專(zhuān)利名稱(chēng)：一種精漿果糖濃度檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種體外診斷用試劑盒及其檢測(cè)方法， 具體地說(shuō)是一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
精囊分泌的果糖是精子能量的主要來(lái)源，直接參與精子的獲能和受精。在男性不育等相關(guān)診斷與研究中，果糖濃度的測(cè)定一直占有很重要的地位。果糖的濃度可以反映精囊的分泌功能，先天性精囊缺如或患有精囊腺炎時(shí)，果糖的含量明顯降低；不完全射精或射精過(guò)頻時(shí)，果糖的含量亦降低。另外，果糖結(jié)合其它指標(biāo)如α-糖苷酶等的檢測(cè)，還可用于鑒別單純性輸精管阻塞所致的無(wú)精癥和輸精管、精囊發(fā)育不良引起的無(wú)精癥。研究表明，睪酮的水平影響精囊果糖的分泌，雄激素不足可造成果糖含量降低，因此果糖含量還能間接反映睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的功能。目前，檢測(cè)果糖的化學(xué)比色法主要有化合物顯色法和酶法；化合物顯色法主要有吲哚法和間苯二酚法，這兩者的試劑成本較低，但都需用到濃鹽酸，揮發(fā)性強(qiáng)、危險(xiǎn)性大、 對(duì)操作者和環(huán)境均有危害，而且樣本還需去蛋白處理、孵育溫度高達(dá)60°C以上，致使臨床使用很不方便；酶法主要有三種方法，其中一種需用到己糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，檢測(cè)靈敏度高，但是對(duì)這些酶的純度要求很高，不能有任何污染，另外己糖激酶的底物特異性不是很高，葡萄糖，山梨糖、麥芽糖、半乳糖等都可干擾該反應(yīng)，造成檢測(cè)結(jié)果偏高；另外一種涉及到山梨醇脫氫酶，反應(yīng)只有一步，但是該酶可將山梨糖可逆地轉(zhuǎn)化成果糖，樣品還需要離心和加熱等預(yù)處理步驟；最后一種也就是本法所涉及的果糖脫氫酶，該酶底物特異性強(qiáng)，同時(shí)可避免樣品的離心、加熱或去蛋白等步驟，反應(yīng)速度快，結(jié)果準(zhǔn)確性高。但是有一點(diǎn)，以上所有的方法均為手工或半自動(dòng)操作，加樣程序多，所用試劑量大，試劑成本高，試劑和樣品混勻一定的時(shí)間后，通過(guò)分光光度計(jì)逐一比色測(cè)定，然后根據(jù)公式計(jì)算出結(jié)果，同一標(biāo)本一次只能檢測(cè)一項(xiàng)，耗費(fèi)了大量的時(shí)間和人力，而且人為操作誤差也比較大?，F(xiàn)在，臨床生化檢驗(yàn)基本上都實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化分析。全自動(dòng)生化儀就是將原始手工操作過(guò)程中的取樣、混勻、溫育、檢測(cè)、結(jié)果計(jì)算、判斷、顯示和打印結(jié)果及清洗等步驟全部或者部分自動(dòng)運(yùn)行，由于其測(cè)量速度快、準(zhǔn)確性高、消耗試劑量小，現(xiàn)已在各級(jí)醫(yī)院、防疫站、計(jì)劃生育服務(wù)站得到了廣泛的使用，配合使用可大大提高常規(guī)生化檢驗(yàn)的效率及收益。 遺憾的是，截止到目前，無(wú)論是國(guó)外還是國(guó)內(nèi)，對(duì)于精漿果糖項(xiàng)目的檢測(cè)，除了早期的科研成果外，尚沒(méi)有一種可與全自動(dòng)生化儀相配套的、商品化的檢測(cè)試劑盒問(wèn)世，因此，建立一種與全自動(dòng)生化儀相配套使用的精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法就顯得尤為迫切和重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，填補(bǔ)市場(chǎng)上的空缺，提供一種與全自動(dòng)生化儀相配套使用的精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供所述精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)精漿果糖濃度中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下的技術(shù)方案一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，其中，1) Rl試劑包括以下含量的組份ρΗ4· 5-5. 0 緩沖液 150-300 μ mol/L ；顯色劑50-70 μ mol/L;電子受體285-300 μ mol/L ；防腐劑0.01-0.1%;2)R2試劑包括以下含量的組份ρΗ4· 5-5. 0 緩沖液 150-300 μ mol/L ；果糖脫氫酶2. 5_6.0U/ml;防腐劑0.01-0.1%;3)果糖標(biāo)準(zhǔn)液包括以下含量的組份ρΗ4· 5-5. 0 緩沖液 150-300 μ mol/L ；果糖20_60mmol/L ；防腐劑0.01-0.1%;其中所述緩沖液為pH4. 5-5. 0的McIlvaine' s緩沖液、Walpole' s緩沖液或磷酸鉀緩沖液；所述顯色劑為噻唑藍(lán)、碘硝基四唑紫或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽； 所述電子受體為吩嗪二甲酯硫酸鹽或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽；所述防腐劑為疊氮鈉、慶大霉素或ProCl in系列防腐劑中的任意一種。精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)精漿果糖濃度中的應(yīng)用。精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)精漿果糖濃度中的應(yīng)用，包括以下步驟1)樣品制備新鮮精液液化后通過(guò)3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液即是；2)在全自動(dòng)生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測(cè)項(xiàng)目Fru ；樣品試劑比1 30;試劑比R1 R2 = 1 4 ；主波長(zhǎng)560-590nm ；檢測(cè)方法速率法；定標(biāo)方法單點(diǎn)定標(biāo)或兩點(diǎn)定標(biāo)；反應(yīng)方向上升；反應(yīng)時(shí)間180-270秒；檢測(cè)時(shí)間90-120秒；3)定標(biāo)操作用果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，儀器會(huì)根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度及其每分鐘吸光度變化率，得出一個(gè)果糖濃度和吸光度變化率之間的關(guān)系式單點(diǎn)定標(biāo)Y = AX ；或兩點(diǎn)定標(biāo)Y = ΑΧ+Β,
其中，單點(diǎn)定標(biāo)的常數(shù)A或兩點(diǎn)定標(biāo)的常數(shù)A、B在定標(biāo)結(jié)束后自動(dòng)給出，Y代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，X代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的每分鐘吸光度變化率；4)樣本檢測(cè)將1)中制備好的樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動(dòng)生化儀的相應(yīng)位置上，輸入樣本的檢測(cè)信息后，開(kāi)始檢測(cè)；測(cè)試結(jié)束后，儀器根據(jù)定標(biāo)得出的濃度和吸光度變化率之間的關(guān)系式自動(dòng)計(jì)算出樣本中果糖的濃度。本發(fā)明提供的一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液；所述Rl試劑為含顯色劑、電子受體和防腐劑的PH4. 5-5. 0的緩沖溶液；所述R2試劑為含果糖脫氫酶和防腐劑的PH4. 5-5. 0的緩沖溶液；所述果糖標(biāo)準(zhǔn)液為含果糖和防腐劑的 ρΗ4· 5-5. 0緩沖溶液。所述Rl試劑中，pH4. 5-5. 0的緩沖液用于為反應(yīng)提供適宜的酸性反應(yīng)條件；所述 Il色齊U為1SP坐藍(lán)(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)，含量為50-70 μ mol/L，該范圍是與果糖反應(yīng)的有效結(jié)合量，在反應(yīng)中起生成有色物質(zhì)的作用；另外，顯色劑還可以是碘硝基四唑紫(Iodonitrotetrazolium purple, INT)、鐵氰化鉀(Potassium ferricynate)；電子受體為吩嗪二甲酯硫酸鹽(Phenazine Methosulfate, PMS)，含量為285-300 μ mol/L，該范圍是果糖脫氫酶的有效電子傳遞量，用作果糖脫氫酶催化反應(yīng)中的電子受體；另外，電子受體還可以是1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酉旨鹽(l-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate, 1-methoxyPMS) 所述R2試劑中，果糖脫氫酶(Fructose Dehydrogenase, FDH)的含量為 2. 5-6. OU/ ml，低于果糖脫氫酶的下限2.5U/ml時(shí)，每分鐘吸光度的變化率很小，吸光度變化率的微量波動(dòng)即會(huì)導(dǎo)致結(jié)果的很大變動(dòng)，考慮到試劑成本以及試劑發(fā)揮作用的最優(yōu)性，選擇果糖脫氫酶的上限為6. 0U/ml時(shí)，在2. 5-6. 0U/ml范圍內(nèi)，果糖脫氫酶的濃度越高，反應(yīng)速度越快， 每分鐘吸光度的變化率也越大；所述防腐劑為疊氮鈉，含量為0.01-0. 1%，該范圍在有效殺菌的同時(shí)不會(huì)對(duì)反應(yīng)起任何副作用，可延長(zhǎng)試劑盒的有效期；還可以是其它具有防腐作用的慶大霉素和 ftOClin系列防腐劑中的任意一種等，但不可以是硫柳汞，其對(duì)果糖脫氫酶有一定的抑制作用。上述的檢測(cè)方法，所述步驟1)中，所制備的精漿樣本可于分離當(dāng)天檢測(cè)，也可于-20°C以下凍存?zhèn)溆?，至少可保?周以上，但應(yīng)避免反復(fù)凍融；所述步驟2)中，樣本試劑比應(yīng)根據(jù)全自動(dòng)生化儀的參數(shù)而定，應(yīng)考慮到儀器的最小加樣量，比色皿的反應(yīng)液體積范圍等；所述步驟幻中，定標(biāo)模式可以自行選擇，可以選用單點(diǎn)定標(biāo)，即單用一個(gè)果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)；也可以選用兩點(diǎn)定標(biāo)，即用蒸餾水作為一個(gè)濃度點(diǎn)，果糖標(biāo)準(zhǔn)液作為另外一個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行定標(biāo)；所述步驟4)中，當(dāng)樣本中果糖的濃度過(guò)高，超出試劑盒的線性范圍時(shí)，應(yīng)用生理鹽水稀釋后重測(cè)，結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即可；本發(fā)明的檢測(cè)方法是速率法，所述的Rl試劑、R2試劑為含顯色劑MTT、電子受體 PMS、果糖脫氫酶FDH和防腐劑的PH4. 5-5. 0的Mcllvaine' s緩沖溶液，檢測(cè)原理是，
D-果糖+MTT+PMS果糖脫_ > 5-酮基-D-果糖+MTT甲臢果糖脫氫酶催化樣本中的果糖，在MTT和PMS的共同作用下，反應(yīng)生成有色復(fù)合物MTT甲臢，該復(fù)合物在560-590nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過(guò)監(jiān)測(cè)其在560-590nm波長(zhǎng)處的每分鐘吸光度變化率，進(jìn)而檢測(cè)出樣本中的果糖濃度。與現(xiàn)有技術(shù)相比，突出的技術(shù)效果在于1、本試劑盒采用速率法檢測(cè)精漿樣本中果糖的濃度，僅采用2種液體試劑，與手工檢測(cè)的終點(diǎn)法相比，所用試劑的種類(lèi)和用量都明顯減少，避開(kāi)了具有強(qiáng)烈腐蝕性和揮發(fā)性的濃鹽酸的使用，反應(yīng)溫度也不需要再達(dá)到60°C以上；2、采用本試劑盒及檢測(cè)方法，樣本制備好后不需再去蛋白，也不需要預(yù)稀釋?zhuān)瑱z測(cè)過(guò)程中不再需要單獨(dú)做空白管、標(biāo)準(zhǔn)管，簡(jiǎn)化了操作步驟，降低了人為誤差；另外，與現(xiàn)有的己糖激酶法檢測(cè)試劑盒相比，果糖脫氫酶對(duì)底物果糖的專(zhuān)一性催化作用，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和特異；3、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了從手工或半自動(dòng)向全自動(dòng)檢測(cè)方法的轉(zhuǎn)變，填補(bǔ)了市場(chǎng)上的空缺，采用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行自動(dòng)化、規(guī)模化的檢測(cè)，釋放了大量的人力，節(jié)約了大量的耗材， 對(duì)反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)過(guò)程的準(zhǔn)確控制和監(jiān)測(cè)，顯著提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；4、采用本發(fā)明可以在檢測(cè)同一份樣本果糖濃度的同時(shí)，還可以與全自動(dòng)生化儀相配套的精漿Y-L-谷氨?；D(zhuǎn)肽酶、α-糖苷酶、果糖試劑盒聯(lián)合使用，并同時(shí)檢測(cè)這些項(xiàng)目，檢測(cè)結(jié)束后，可以以報(bào)告的形式打印出同一份樣本所測(cè)項(xiàng)目的所有結(jié)果，可滿足醫(yī)院男性不育相關(guān)科室、人類(lèi)精子庫(kù)、計(jì)劃生育研究所等機(jī)構(gòu)對(duì)精液質(zhì)量、精子篩選的需要，以及對(duì)于男性不育癥的輔助診斷等，大大提高了精液常規(guī)生化分析的效率和收益，非常適于常規(guī)檢測(cè)和推廣。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好的理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1本實(shí)施例中的一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別按以下成分和用量配制1) Rl 試劑:pH4. 5McIlvaine' s 緩沖液噻唑藍(lán)(MTT)吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)疊氮鈉2) R2 試劑pH4. 5McIlvaine' s 緩沖液果糖脫氫酶(FDH)疊氮鈉3)果糖標(biāo)準(zhǔn)液pH4. 5McIlvaine' s 緩沖液果糖
150ymol/L ； 54 μ mol/L ； 294μ mol/L ； 0. 1% ；
150 μ mol/L ； 2. 5U/ml ； 0. 08% ；
150 μ mol/L ； 20mmol/L ；
慶大霉素0.05%;上述試劑全部溶解后，分裝入瓶，制成液體雙試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，于2_8°C避光保存?zhèn)溆谩?shí)施例2本實(shí)施例中的一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，分別按以下成分和用量配制DRl試劑
pH4. 8McIIvaine‘s緩沖液200ymol/L ；
碘硝基四唑紫60 μ mol/L ；
1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽 285 μ mol/L;
慶大霉素0. 1% ；
2) R2試劑
pH4. 8McIIvaine‘s緩沖液200 μ mol/L ；
果糖脫氫酶4. OU/ml ；
疊氮鈉0. 05% ；
3)果糖標(biāo)準(zhǔn)液
pH4. 8McIIvaine‘S緩沖液200 μ mol/L ；
果糖40mmol/L ；
ProClinl500. 02% ；
上述試劑全部溶解后，分裝入瓶，制成液體雙試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，于2-8°C避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例3
本實(shí)施例中的一種精漿果糖:濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)
準(zhǔn)液，分別按以下成分和用量配制DRl試劑
pH5. Offalpole'S緩沖液300 μ mol/L ；
碘硝基四唑紫70 μ mol/L ；
1-甲氧基-5-甲1基酚嗪硫酸甲酯鹽300 μ mol/L ；
ProClinl500. 05% ；
2) R2試劑
pH5. Offalpole'S緩沖液300 μ mol/L ；
果糖脫氫酶(FDH)6. OU/ml ；
ProClin3000. 02% ；
3)果糖標(biāo)準(zhǔn)液
pH5. OMcIlvaine‘S緩沖液300 μ mol/L ；
果糖60mmol/L ；
疊氮鈉0. 1% ；
上述試劑全部溶解后，分裝入瓶，制成液體雙試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，于2-8°C避光保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例4利用實(shí)施例1中的試劑盒檢測(cè)精漿中果糖濃度的方法，具體操作步驟如下1)樣品制備新鮮精液液化后通過(guò)5000rpm離心lOmin，所獲得的上清液即是；2)在Olympus AU400全自動(dòng)生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測(cè)項(xiàng)目Fru;樣品量10μ1;Rl試劑和R2試劑用量比為4 1 ；Rl試劑量:240 μ 1 ；R2試劑量:60 μ 1 ；檢測(cè)方法速率法；定標(biāo)模式ΑΒ (單點(diǎn)定標(biāo))；主波長(zhǎng)570nm;反應(yīng)方向上升；主讀數(shù)點(diǎn)1:20;主讀數(shù)點(diǎn)2:25;3)定標(biāo)操作:用20mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，儀器會(huì)根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度和每分鐘吸光度的變化率，得出一個(gè)果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式Y(jié) = AX ；其中，常數(shù)A 在定標(biāo)結(jié)束后自動(dòng)給出，Y代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，X代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的每分鐘吸光度變化率；例如，用20mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，測(cè)得的每分鐘吸光度變化率為0. 0068， 則通過(guò)定標(biāo)關(guān)系式Y(jié) = AX，儀器自動(dòng)計(jì)算出A = 2941. 18，也即，由定標(biāo)操作得出的果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式為Y = 2941. 18X ；4)樣本檢測(cè)將1)中制備好的樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動(dòng)生化儀的相應(yīng)位置上，輸入樣本的檢測(cè)信息后，開(kāi)始檢測(cè)。測(cè)試結(jié)束后，儀器根據(jù)定標(biāo)關(guān)系式自動(dòng)計(jì)算出樣本中果糖的濃度，即果糖濃度Y(mmol/L) = 2941. 18X，其中，X代表樣本的每分鐘吸光度變化率，在全自動(dòng)生化儀上自動(dòng)測(cè)定給出。例如，全自動(dòng)生化儀測(cè)得某份精漿中的果糖的每分鐘吸光度變化率為0. 0096，則該份精漿中果糖濃度 Y = 2941. 18X0. 0096 = 28. 24mmol/L實(shí)施例5利用實(shí)施例2中的試劑盒檢測(cè)精漿中果糖濃度的方法，具體操作步驟如下1)樣品制備新鮮精液液化后通過(guò)3000rpm離心20min，所獲得的上清液即是；2)在Olympus AU640全自動(dòng)生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測(cè)項(xiàng)目Fru;樣品量8μ1;Rl試劑和R2試劑用量比為4 1 ；Rl試劑量:192 μ 1 ；R2試劑量:48 μ 1 ；檢測(cè)方法速率法；定標(biāo)模式AA (兩點(diǎn)定標(biāo))；
主波長(zhǎng)570nm;反應(yīng)方向上升；主讀數(shù)點(diǎn)1:18;主讀數(shù)點(diǎn)2:24;3)定標(biāo)操作用蒸餾水Ommol/L和40mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，儀器會(huì)根據(jù)各自的濃度和吸光度值，得出一個(gè)果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式Y(jié) = AX+B ；其中，常數(shù)A、B 在定標(biāo)結(jié)束后自動(dòng)給出，Y代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液中果糖的濃度，X代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的每分鐘吸光
度變化率。例如，用蒸餾水和果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)操作后，測(cè)定的每分鐘吸光度變化率分別為0. 0003和0. 0098，則通過(guò)定標(biāo)關(guān)系式Y(jié) = AX+B,儀器自動(dòng)計(jì)算出A = 4210. 5，B ="I.沈32，也即，由定標(biāo)操作得出的果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式為Y = 4210. 5X-1. 2632。4)樣本檢測(cè)將1)中制備好的樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動(dòng)生化儀的相應(yīng)位置上，輸入樣本的檢測(cè)信息后，開(kāi)始檢測(cè)。測(cè)試結(jié)束后，儀器根據(jù)定標(biāo)關(guān)系式自動(dòng)計(jì)算出樣本中果糖的濃度，即果糖濃度Y(mmol/L) = 4210. 5X-1. 2632，其中，X為樣本的每分鐘吸光度變化率，在全自動(dòng)生化儀上自動(dòng)測(cè)定給出；例如，某份精漿樣本用生理鹽水稀釋2倍后，全自動(dòng)生化儀測(cè)得的果糖的每分鐘吸光度變化率為0.0105，則該份精漿中果糖的濃度Y = 2X (4210.5X0.0105-1.2632)= 85.9mmol/L。實(shí)施例6利用實(shí)施例3中的試劑盒檢測(cè)精漿中果糖濃度的方法，具體操作步驟如下1)樣品制備新鮮精液液化后通過(guò)4000rpm離心15min，所獲得的上清液即是；2)在勞拉!^aith-IOOO全自動(dòng)生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下檢測(cè)項(xiàng)目Fru;樣品量11μ1;Rl試劑和R2試劑用量比為4 1 ；Rl試劑量:264 μ 1 ； R2試劑量:66μ 1 ；檢測(cè)方法速率法；定標(biāo)模式單點(diǎn)定標(biāo)；主波長(zhǎng)578nm;反應(yīng)方向上升；主讀數(shù)點(diǎn)1:25;主讀數(shù)點(diǎn)2:30;3)定標(biāo)操作用60mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，儀器會(huì)根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度和每分鐘吸光度的變化率，得出一個(gè)果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式Y(jié) = AX ；其中，常數(shù)A 在定標(biāo)結(jié)束后自動(dòng)給出，Y代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，X代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的每分鐘吸光度變化率；例如，用60mmol/L果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，測(cè)定的每分鐘吸光度變化率為0. 0155， 則通過(guò)定標(biāo)關(guān)系式Y(jié) = AX，儀器自動(dòng)計(jì)算出A = 3870. 97，也即，由定標(biāo)操作得出的果糖濃度和每分鐘吸光度變化率之間的關(guān)系式為Y = 3870. 97X ；4)樣本檢測(cè)將1)中制備好的樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動(dòng)生化儀的相應(yīng)位置上，輸入樣本的檢測(cè)信息后，開(kāi)始檢測(cè)。測(cè)試結(jié)束后，儀器根據(jù)定標(biāo)關(guān)系式自動(dòng)計(jì)算出樣本中果糖的濃度，即果糖濃度Y (mmol/L) = 3870. 97X，其中，X為樣本的每分鐘吸光度變化率，在全自動(dòng)生化儀上自動(dòng)測(cè)定給出。例如，全自動(dòng)生化儀測(cè)得某份精漿中的果糖的每分鐘吸光度變化率為0. 0184，則該份精漿中果糖濃度 Y = 3870. 97X0. 0184 = 71. 23mmol/L實(shí)施例7在實(shí)施例1和實(shí)施例4的基礎(chǔ)上進(jìn)行批內(nèi)和批間精密度的檢測(cè)(即本發(fā)明的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性)選擇果糖濃度低、高值的混合精漿樣本各1份，準(zhǔn)備5個(gè)批次的檢測(cè)試劑盒，每個(gè)批次試劑盒測(cè)同一個(gè)濃度精漿樣本8次，共有40個(gè)數(shù)據(jù)，從5個(gè)批次中每一樣本重復(fù)測(cè)定8 次的結(jié)果算出批內(nèi)精密度，從所有40個(gè)結(jié)果計(jì)算出批間精密度，結(jié)果均以變異系數(shù)的百分?jǐn)?shù)即CV%表示。其中，CV%=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值X100%，該系數(shù)越小，表明同一份樣本重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的離散程度越小，即檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性越好。結(jié)果與手工或半自動(dòng)檢測(cè)的結(jié)果比較見(jiàn)表1，說(shuō)明使用該試劑盒檢測(cè)精漿果糖濃度的方法重復(fù)性好。表1手工、半自動(dòng)和全自動(dòng)檢測(cè)的精密度結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括Rl試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，其中，DRl試劑包括以下含量的組份 pH4. 5-5. 0 緩沖液150-300 μ mol/L ；顯色劑50-70 μ mol/L;電子受體285-300 μ mol/L ；防腐劑0.01-0.1%;2)R2試劑包括以下含量的組份pH4. 5-5. 0 緩沖液150-300 μ mol/L ；果糖脫氫酶2. 5-6. OU/ml ；防腐劑0.01-0.1%;3)果糖標(biāo)準(zhǔn)液包括以下含量的組份pH4. 5-5. 0 緩沖液150-300 μ mol/L ；果糖20-60mmol/L ；防腐劑0.01-0.1%;其中所述緩沖液為PH4. 5-5. 0的McIlvaine' s緩沖液、Walpole' s緩沖液或磷酸鉀緩沖液；所述顯色劑為噻唑藍(lán)、碘硝基四唑紫或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽； 所述電子受體為吩嗪二甲酯硫酸鹽或1-甲氧基-5-甲基酚嗪硫酸甲酯鹽； 所述防腐劑為疊氮鈉、慶大霉素或ftx)Clin系列防腐劑中的任意一種。
2.權(quán)利要求1所述的精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)精漿果糖濃度中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟1)樣品制備新鮮精液液化后通過(guò)3000 5000rpm離心10 20min，所獲得的上清液即是；2)在全自動(dòng)生化儀的操作軟件上輸入基本參數(shù)如下 檢測(cè)項(xiàng)目=Fru ；樣品試劑比1 30; 試劑比R1 R2 = 1 4 ； 主波長(zhǎng)560-590nm ； 檢測(cè)方法速率法； 定標(biāo)方法單點(diǎn)定標(biāo)或兩點(diǎn)定標(biāo)； 反應(yīng)方向上升； 反應(yīng)時(shí)間180-270秒； 檢測(cè)時(shí)間:90-120秒；3)定標(biāo)操作用果糖標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行定標(biāo)，儀器會(huì)根據(jù)果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度及其每分鐘吸光度變化率，得出一個(gè)果糖濃度和吸光度變化率之間的關(guān)系式單點(diǎn)定標(biāo)=Y = AX ；或兩點(diǎn)定標(biāo)=Y = AX+B,其中，單點(diǎn)定標(biāo)的常數(shù)A或兩點(diǎn)定標(biāo)的常數(shù)A、B在定標(biāo)結(jié)束后自動(dòng)給出，Y代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，X代表果糖標(biāo)準(zhǔn)液的每分鐘吸光度變化率；4)樣本檢測(cè)將1)中制備好的樣本和Rl試劑、R2試劑放在全自動(dòng)生化儀的相應(yīng)位置上，輸入樣本的檢測(cè)信息后，開(kāi)始檢測(cè)；測(cè)試結(jié)束后，儀器根據(jù)定標(biāo)得出的濃度和吸光度變化率之間的關(guān)系式自動(dòng)計(jì)算出樣本中果糖的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒，包括R1試劑、R2試劑和果糖標(biāo)準(zhǔn)液，其中，R1試劑包括pH4.5-5.0緩沖液150-300μmol/L；顯色劑50-70μmol/L；電子受體285-300μmol/L；防腐劑0.01-0.1％；R2試劑包括以下含量的組份pH4.5-5.0緩沖液150-300μmol/L；果糖脫氫酶2.5-6.0U/ml；防腐劑0.01-0.1％；果糖標(biāo)準(zhǔn)液包括以下含量的組份pH4.5-5.0緩沖液150-300μmol/L；果糖20-60mmol/L；防腐劑0.01-0.1％。本發(fā)明還公開(kāi)了精漿果糖濃度定量檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)精漿果糖濃度中的應(yīng)用。本發(fā)明的樣本不需去蛋白，采用速率法檢測(cè)，避開(kāi)了濃鹽酸的使用，反應(yīng)溫度也不需達(dá)到60℃以上，采用對(duì)果糖有專(zhuān)一性催化作用的酶，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確和特異，使用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行自動(dòng)化、規(guī)?；臋z測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102323230SQ20111023367
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月16日
發(fā)明者陸金春, 陳曉慧, 高建 申請(qǐng)人:南京欣迪生物藥業(yè)工程有限責(zé)任公司