一種α-淀粉酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種α-淀粉酶高產(chǎn)菌及其篩選方法和應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明菌種為一株嗜熱脂肪芽孢桿菌WSH13-17(Geobacillus?stearothermophilus)WSH13-17，于2013年1月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M2013013，是從淀粉廠土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)酶活測定，比較α-淀粉酶活性大小而得到。經(jīng)液體深層發(fā)酵可得α-淀粉酶，酶活600U/mL。該α-淀粉酶可用于味精、啤酒、酒精等食品發(fā)酵行業(yè)。
【專利說明】一種Cl -淀粉酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)淀粉酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種a -淀粉酶菌株及其應(yīng)用，特別是一株高產(chǎn)a _淀粉酶的嗜熱脂肪芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]a -淀粉酶又稱為液化型淀粉酶。它能從淀粉分子內(nèi)部任意切開a _1，4鍵，產(chǎn)生分子量較小的糊精。a -淀粉酶具有相當(dāng)大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，廣泛用于酒精、有機(jī)酸、氨基酸及紡織等行業(yè)。目前工業(yè)生產(chǎn)中，a-淀粉酶一般采用微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，其中以地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌為主。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種a-淀粉酶高產(chǎn)菌株，于2013年I月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2013013，系從淀粉廠土壤中分離得到的一株嗜熱脂肪芽抱桿菌 WSH13-17 (Geobacillus stearothermophilus) WSH13-17。
[0004]嗜熱脂肪芽孢桿菌的篩選方法是從淀粉廠土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)酶活測定，比較α -淀粉酶活性大小而得到。
[0005]一個(gè)α -淀粉酶酶活單位(IU)定義(U/mL) =ImL酶液在ρΗ6.0，溫度70°C，Imin液化可溶性淀粉Img所需的酶量稱為一個(gè)酶活力單位。
[0006]測定方法:準(zhǔn)確吸取2mL2%可溶性淀粉溶液，置于IOmL比色管中，加0.5mLpH6.0磷酸緩沖溶液，搖勻，于70°C水浴預(yù)熱5min，準(zhǔn)確加入100 μ L稀釋酶液(酶活力為每毫升60~65單位為宜)，立即計(jì)時(shí)，搖勻，于70°C水浴準(zhǔn)確保溫酶解反應(yīng)5min，立即取出ImL反應(yīng)液，置于含有0.5mL0.lmol/L鹽酸溶液中終止酶解反應(yīng)，加入5mL稀碘液，搖勻。以稀碘液為空白，Icm比色皿，660nm波長下測吸光度(A)。根據(jù)吸光度查表(表格詳見GB8275-2009)，求得測試酶液的濃度。
[0007]α -淀粉酶酶活計(jì)算公式:X=cXnX 16.67
[0008]式中:
[0009]X—樣品的酶活力，U/mL ；
[0010]c一測試酶樣的濃度，U/mL ；
[0011]η—樣品的稀釋倍數(shù)；
[0012]16.67—根據(jù)酶活力定義計(jì)算的換算系數(shù)。
[0013]原碘液:稱取11.0g碘和22.0g碘化鉀，用少量水使碘完全溶解，定容至500mL，貯
存于棕色瓶中。
[0014]稀碘液:吸取原碘液2.0OmL,加20`.0g碘化鉀用水溶解并定容至500mL，貯存于棕
色瓶中。
[0015]可溶性淀粉溶液(20g/L):稱取2.0OOg可溶性淀粉(以絕干計(jì))于燒杯中，用少量水調(diào)成漿狀物，邊攪拌邊緩慢加入70mL沸水中，然后用水分次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液倒入其中，攪拌并加熱至完全透明，冷卻定容至lOOmL。溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。[0016]磷酸緩沖液(pH=6.0):稱取45.23g十二水和磷酸氫二鈉和8.07g 一水檸檬酸，用水溶解并定容至1000mL。用pH計(jì)校準(zhǔn)后使用。
[0017]本發(fā)明解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種采用嗜熱脂肪芽孢桿菌WSH13-17 (Geobacillus stearothermophi lus) WSH13-17 為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得α-淀粉酶。
[0018]平板分離培養(yǎng)基(g/L):
[0019]蛋白胨10，可溶性淀粉10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂粉20，曲利本藍(lán)0.1，pH7.0。55°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d，測量D/d(水解圈直徑/菌落直徑)值，挑選值較大的進(jìn)行初篩。
[0020]種子培養(yǎng)基(g/L)及培養(yǎng)條件:
[0021]蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH7.0，55°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時(shí)間為20-24小時(shí)。
[0022]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)及發(fā)酵條件:
[0023]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間44-48小時(shí)。
[0024]微量元素液(g/L):
[0025]ZnCl22, FeS042, H3BO30.065, MoNa2O40.135。
[0026]本發(fā)明的有益效果:提出了一種α-淀粉酶高產(chǎn)菌，用該菌株經(jīng)液體深層發(fā)酵可制備α -淀粉酶，酶活達(dá)到600U/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施案例I
[0028]從淀粉廠附近土壤，按“五點(diǎn)取樣法”采取土樣10份，從中分離菌株。將少量樣品，放入烘箱80°C熱處理20min，后稱取樣品5g加入裝有45mL無菌水的小三角瓶中，靜置lOmin，上清液取0.1mL梯度稀釋(10_5，10_4，10_3)涂布于分離篩選平板上，55°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，測量D/d(水解圈直徑/菌落直徑)值，挑選值較大的進(jìn)行初篩。挑取單菌落進(jìn)行3-4次平板劃線。之后將篩選得到的幾株菌純化后在55°C進(jìn)行液體培養(yǎng)。培養(yǎng)44-48h，取培養(yǎng)液離心后收集上清進(jìn)行酶活測定，選取酶活高的菌株進(jìn)行劃線傳代培養(yǎng)，最終得到一株產(chǎn)酶穩(wěn)定且有較高酶活的α-淀粉酶產(chǎn)生菌株。純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，4 V保藏，保藏編號為CCTCCN0: Μ2013013，保藏機(jī)構(gòu)為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0029]平板分離培養(yǎng)基(g/L):
[0030]蛋白胨10，可溶性淀粉10，酵母粉5，氯化鈉10，瓊脂粉20，曲利本藍(lán)0.1，ρΗ7.0。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):
[0032]可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，pH7.0，55°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間44-48小時(shí)。
[0033]微量元素液(g/L):
[0034]ZnCl22，F(xiàn)eS042，H3BO30.065，MoNa2O40.135。
[0035]實(shí)施案例2[0036]從斜面上刮取一環(huán)菌種，置于裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)。條件為培養(yǎng)時(shí)間20-24h，溫度55°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。再以5%接種量接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1OOmL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。條件為培養(yǎng)時(shí)間44-48h，溫度55°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。即可得到酶活600U/mL的發(fā)酵液。
[0037]種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH7.0。
[0038]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂
0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，ρΗ7.0。
【權(quán)利要求】
1.一種α-淀粉酶高產(chǎn)菌株，分類命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌WSH13-17 (Geobacillusstearothermophilus)WSH13-17，于2013年I月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC N0:M2013013o
2.權(quán)利要求1所述α-淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選方法，其特征是從淀粉廠土壤中經(jīng)平板菌落特征初篩，采用一級發(fā)酵逐一搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)酶活測定，比較α -淀粉酶活性大小而得到。
3.應(yīng)用權(quán)利要求1所述α-淀粉酶高產(chǎn)菌株生產(chǎn)α-淀粉酶的方法，其特征是采用嗜熱脂肪芽孢桿菌WSH13-17 (G.stearothermophilus) WSH13-17為出發(fā)菌株，經(jīng)種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵制得α-淀粉酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述種子培養(yǎng)中采用的種子培養(yǎng)基成分為(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10，pH7.0 ;培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)時(shí)間為20-24小時(shí)，溫度55°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述液體深層發(fā)酵中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(g/L): 可溶性淀粉10，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸銨2.5，七水硫酸鎂0.3，無水氯化鈣0.2，ImL(v/v)微量元素液，發(fā)酵條件為:pH7.0，55°C，搖瓶轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述微量元素液成分為(g/L):
ZnCl22, FeS042, H3BO30.065, MoNa2O40.135。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其特征在于所述α-淀粉酶在味精、啤酒、酒精生產(chǎn)加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/28GK103667095SQ201310076922
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月12日
【發(fā)明者】吳敬, 李祝, 吳丹, 陳晟, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)