專利名稱：糖類抗原15-3(ca15-3)定量測定試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及測定血清的試劑盒及其測試方法，尤其是涉及測定血清中糖類抗原 15-3(CA15-3)含量的試劑盒及其測試方法。
背景技術：
CA15-3是一種多形態(tài)上皮糖蛋白，分子量400KD。血清CA15-3測定是檢測乳腺癌較重要的指標，30% 50%的乳腺癌患者的CA15-3血清水平明顯升高，而且CA15-3與組織學分級、腫瘤大小和腋窩淋巴結轉移的出現呈正相關，對乳腺癌的動態(tài)追蹤、療效判定與判斷復發(fā)轉移很有價值。CA15-3還可與其它腫瘤標志物一起檢測，用于相關腫瘤病例的輔助診斷。與CA125 —起檢測時，CA15-3可作為卵巢癌早期復發(fā)的指標；在肝、胃、肺、胰腺和結腸腫瘤患者中也可能升高。另外，在肝炎、肝硬化等非惡性疾病時也可見CA15-3升高的現象。臨床檢測CA15-3的方法有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(ELISA)、化學發(fā)光免疫分析(CLIA)和電化學發(fā)光免疫分析(ECLA)等。過去以放免為代表的糖類抗原15-3(CA15-;3)測定試劑盒受方法學的限制，其靈敏度和抗干擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場，目前應用較多的為酶聯免疫檢測技術和化學發(fā)光技術?；瘜W發(fā)光技術興起于上個世紀80年代是繼酶聯免疫技術和放免技術之后發(fā)展起來的新興技術，由于其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結合物穩(wěn)定，無放射性同位素損傷和污染等特點，在近些年得到了飛速發(fā)展。磁微粒分離酶聯免疫檢測技術是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術與酶聯免疫檢測技術相結合而建立的一種新型免疫檢測方法。傳統ELISA方法， 抗原、抗體的結合反應是在固相(ELISA板反應孔)表面進行的，而磁微粒分離酶聯免疫檢測方法，抗原、抗體的結合反應也在近似液相的條件下進行，因而反應快速、徹底。與傳統 ELISA相比具有靈敏度高，檢測用時少的優(yōu)點。

發(fā)明內容
本發(fā)明需要解決的技術問題在于提供一種糖類抗原15-3(CA15_3)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進行CA15-3檢測具有較高的靈敏度和特異性，和更短的獲得檢測結果的時間和更簡便的操作方式。本發(fā)明提供了一種糖類抗原15-3(CA15_3)的定量測定試劑盒，其包含的試劑有 CA15-3磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，標準品、質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。所述的磁分離試劑含有標記有抗CA15-3單克隆抗體的磁性微球。所述的酶反應物是含有堿性磷酸酶標記的抗CA15-3單克隆抗體。所述的反應增強劑是含有Tris的緩沖液。所述稀釋液是含有BSA溶液。所述的標準品及質控品是含有一定量的CA15-3抗原的BSA蛋白溶液。
所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的緩沖液。所述的底物溶液為酶促化學發(fā)光底物溶液。本發(fā)明糖類抗原15-3(CA15_3)的定量測定試劑盒的制備方法，包括下述步驟第一步磁分離試劑的制備過程一、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將ftOclin-300量取0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；3、調節(jié)PH計測量其PH值，調PH，控制PH在7. 95-8. 05之間；4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2_8°C冷庫貯存。二、磁分離試劑的制備過程1、將1. Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CA15-3單克隆抗體溶于PH9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；2、確定辛二酸二琥珀酰亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min ；3、將步驟2抗體溶液加入到Centricon-10濃縮管中然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘后吸取
上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重復操作3次； 將步驟4獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻后室溫反應4小時；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分鐘；7、每次加入1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒，上架，去
上清，重復操作3次；8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0. 05%的CA15-3磁分離試劑；磁珠保存液配方為0. 1% BSA, 0. 05%吐溫-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、將步驟9獲得的磁分離試劑用磁珠緩沖液按照1 1的比例混勻，即得本發(fā)明試劑盒中磁分離試劑。第二步酶反應物制備過程一、酶反應物稀釋液配制操作步驟，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. Og^Zncl2 0. 05g、Proclin_3000· 2ml 和 MgCl2O. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；2、調 PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范圍內；3、稱取BSA 3g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um濾器過濾即得。二、堿性磷酸酶ALP與抗CA15-3單克隆抗體的偶聯1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；2、向步驟1獲得濃縮液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；3、向步驟3獲得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CA15-3單克隆抗體，室溫避光輕輕攪拌2小時，再加入0. Iml的％ig/ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小時；4、將上述液裝入透析袋中，對0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C 1小時，然后 3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB緩沖鹽水透析5個小時去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶(ALP)與CA15-3單克隆抗體的偶聯物， 最后將收集到的堿性磷酸酶(ALP)與CA15-3單克隆抗體的偶聯物用上述酶反應物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應物。第三步反應增強劑配制步驟，配制IL 1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4. 23g于IL容器中；用移液器將ftx)clin-300量取 0. 2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解調PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 之間；3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾
器過濾ο第四步稀釋液配制步驟，配制IL 1、稱取 NaC19. Og 和 BSA 60g 于 IL 的容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 5ml加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾，貼好標簽于2_8°C冷庫貯存， 有效期為12個月。第五步CA15-3校準品和CA15-3質控品的配制CA15-3 校準品中 CA15-3 抗原的濃度分別為 0. 1，0. 3，1，2. 5，7. 5U/ml U/ml ； CA15-3質控品中CA15-3抗原的濃度分別為0. 3,2. 5U/ml ；第六步清洗濃縮液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 12. 54g 和 NaC1325. 6g 于 IL 容器中；2、稱取5g Tween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容
器中；
3、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后， 倒入上述IL容器中；4、用量筒量取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；5、調PH，控制其范圍在7. 35-7. 45之間；6、最后定容1000ml，完全溶解后用0. 2um濾器過濾即得。第七步底物溶液配制步驟，配制IL 1、稱取 TRIS 2. 35g、NaCl 6. 41g, Na2SO3 0. 002g 禾口 Proclin-3000. 2ml 于 IL 燒杯中；2、用量筒量取600ml純化水于IL燒杯中，充分攪拌，直至完全溶解，調PH，控制其范圍在7. 95-8. 05之間；3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至 1000ml，混勻后即得。本發(fā)明工作原理本品為夾心法化學發(fā)光免疫分析法與磁性微粒分離技術相結合的一種檢測方法。在標本、校準品和質控品中加入定量的酶標CA15-3單抗、結合著磁性微粒的CA15-3單克隆抗體及穩(wěn)定增強劑。37°C孵育后，磁性微粒上結合的CA15-3單克隆抗體與酶標單克隆抗體分別與CA15-3分子的不同表位結合，形成“三明治”結構。在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉淀的復合物，然后加入酶促化學發(fā)光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體回到基態(tài)時便發(fā)出光子，形成發(fā)光反應，即可使用發(fā)光儀檢測反應的發(fā)光強度，根據標準曲線即可算出樣品中的CA15-3含量。在檢測范圍內，發(fā)光強度與樣本中的CA15-3濃度成正比。本發(fā)明的主要創(chuàng)新之處在于1、本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，同時在出結果時間上相對現有技術縮短了至少10分鐘，并達到了較佳的性能參數。2、本發(fā)明公開了一種新的專用穩(wěn)定增強劑以及清洗液濃縮液，使得反應過程更加穩(wěn)定可靠，實驗數據靈敏有效，在提高產品性能的同時，并且大大降低了產品成本；3、試劑盒中的磁分離試劑，酶反應物，穩(wěn)定增強劑，標準品、質控品，清洗液濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
具體實施例方式實施例1、一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程配方見表1，以配制IL為例1、稱取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器將Proclin-300量取0. 2ml于少量純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；然后在IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；3、調節(jié)PH計測量其PH值；用HCl或NaOH調PH，測量其PH在7. 95-8. 05之間即符合要求；4、稱取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；5、最后定容至1000ml，測PH值，范圍在7. 95-8. 05之間即符合要求，用0. 2um濾器過濾；過濾完后貼好標簽于2_8°C冷庫貯存，磁珠緩沖液有效期為12個月；磁珠緩沖液表權利要求
1.一種糖類抗原CA15-3的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CA15-3磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，CA15-3標準品、CA15-3質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的CA15-3磁分離試劑含有標記有抗 CA15-3單克隆抗體的磁性微球；所述的酶反應物是含有堿性磷酸酶標記的抗CA15-3單克隆抗體；所述的反應增強劑是含有Tris的緩沖液；所述稀釋液是含有BSA的溶液；所述的標準品及質控品是含有一定量的CA15-3抗原的BSA溶液；所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和ftOclin-300的緩沖液；所述的底物溶液為酶促化學發(fā)光底物溶液。
3.如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得一、磁分離試劑的制備過程一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制IL1、稱取TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，稱取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、用移液器將ftx)Clin-300量取0.2ml于IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述 IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；3、調節(jié)PH,控制PH在7.95-8. 05之間；.4、稱取BSA3g倒入上述IL容器中；.5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、磁分離試劑的制備過程.1、將1.Omg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CA15-3單克隆抗體溶于PH9. 5的0. lmol/L PB緩沖液中至總體積為Iml ；.2、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫 90min ；.3、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下離心 30min 濃縮至 0. 5ml ；.4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1. 5ml PH9. 50. lmol/L PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應4小時；.5、加入0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘，然后加入 1. 5ml PH 7. 20. lmol/L PB 清洗已經標記的磁珠，混勻30秒；.6、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入玻璃瓶；.7、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1 1的體積比例混勻，即得權利要求 1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；二、酶反應物的制備過程一)、酶反應物稀釋液配制操作步驟，配制IL .1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2O. 05g、Proclin-3000. 2ml 和 MgCl2O. 05g 于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；2、調PH,控制PH在7.35-7. 45范圍內;3、稱取BSA3g倒入上述燒杯中；4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；二)、堿性磷酸酶ALP與抗CA15-3單克隆抗體的偶聯1、取IOmgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；2、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜，收集保留液；3、向步驟2獲得保留液中加入0.2M PH9. 5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CA15-3單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0. Iml的4mg/ml NaBH4溶液，混勻， 置4°C下2小時；4、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4PBS透析，4°C過夜，收集保留液；5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4°C1小時，然后3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0. 15M PH7. 4的 PBS 中；6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M PH7. 4的PB緩沖液透析5個小時去除銨離子，收集保留液后10，OOOrpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為 1 100的比例添加IM MgCl2溶液，即得堿性磷酸酶ALP與抗CA15-3單克隆抗體的偶聯物； 將收集到的堿性磷酸酶ALP與抗CA15-3單克隆抗體的偶聯物用上述步驟一)獲得的酶反應物稀釋液以1 1000的體積比混合均勻，即得酶反應物。三、反應增強劑的制備過程，配制IL1、取TRIS1. 56g 和 NaCl 4. 23g 于 IL 容器中，取 0. 2ml Proclin-300 于 IOml 純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；2、取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.35-7. 45之間；3、稱取Mak330.9g于上述IL容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0. 2um濾器過濾即得；四、稀釋液的制備過程，配制IL:1、稱取NaC19.Og和BSA 60g于IL的容器中；2、取0.5ml Proclin-300加IOml純化水溶解，倒入上述IL的容器中；3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；五、CA15-3校準品和CA15-3質控品的配制CA15-3 校準品中 CA15-3 抗原的濃度分別為 0. 1，0. 3，1，2. 5，7. 5U/ml U/ml ；CA15-3 質控品中CA15-3抗原的濃度分別為0. 3,2. 5U/ml ；六、清洗液濃縮液的制備過程，配制IL1、取TRIS 12. 54g 和 NaCl 325. 6g 于 IL 容器中；2、取5gTween-20于IOOml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述IL容器中；3、取0.2ml Proclin-300于盛有IOml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中；·4、取800ml純化水于上述IL容器中，充分攪拌，直至完全溶解；·5、調PH，控制其范圍在7.35-7. 45之間；·6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過濾即得； 七、底物溶液的制備過程，配制IL ·1、取TRIS 2. 35g、NaC16. 41g、Na2S030 . 00 2g 和 Proclin-3000. 2ml 于 IL 燒杯中；·2、取600ml純化水于IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.95-8. 05之間；·3、加入250mlLumi-Phos 480，用0. 2um濾器過濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。
4、如權利要求1-3任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法如下1)、加15μ 1 CA15-3標準品、CA15-3質控品、待測標本至對應試管底部；2)、加30μ 1酶反應物至每一試管中；3)、加30μ 1反應增強劑至每一試管中；4)、加30μ 1磁分離試劑至每一試管中；5)、用塑料薄膜覆蓋試管，多管混勻器輕輕振蕩試管架30s后，置37°C水浴30分鐘；6)、然后放至磁分離器上，確保每支試管都與分離器表面接觸，沉淀2分鐘，倒轉分離器倒出上清液；7)、清洗液濃縮液用純化水稀釋20倍后，加200μ 1稀釋后的清洗液至每一試管中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ；8)、加200μ 1底物溶液至試管中混勻3秒，發(fā)光檢測儀檢測。
5、如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，待測標本為高值HOOK樣本時，根據需要使用稀釋液對標本進行稀釋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種糖類抗原15-3(CA15-3)的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CA15-3磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，CA15-3標準品、CA15-3質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。本發(fā)明還公開了該試劑盒的制備方法。本發(fā)明試劑盒將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本發(fā)明試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，同時在出結果時間上相對現有技術縮短了至少10分鐘，并達到了較佳的性能參數，并且大大降低了產品成本。
文檔編號G01N33/543GK102288766SQ20111023405
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月16日 優(yōu)先權日2011年8月16日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:內蒙古科慧生物科技有限責任公司