞，酵母細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞或完整生物體， 如植物或動(dòng)物）表達(dá)系統(tǒng)中）轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的核酸。
[0058] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)系統(tǒng)"意指適于產(chǎn)生肽、蛋白或RNA，特別是mRNA(重組表達(dá)）的系統(tǒng) (細(xì)胞培養(yǎng)物或完整生物體）。
[0059] 本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少一個(gè)組蛋白莖環(huán)。在本 發(fā)明的情形中，所述組蛋白莖環(huán)典型地來(lái)源于組蛋白基因，并且包含兩個(gè)相鄰的完全或部 分反向互補(bǔ)序列的分子內(nèi)堿基配對(duì)，由此形成莖環(huán)。不管其是組蛋白莖環(huán)還是不是組蛋白 莖環(huán)，莖環(huán)通常可以存在于單鏈DNA中，或者更常見(jiàn)地存在于RNA中。該結(jié)構(gòu)還稱(chēng)為發(fā)夾或 發(fā)夾環(huán)，并且通常由連續(xù)序列內(nèi)的莖和（末端）環(huán)組成，其中所述莖由兩條由在一定程度上 作為間隔體的短序列隔開(kāi)的相鄰的完全或部分反向互補(bǔ)的序列形成，所述作為間隔體的短 序列成為所述莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)。這兩條相鄰的完全或部分反向互補(bǔ)的序列可以定義為，例如， 莖環(huán)元件莖1和莖2。當(dāng)這兩條相鄰的完全或部分反向互補(bǔ)的序列，例如，莖環(huán)元件莖1和 莖2,彼此形成堿基配對(duì)時(shí)，形成雙鏈的核酸序列片段，其在其末端包含由位于連續(xù)序列上 的莖環(huán)元件莖1和莖2之間的短序列形成的不配對(duì)的環(huán)，從而形成莖環(huán)。不配對(duì)的環(huán)由此典 型地表示核酸不能與這些莖環(huán)元件中的任一個(gè)堿基配對(duì)的區(qū)域。形成的棒棒糖-形狀的結(jié) 構(gòu)是多種RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)單元。因此，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的形成依賴(lài)于產(chǎn)生的莖和環(huán)區(qū)域 的穩(wěn)定性，其中第一前提條件典型地是存在可以自身向后折疊形成配對(duì)雙鏈的序列。配對(duì) 的莖環(huán)元件的穩(wěn)定性由長(zhǎng)度、其包含的錯(cuò)配或凸起的數(shù)量（少量錯(cuò)配典型地是可耐受的， 尤其是在長(zhǎng)的雙鏈片段中）以及配對(duì)區(qū)的堿基組成決定。在本發(fā)明的情形中，3-15個(gè)堿基 的環(huán)長(zhǎng)度是可能的，但是更優(yōu)選的最佳環(huán)長(zhǎng)度是3-10個(gè)堿基，更優(yōu)選3-8個(gè)，3-7個(gè)，3-6個(gè) 或甚至更優(yōu)選4-5個(gè)堿基，并且最優(yōu)選4個(gè)堿基。形成雙鏈結(jié)構(gòu)的莖序列典型地具有5-10 個(gè)堿基的長(zhǎng)度，更優(yōu)選5-8個(gè)堿基的長(zhǎng)度。
[0060] 在本發(fā)明的情形中，組蛋白莖環(huán)典型地來(lái)源于組蛋白基因（例如，來(lái)源于組蛋白 家族H1，H2A，H2B，H3，H4的基因），并且包含兩條相鄰的完全或部分反向互補(bǔ)的序列的分子 內(nèi)堿基配對(duì)，由此形成莖環(huán)。典型地，組蛋白3'UTR莖環(huán)是參與組蛋白mRNAs的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn) 以及在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性和翻譯效率的調(diào)節(jié)的RNA元件。后生動(dòng)物組蛋白基因的mRNAs缺 少聚腺苷化和聚-A尾，相比之下，3'端加工在該高度保守的莖環(huán)與下游約20個(gè)核苷酸處 的富含嘌呤的區(qū)域（組蛋白下游元件，或HDE)之間的位點(diǎn)發(fā)生。組蛋白莖環(huán)被31kDa莖環(huán) 結(jié)合蛋白（SLBP-也稱(chēng)為組蛋白發(fā)夾結(jié)合蛋白或HBP)結(jié)合。所述組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)優(yōu)選由本 發(fā)明與其他序列元件和結(jié)構(gòu)組合使用，所述其他序列元件和結(jié)構(gòu)不天然存在于（意指在未 轉(zhuǎn)化的或生物體/細(xì)胞中）組蛋白基因中，而是按照本發(fā)明組合以提供人造的異源核酸。因 此，本發(fā)明特別是基于這樣的發(fā)現(xiàn)：組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與其他異源序列元件的人工（非天然 的）組合提供有利的作用，所述其他異源序列元件不存在于組蛋白基因中或后生動(dòng)物組蛋 白基因中，并且分離自編碼不同于組蛋白的蛋白的基因的可操作和/或調(diào)節(jié)序列區(qū)域（影 響轉(zhuǎn)錄和/或翻譯）。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與不存在于后生動(dòng)物 組蛋白基因中的聚腺苷酸序列或表示聚腺苷酸化信號(hào)的序列（編碼區(qū)的3'-端）的組合。 按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面，提供組蛋白莖環(huán)結(jié)構(gòu)與編碼優(yōu)選不存在于后生動(dòng)物組蛋 白基因中的致病抗原的編碼區(qū)的組合（編碼區(qū)和組蛋白莖環(huán)序列是異源的）。優(yōu)選地，如果 所述致病抗原完全不存在于后生動(dòng)物中，而是來(lái)源于單細(xì)胞生物體，例如，細(xì)菌，或來(lái)源于 病毒。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸的所有元件（a)、(b)和（c)彼此是異源的， 并且由三種不同的來(lái)源人工組合，例如，抗原編碼區(qū)來(lái)源于細(xì)菌或病毒，組蛋白莖環(huán)來(lái)源于 后生動(dòng)物組蛋白基因，聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)來(lái)源于例如不同于組蛋白基因的后 生動(dòng)物基因。
[0061] 因此，組蛋白莖環(huán)是本文所述的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，如果優(yōu)選是官能化限定的，則其表現(xiàn)出 /保留與其天然結(jié)合配偶體莖環(huán)結(jié)合蛋白（SLBP-也稱(chēng)作組蛋白發(fā)夾結(jié)合蛋白或HBP)結(jié)合 的特性。
[0062] 按照本發(fā)明，權(quán)利要求1的組件（b)所述的組蛋白莖環(huán)序列可以不是來(lái)源于小鼠 組蛋白類(lèi)蛋白。更特別地，所述組蛋白莖環(huán)序列可以不是來(lái)源于小鼠組蛋白基因H2A614。此 夕卜，本發(fā)明的核酸可以不包含小鼠組蛋白莖環(huán)序列也不包含小鼠組蛋白基因H2A614。此外， 即使本發(fā)明的核酸序列可以包含至少一種哺乳動(dòng)物組蛋白基因，但是本發(fā)明的核酸序列可 以不包含莖環(huán)加工信號(hào)，更具體地，小鼠組蛋白加工信號(hào)，并且最具體地，可以不包含小鼠 莖環(huán)加工信號(hào)H2kA614。然而，所述至少一種哺乳動(dòng)物組蛋白基因可以不是W0 01/12824的 Seq.IDNo. 7〇
[0063] 按照本發(fā)明第一方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的核酸序列包含或編碼至少 一種組蛋白莖環(huán)序列，優(yōu)選按照下式（I)或（II)中的至少一種所述。
[0064] 式（I)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列）：
[0065]
【權(quán)利要求】
1. 核酸序列，其包含或編碼： a) 編碼區(qū)，所述編碼區(qū)編碼至少一種肽或蛋白； b) 至少一種組蛋白莖環(huán)，和 c) 聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信號(hào)； 其中所述肽或蛋白包含致病抗原或其片段、變體或衍生物，特別是來(lái)自與傳染病相關(guān) 的病原體的抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸序列，其中所述傳染病是細(xì)菌感染、病毒感染、原生動(dòng)物 感染、真菌感染等。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的核酸序列，其中所述致病抗原來(lái)源于選自下述列表 的病原體：鮑氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii)，無(wú)形體屬（Anaplasma genus)， Anaplasma phagocytophilum,貓鉤蟲(chóng)(Ancylostoma braziliense)，十二指腸鉤蟲(chóng) (Ancylostoma duodenale)，溶血隱秘桿菌（Arcanobacterium haemolyticum)，人蟲(chóng)回蟲(chóng) (Ascaris Iumbricoides)，曲霉菌屬（Aspergillus genus)，星狀病毒科（Astroviridae)， 巴貝蟲(chóng)屬（Babesia genus)，炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis)，錯(cuò)狀芽孢桿菌 (Bacillus cereus)，漢氏巴爾通氏體（Bartonella henselae)，BK病毒，人芽囊原蟲(chóng) (Blastocystis hominis)，皮炎芽生菌（Blastomyces dermatitidis)，百日咳博德特 氏菌（Bordetella pertussis)，伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)，疏螺旋體屬 (Borrelia genus)，疏螺旋體屬物種（Borrelia spp)，布魯桿菌屬（Brucella genus)， 馬來(lái)絲蟲(chóng)（Brugia malayi)，布尼亞病毒科（Bunyaviridae)，洋蔥伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia cepacia)和其他伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia)物種，鼻疽伯克霍爾 德氏菌（Burkholderia mallei)，類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia pseudomallei)， 嵌杯病毒科（Caliciviridae)，彎曲桿菌屬（Campylobacter genus)，白色念珠菌（Candida albicans)，念珠菌屬物種（Candida spp)，砂眼衣原體（Chlamydia trachomatis)，肺炎 衣原體（Chlamydophila pneumoniae)，嬰I鶴熱衣原體（Chlamydophila psittaci)，CJD 月元病毒，華支睪吸蟲(chóng)（Clonorchis sinensis)，肉毒梭菌（Clostridium botulinum)，艱難 梭菌（Clostridium difficile)，產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)，產(chǎn)氣莢膜梭 菌，梭菌屬物種（Clostridium spp)，破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani)，球抱菌屬物種 (Coccidioides spp)，冠狀病毒，白喉棒桿菌（Corynebacterium diphtheriae)，伯內(nèi)特考 克斯體（Coxiella burnetii)，克里米亞-剛果出血熱病毒，新型隱球菌（Cryptococcus neoformans)，隱孢子蟲(chóng)屬（Cryptosporidium genus)，巨細(xì)胞病毒（CMV)，登革熱病毒 (DEN-1，DEN-2，DEN-3 和 DEN-4)，脆弱雙核阿米巴（Dientamoeba fragilis)，埃博拉病 毒（EBOV)，棘球?qū)伲‥chinococcus genus)，恰菲埃里希氏體（Ehrlichia chaffeensis)， 尤氏埃里希氏體（Ehrlichia ewingii)，埃里希氏體屬（Ehrlichia genus)，溶組織內(nèi)阿 米巴（Entamoeba histolytica)，腸球菌屬（Enterococcus genus)，腸道病毒屬，腸道病 毒，主要為柯薩奇病毒A病毒和腸道病毒71 (EV71)，表皮癬菌屬物種（Epidermophyton spp)，埃巴病毒（EBV)，大腸桿菌（Escherichia coIi)0157 :H7，0111 和 0104 :H4,肝片 形吸蟲(chóng)（Fasciola hepatica)和巨大片形吸蟲(chóng)（Fasciola gigantica)，F(xiàn)FI朊病毒，絲 蟲(chóng)目（Filarioidea)超家族，黃病毒，土拉熱弗朗西絲菌（Francisella tularensis)，梭 桿菌屬(Fusobacterium genus)，白地霉（Geotrichum candidum)，腸賈第蟲(chóng)（Giardia intestinalis)，顎口線(xiàn)蟲(chóng)屬物種（Gnathostoma spp)，GSS朊病毒，瓜納里托病毒，杜克 雷嗜血桿菌（Haemophilus ducreyi)，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae)，幽門(mén)螺桿 菌（Helicobacter pylori)，亨尼病毒屬（亨德拉病毒尼帕病毒），甲型肝炎病毒，乙型 肝炎病毒（HBV)，丙型肝炎病毒（HCV)，丁型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，單純皰疹病毒1和 2(HSV-1和HSV-2)，莢膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum)，HIV (人免疫缺陷病毒）， 威尼克何德霉（Hortaea wemeckii)，人博卡病毒（HBoV)，人皰疹病毒6 (HHV-6)和人皰 疹病毒7(HHV-7)，人偏肺病毒（hMPV)，人乳頭瘤病毒（HPV)，人副流感病毒（HPIV)，日本 腦炎病毒，JC病毒，胡寧病毒，金氏金氏菌（Kingella kingae)，肉芽腫桿菌（Klebsiella granulomatis)，庫(kù)魯朊病毒，拉沙病毒，嗜肺軍團(tuán)病桿菌（Legionella pneumophila)，利 什曼原蟲(chóng)屬（Leishmania genus)，鉤端螺旋體屬（Leptospira genus)，單核細(xì)胞增生利斯 特菌（Listeria monocytogenes)，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV)，Machupo病毒， 馬拉色霉菌屬物種（Malassezia spp)，馬堡病毒，麻疫病毒，橫川后殖吸蟲(chóng)（Metagonimus yokagawai)，微孢子蟲(chóng)門(mén)（Microsporidia phylum)，傳染性軟疵病毒（MCV)，腿腺炎病 毒，麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacterium leprae)和 Mycobacterium lepromatosis，結(jié)核分 枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)，潰瘍分枝桿菌（Mycobacterium ulcerans)， 肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae)，福氏耐格里原蟲(chóng)（Naegleria fowleri)，美洲 板 口線(xiàn)蟲(chóng)（Necator americanus)，淋病奈瑟球菌（Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎 奈瑟球菌（Neisseria meningitidis)，星狀諾卡爾菌（Nocardia asteroides)，諾卡 爾菌屬物種（Nocardia spp)，旋盤(pán)尾絲蟲(chóng)（Onchocerca volvulus)，恙蟲(chóng)熱立克次體 (Orientia tsutsugamushi)，正粘病毒科（Orthomyxoviridae)(流感），巴西副球抱子菌 (Paracoccidioides brasiliensis)，并殖吸蟲(chóng)屬物種（Paragonimus spp)，衛(wèi)斯特曼并殖 吸蟲(chóng)（Paragonimus westermani)，細(xì)小病毒 B19,巴斯德菌屬（Pasteurella genus)，癥原 蟲(chóng)屬（Plasmodium genus)，杰氏肺囊蟲(chóng)（Pneumocystis jirovecii)，脊髓灰質(zhì)炎病毒，狂 犬病病毒，呼吸道合胞病毒（RSV)，鼻病毒屬，鼻病毒，痘立克次體（Rickettsia akari)， 立克次體屬（Rickettsia genus)，普氏立克次體（Rickettsia prowazekii)，立氏立克 次體（Rickettsia rickettsii)，斑疫傷寒立克次體（Rickettsia typhi)，裂谷熱病毒， 輪狀病毒屬，風(fēng)疫病毒，薩比亞病毒，沙門(mén)菌屬（Salmonella genus)，擠螨（Sarcoptes scabiei)，SARS 冠狀病毒，血吸蟲(chóng)屬（Schistosoma genus)，志賀菌屬（Shigella genus)，辛諾桕病毒，漢坦病毒屬，申克孢子絲菌（Sporothrix schenckii)，葡萄球菌屬 (Staphylococcus genus)，葡萄球菌屬，無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)，肺炎鏈 球菌（Streptococcus pneumoniae)，釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes)，幾類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng) (Strongyloides stercoralis)，絳蟲(chóng)屬（Taenia genus)，豬肉絳蟲(chóng)（Taenia solium)，蜱 傳腦炎病毒（TBEV)，犬弓蛔線(xiàn)蟲(chóng)（Toxocara canis)或貓弓蛔蟲(chóng)（Toxocara cati)，鼠弓形 蟲(chóng)（Toxoplasma gondii)，蒼白密螺旋體（Treponema pallidum)，旋毛線(xiàn)蟲(chóng)（Trichinella spiralis)，陰道毛滴蟲(chóng)（Trichomonas vaginalis)，發(fā)癬菌屬物種（Trichophyton spp)， 鞭形鞭蟲(chóng)（Trichuris trichiura)，布魯斯維蟲(chóng)（Trypanosoma brucei)，克魯斯維蟲(chóng) (Trypanosoma cruzi)，尿素分解尿素支原體（Ureaplasma urealyticum)，水痘-帶狀 皰疹病毒（VZV)，水痘-帶狀皰疹病毒（VZV)，重型天花或類(lèi)天花，vCJD朊病毒，委內(nèi) 瑞拉馬腦炎病毒，霍亂弧菌（Vibrio cholerae)，西尼羅河病毒，西部馬腦炎病毒，班氏 吳策線(xiàn)蟲(chóng)（Wuchereria bancrofti)，黃熱病病毒，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica)，鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis)和假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis)〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述致病抗原來(lái)源于選自下述的 病原體：流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV)，單純皰疹病毒（HSV)，人乳頭瘤病毒（HPV)，人免 疫缺陷病毒（HIV)，痕原蟲(chóng)屬（Plasmodium),金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus), 登革熱病毒，砂眼衣原體（Chlamydia trachomatis),巨細(xì)胞病毒（CMV)，乙型肝炎病毒 (HBV)，結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)，狂犬病病毒和黃熱病病毒。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述致病抗原選自： ?當(dāng)所述傳染病是HIV，優(yōu)選是人免疫缺陷病毒的感染時(shí)：HIV p24抗原，HIV包膜蛋白 (Gpl20，Gp41，Gpl60)，多蛋白GAG，陰性因子蛋白Nef，轉(zhuǎn)錄的反式激活劑Tat ; ?當(dāng)所述傳染病是砂眼衣原體（Chlamydia trachomatis)感染時(shí)：主要外膜蛋白 M0MP，可能的外膜蛋白PMPC，外膜復(fù)合蛋白B OmcB，熱休克蛋白Hsp60 HSP10,蛋白IncA，來(lái) 自III型分泌系統(tǒng)的蛋白，核糖核苷酸還原酶小鏈蛋白NrdB,質(zhì)粒蛋白Pgp3,衣原體外膜蛋 白NCopN，抗原CT521，抗原CT425，抗原CT()43，抗原TC0052，抗原TC0189，抗原TC0582，抗 原 TC0660,抗原 TC0726,抗原 TC0816,抗原 TC0828 ; ?當(dāng)所述傳染病是巨細(xì)胞病毒感染時(shí)，優(yōu)選地是巨細(xì)胞病毒（CMV)的感染時(shí)：pp65抗 原，膜蛋白PP15,鄰近衣殼的間層蛋白ppl50,蛋白M45, DNA聚合酶UL54,解旋酶UL105,糖 蛋白gM，糖蛋白gN，糖蛋白H，糖蛋白B gB，蛋白UL83,蛋白UL94,蛋白UL99 ; ?當(dāng)所述傳染病是登革熱時(shí)，優(yōu)選是登革熱病毒（DEN-1，DEN-2, DEN-3和DEN-4)-黃 病毒感染時(shí)：衣殼蛋白C，前膜蛋白prM，膜蛋白M，包膜蛋白E (結(jié)構(gòu)域I，結(jié)構(gòu)域II，結(jié)構(gòu)域 Π )，蛋白NS1，蛋白NS2A，蛋白NS2B，蛋白NS3,蛋白NS4A，蛋白2K，蛋白NS4B，蛋白NS5 ; ?當(dāng)所述傳染病是乙型肝炎，優(yōu)選是乙型肝炎病毒（HBV)感染時(shí)：乙型肝炎表面抗原 HBsAg，乙型肝炎核心抗原HbcAg，聚合酶，蛋白Hbx，preS2中表面蛋白，表面蛋白L，大S蛋 白，病毒蛋白VP1，病毒蛋白VP2,病毒蛋白VP3,病毒蛋白VP4 ; ?當(dāng)所述傳染病是人乳頭瘤病毒（HPV)感染，優(yōu)選是人乳頭瘤病毒（HPV)的感染時(shí)：復(fù) 制蛋白E1，調(diào)節(jié)蛋白E2,蛋白E3,蛋白E4,蛋白E5,蛋白E6,蛋白E7,蛋白E8,主要衣殼蛋白 L1，次要衣殼蛋白L2 ; ?當(dāng)所述傳染病是人副流感病毒感染，優(yōu)選是人副流感病毒（HPIV)的感染時(shí)：融合蛋 白F，血凝素-神經(jīng)酰胺酶HN，糖蛋白G，基質(zhì)蛋白M，磷蛋白P，核蛋白N，聚合酶L ; ?當(dāng)所述傳染病是狂犬病，優(yōu)選是狂犬病病毒感染時(shí)：血凝素（HA)，神經(jīng)酰胺酶（NA)， 核蛋白（NP)，Ml蛋白，M2蛋白，NSl蛋白，NS2蛋白（NEP蛋白：核輸出蛋白），PA蛋白，PBl 蛋白（聚合酶堿性1蛋白），PB1-F2蛋白和PB2蛋白（正粘病毒科（Orthomyxoviridae), 流感病毒（流感））；核蛋白N，大結(jié)構(gòu)蛋白L，憐蛋白P，基質(zhì)蛋白M，糖蛋白G ; ?當(dāng)所述傳染病是呼吸道合胞病毒感染，優(yōu)選是呼吸道合胞病毒（RSV)的感染時(shí)：融 合蛋白F，核蛋白N，基質(zhì)蛋白M，基質(zhì)蛋白M2-1，基質(zhì)蛋白M2-2,磷蛋白P，小疏水蛋白SH，主 要表面糖蛋白G，聚合酶L，非結(jié)構(gòu)蛋白I NS1，非結(jié)構(gòu)蛋白2 NS2 ; ?當(dāng)所述傳染病是結(jié)核病，優(yōu)選是結(jié)核分枝桿菌感染時(shí)：分泌抗原SssA(葡萄球菌屬 (Staphylococcus genus),葡萄球菌食物中毒）；分泌抗原SssA (葡萄球菌屬，例如，金黃色 葡萄球菌，葡萄球菌感染）；分子伴侶DnaK，細(xì)胞表面脂蛋白Mpt83,脂蛋白P23,磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系 統(tǒng)通透酶蛋白pstA，HkDa抗原，纖連蛋白-結(jié)合蛋白C FbpCl，丙氨酸脫氫酶TB43,谷氨酰 胺合酶1，ESX-1蛋白，蛋白CFP10，TB10. 4蛋白，蛋白MPT83,蛋白MTB12,蛋白MTB8，Rpf-樣 蛋白，蛋白MTB32,蛋白MTB39,晶體蛋白，熱休克蛋白HSP65,蛋白PST-S ; ?當(dāng)所述傳染病是黃熱病，優(yōu)選是黃熱病病毒的感染時(shí)：基因組多蛋白，蛋白E，蛋白 M，衣殼蛋白C，蛋白酶NS3,蛋白NSl，蛋白NS2A，蛋白AS2B，蛋白NS4A，蛋白NS4B，蛋白NS5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的核酸，其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)與編碼所述至少一種 肽或蛋白的編碼區(qū)是異源的，優(yōu)選其中所述編碼區(qū)不編碼組蛋白或其具有組蛋白或組蛋白 樣功能的片段、衍生物或變體。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的核酸，其中由所述編碼區(qū)編碼的肽或蛋白包含抗原蛋白或 其片段、變體或衍生物，所述抗原蛋白或肽的片段、變體或衍生物保留天然存在的全長(zhǎng)抗原 蛋白或肽的至少50%的生物活性。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的核酸，其中其編碼區(qū)不編碼報(bào)道蛋白或標(biāo)記或選 擇蛋白。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述核酸是RNA，優(yōu)選mRNA。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)選自 下式⑴或（II): 式（1)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列）：
式（II)(具有莖邊界元件的莖環(huán)序列）： 其中：
莖1或莖2邊界元件Np6是1-6個(gè)、優(yōu)選2-6個(gè)、更優(yōu)選2-5個(gè)、甚至更優(yōu)選3-5個(gè)、 最優(yōu)選4-5個(gè)或5個(gè)N的連續(xù)序列，其中每個(gè)N彼此獨(dú)立地選自下述核苷酸：所述核苷酸選 自A，U，T，G和C，或其核苷酸類(lèi)似物； 莖I [Nch2GN3J 與元件莖2反向互補(bǔ)或部分反向互補(bǔ)，并且是5-7個(gè)核苷酸的連續(xù)序 列； 其中Nch2是0-2個(gè)、優(yōu)選0-1個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)N的連續(xù)序列，其中每個(gè)N彼此獨(dú)立地選 自下述核苷酸：所述核苷酸選自A，U，T，G和C或其核苷酸類(lèi)似物； 其中N3_5是3-5個(gè)、優(yōu)選4-5個(gè)、更優(yōu)選4個(gè)N的連續(xù)序列，其中每個(gè)N彼此獨(dú)立地選 自下述核苷酸：所述核苷酸選自A，U，T，G和C或其核苷酸類(lèi)似物，并且 其中G是鳥(niǎo)苷或其類(lèi)似物，并且可以任選地被胞苷或其類(lèi)似物替代，條件是其在莖2中 的互補(bǔ)核苷酸胞苷被鳥(niǎo)苷替代； 環(huán)序列[Nch4(Uzt)NciJ 位于元件莖1和莖2之間，并且是3-5個(gè)核苷酸、更優(yōu)選4個(gè) 核苷酸的連續(xù)序列； 其中每個(gè)Nch4彼此獨(dú)立地是0-4個(gè)、優(yōu)選1-3個(gè)、更優(yōu)選1-2個(gè)N的連續(xù)序列，其中每 個(gè)N彼此獨(dú)立地選自下述核苷酸：所述核苷酸選自A，U，T，G和C或其核苷酸類(lèi)似物；并且 其中U/T表示尿苷或任選地胸苷； 莖2 [Np5CNtlJ 與元件莖1反向互補(bǔ)或部分反向互補(bǔ)，并且是5-7個(gè)核苷酸的連續(xù)序 列； 其中N3_5是3-5個(gè)、優(yōu)選4-5個(gè)、更優(yōu)選4個(gè)N的連續(xù)序列，其中每個(gè)N彼此獨(dú)立地選 自下述核苷酸：所述核苷酸選自A，U，T，G和C，或其核苷酸類(lèi)似物； 其中Nch2是0-2個(gè)、優(yōu)選0-1個(gè)、更優(yōu)選1個(gè)N的連續(xù)序列，其中每個(gè)N彼此獨(dú)立地選 自下述核苷酸：所述核苷酸選自A，U，T，G和C或其核苷酸類(lèi)似物；并且 其中C是胞苷或其類(lèi)似物，并且可以任選地被鳥(niǎo)苷或其類(lèi)似物替代，條件是其在莖1中 的互補(bǔ)核苷酸鳥(niǎo)苷被胞苷替代； 其中 莖1和莖2能夠彼此堿基配對(duì) 形成反向互補(bǔ)序列，其中堿基配對(duì)可以發(fā)生在莖1與莖2之間，或者 形成部分反向互補(bǔ)的序列，其中不完全的堿基配對(duì)可以發(fā)生在莖1和莖2之間。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸序列，其中所述至少一種組蛋白莖環(huán)選自下式（Ia)或 (IIa)中的至少一個(gè)：
式（Ia)(不具有莖邊界元件的莖環(huán)序列）
式（IIa)(具有莖邊界元件的莖環(huán)序列）。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述聚腺苷酸序列包含約25 至約400個(gè)腺苷核苷酸的序列，優(yōu)選約50至約400個(gè)腺苷核苷酸的序列，更優(yōu)選約50至約 300個(gè)腺苷核苷酸的序列，甚至更優(yōu)選約50至約250個(gè)腺苷核苷酸的序列，最優(yōu)選約60至 約250個(gè)腺苷核苷酸的序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述聚腺苷酸化信號(hào)包含共有 序列 NN (U/T) ANA，優(yōu)選 AA (U/T) AAA 或 A (U/T) (U/T) AAA。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的核酸序列，其中所述核酸序列是修飾的核酸， 特別是穩(wěn)定的核酸。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的核酸序列，其中，與野生型核酸的編碼區(qū)的G/C含量相比， 所述修飾的核酸的編碼至少一種肽或蛋白的編碼區(qū)的G/C含量增加，與野生型核酸所編碼 的氨基酸序列相比，所述修飾的核酸編碼的氨基酸序列優(yōu)選不被修飾。
16. 組合物或試劑盒或部件的試劑盒，其包含多種或多于一種核酸序列，所述核酸序列 每種為根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的核酸序列。
17. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒，其用作藥物。
18. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒，其用于治療傳染病。
19. 藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的 組合物和任選的藥用載體。
20. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒用于增加所述編碼的肽或蛋白的表達(dá)的應(yīng)用。
21. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的組合物或試劑盒或 部件的試劑盒在傳染病的治療中用于增加所述編碼的肽或蛋白的表達(dá)的應(yīng)用。
22. -種用于增加所編碼的肽或蛋白的表達(dá)的方法，所述方法包括下述步驟： a) 提供權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)定義的核酸序列或權(quán)利要求16定義的組合物， b) 將所述核酸序列或所述組合物應(yīng)用于或施用至不含細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞、組織或 生物體。
【文檔編號(hào)】C12N15/67GK104271746SQ201380008131
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月15日
【發(fā)明者】安德烈亞斯·特斯, 托馬斯·施拉克, 約亨·普羅布斯特 申請(qǐng)人:庫(kù)瑞瓦格有限責(zé)任公司