一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法。本發(fā)明將干細(xì)胞包埋在含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中，添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，通過改變制備微膠珠時(shí)海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質(zhì)量比調(diào)控干細(xì)胞體外定向分化，并且在分化結(jié)束后，可利用檸檬酸鈉溶液溶解海藻酸鈣微膠珠，進(jìn)而得到純凈的分化細(xì)胞。本發(fā)明操作簡單，成本低，含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠可以模擬體內(nèi)三維細(xì)胞外基質(zhì)，為干細(xì)胞提供近似體內(nèi)的三維定向分化微環(huán)境，從而提高干細(xì)胞的定向分化效率和生物學(xué)功能，本發(fā)明將在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。
【專利說明】一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，是一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞由于具有自我更新和分化的能力，是損傷組織修復(fù)的理想種子細(xì)胞。但是當(dāng)干細(xì)胞植入體內(nèi)受損部位后，干細(xì)胞除了分化為所需要的組織細(xì)胞，參與組織修復(fù)，同時(shí)也分化為其它類型的細(xì)胞，甚至具有較高的致瘤性。對干細(xì)胞進(jìn)行體外預(yù)分化，使之在移植之前預(yù)先分化為成熟的組織細(xì)胞或前體細(xì)胞，能夠提高定向分化效率，減低干細(xì)胞在體內(nèi)向其它類型細(xì)胞分化的能力，從而提高組織修復(fù)效果，并降低致瘤風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]在體內(nèi)細(xì)胞生長在細(xì)胞外基質(zhì)所構(gòu)成的三維網(wǎng)絡(luò)中，研究表明體外二維培養(yǎng)條件下的細(xì)胞逐漸丟失了其表型和功能，而體外三維培養(yǎng)有利于細(xì)胞的功能維持，能夠模擬體內(nèi)特異組織細(xì)胞微環(huán)境，更好地促進(jìn)干細(xì)胞體外的定向分化。目前，調(diào)控干細(xì)胞體外定向分化的三維體系，采用了脫細(xì)胞支架、膠原支架、或聚乳酸支架等，這些支架有的具有較高免疫原性，有的缺乏促分化的特殊細(xì)胞外基質(zhì)成分，有的降解產(chǎn)物不利于細(xì)胞培養(yǎng)以及組織修復(fù)，這導(dǎo)致了干細(xì)胞體外定向分化效率低，獲得細(xì)胞不具有體內(nèi)正常生理功能等問題。
[0004]由于現(xiàn)有誘導(dǎo)分化體系存在上述缺陷，嚴(yán)重限制了干細(xì)胞體外定向分化技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與臨床應(yīng)用，因此急需研發(fā)便捷實(shí)用的誘導(dǎo)干細(xì)胞三維分化的新方法，即通過利用三維培養(yǎng)以及添加基質(zhì)成分來構(gòu)建能夠模擬體內(nèi)組織的微環(huán)境，以實(shí)現(xiàn)體外對干細(xì)胞定向預(yù)分化的調(diào)控，進(jìn)一步促進(jìn)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法，即利用含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠實(shí)現(xiàn)對干細(xì)胞體外定向分化的調(diào)控。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]本發(fā)明將干細(xì)胞包埋在含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中，添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，通過改變制備微膠珠時(shí)海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質(zhì)量比調(diào)控干細(xì)胞體外定向分化，并且在分化結(jié)束后，可利用檸檬酸鈉溶液溶解海藻酸鈣微膠珠，進(jìn)而得到純凈的分化細(xì)胞。
[0008]所述干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、虹膜色素上皮細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、或造血干細(xì)胞。
[0009]所述含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠為由含海藻酸鈉和硫酸軟骨素的溶液經(jīng)過鈣液鈣化所制備，此溶液溶劑為生理鹽水，海藻酸鈉濃度為0.3-4%(W/V)，硫酸軟骨素溶液濃度為0.5-10%(W/V)，海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質(zhì)量比為1-20 ；
[0010]含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠直徑為200-2000 μ m ；
[0011]海藻酸鈉的分子量為10-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范圍為
0.2-3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉；
[0012]硫酸軟骨素平均分子量為2_40kDa ;
[0013]所述定向分化包括干細(xì)胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪細(xì)胞定向分化。
[0014]所述定向分化所使用的培養(yǎng)容器為靜態(tài)培養(yǎng)體系或生物反應(yīng)器；
[0015]靜態(tài)培養(yǎng)體系指使用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、或培養(yǎng)袋培養(yǎng)；
[0016]生物反應(yīng)器包括旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器、灌注式反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器、或氣升式反應(yīng)器。
[0017]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0018]1.操作簡單，成本低。本發(fā)明利用含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠對干細(xì)胞體外定向分化進(jìn)行調(diào)控，方法簡單，避免使用昂貴材料和工藝；
[0019]2.模擬體內(nèi)特異組織分化微環(huán)境，提高干細(xì)胞分化效率和功能。三維海藻酸鈣微膠珠為干細(xì)胞提供了三維生長環(huán)境，并且硫酸軟骨素的添加進(jìn)一步模擬了體內(nèi)組織的細(xì)胞外基質(zhì)成分，因此本發(fā)明能夠在近似于體內(nèi)特異組織微環(huán)境的條件下誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，其誘導(dǎo)效率和細(xì)胞功能進(jìn)一步提聞;
[0020]4.高活性收集分化細(xì)胞。在分化結(jié)束后，利用檸檬酸鈉溶液溶解微膠珠，通過離心可在生理?xiàng)l件下收集分化的細(xì)胞，細(xì)胞活性高，功能不受影響；
[0021]5.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明方法可促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪細(xì)胞定向分化，并可放大培養(yǎng)規(guī)模，具有臨床應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明的示意圖:培養(yǎng)容器1，含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠2，干細(xì)胞3 ;
[0023]圖2為含有20%(W/V)硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中細(xì)胞的軟骨特異性染色；
[0024]圖3為不同硫酸軟骨素質(zhì)量百分比的海藻酸鈣微膠珠中細(xì)胞II型膠原基因表達(dá)；
[0025]圖4為海藻酸鈣微膠珠調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)前體細(xì)胞:圖4A為Nestin基因相對表達(dá)；圖4B為Nestin陽性細(xì)胞百分比。

【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1:三維誘導(dǎo)體系調(diào)控人間充質(zhì)干細(xì)胞體外向軟骨細(xì)胞定向分化
[0027]將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)粉末溶解于生理鹽水中，得到3%(W/V，g/ml)的溶液。將硫酸軟骨素(平均分子量20kDa)粉末溶解于生理鹽水中，得到5%(W/V，g/ml)的溶液。將3%(W/V，g/ml)海藻酸鈉、5%(W/V，g/ml)硫酸軟骨素溶液以及生理鹽水混合，得到海藻酸鈉終濃度均為2%(W/V，g/ml)，海藻酸鈉/硫酸軟骨素質(zhì)量比分別為1.5、4以及9的混合溶液。將第5代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與該混合溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為6X 16ceIls.ml/1，將該細(xì)胞懸液經(jīng)過注射器泵滴入10mmol.L^1CaCl2溶液中鈣化30min，得到包埋有干細(xì)胞的海藻酸鈣微膠珠，再添加含有10_7mol -T1地塞米松、
I%胎牛血清、l%ITS+、40mg.InL-1L-脯氨酸、50mg.mL—1維生素C和10mg.mL—1丙酮酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)液(含4500ml.L-1葡萄糖)進(jìn)行軟骨誘導(dǎo)3周。之后，使用55mmol.L-1檸檬酸鈉溶液浸泡微膠珠lOmin，溶解微膠珠，離心收獲軟骨分化細(xì)胞，利用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行軟骨細(xì)胞的特異性染色，并分析從不同硫酸軟骨素含量微膠珠中獲得的軟骨細(xì)胞II型膠原的基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2和3，結(jié)果顯示，經(jīng)過三維誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞，II型膠原基因表達(dá)隨硫酸軟骨素含量的增加而提高，說明此三維誘導(dǎo)體系可調(diào)控干細(xì)胞的軟骨分化。
[0028]實(shí)施例2:三維誘導(dǎo)體系調(diào)控人間充質(zhì)干細(xì)胞體外向神經(jīng)前體細(xì)胞定向分化
[0029]首先，制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量500kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比2)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M2_(N_嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得到1%(W/V，g/ml)海藻酸鈉溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和RGD多肽，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24小時(shí)。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1:20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2:1，RGD多肽和海藻酸鈉質(zhì)量比為1:1000。然后進(jìn)行透析并冷凍干燥，從而得到RGD修飾的海藻酸鈉。
[0030]將R⑶修飾海藻酸鈉粉末溶解于生理鹽水中，得到3% (ff/V, g/ml)的溶液。將硫酸軟骨素(平均分子量20kDa)粉末溶解于生理鹽水中，得到5%(W/V，g/ml)的溶液。將3% (ff/V, g/ml) RGD修飾海藻酸鈉、5% (ff/V, g/ml)硫酸軟骨素溶液以及生理鹽水混合，得到海藻酸鈉終濃度均為1.5%(W/V，g/ml)，海藻酸鈉/硫酸軟骨素質(zhì)量比分別為1.5、4以及9的混合溶液。將第4代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與該混合溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為4X 16ceIls ?mL—1，將該細(xì)胞懸液經(jīng)過注射器泵滴入10mmol.I^1CaCl2溶液中鈣化30min，得到包埋有干細(xì)胞的海藻酸鈣微膠珠，再添加含有1ng噸―1上皮生長因子(EGF)和1ng.L-1堿性成纖維生長因子(bFGF)的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)I周。之后，使用55mmol.L-1檸檬酸鈉溶液浸泡微膠珠lOmin，溶解微膠珠，離心收獲神經(jīng)分化細(xì)胞，利用real-time PCR分析從不同硫酸軟骨素含量微膠珠中獲得的神經(jīng)細(xì)胞的Nestin相對基因表達(dá)，并利用熒光染色獲得各個(gè)條件下Nestin陽性細(xì)胞的百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示，經(jīng)過三維誘導(dǎo)，Nestin基因以及陽性細(xì)胞百分比隨硫酸軟骨素含量的增加而提高，說明此三維誘導(dǎo)體系可調(diào)控干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化。
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)控干細(xì)胞體外三維定向分化的方法，其特征在于:將干細(xì)胞包埋在含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠中，添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液，通過改變制備微膠珠時(shí)海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質(zhì)量比調(diào)控干細(xì)胞體外定向分化，并且在分化結(jié)束后，可利用檸檬酸鈉溶液溶解海藻酸鈣微膠珠，進(jìn)而得到純凈的分化細(xì)胞。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、虹膜色素上皮細(xì)胞、羊膜上皮細(xì)胞、或造血干細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠為由含海藻酸鈉和硫酸軟骨素的溶液經(jīng)過鈣液鈣化所制備，此溶液溶劑為生理鹽水；采用海藻酸鈉濃度為0.3-4%(W/V)，采用硫酸軟骨素溶液濃度為0.5-10%(W/V),海藻酸鈉和硫酸軟骨素的質(zhì)量比為1-20 ； 含有硫酸軟骨素的海藻酸鈣微膠珠直徑為200-2000 μ m ； 海藻酸鈉的分子量為10-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范圍為0.2-3，且海藻酸鈉為未修飾海藻酸鈉、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾海藻酸鈉、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)修飾海藻酸鈉、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)修飾海藻酸鈉中一種或二種以上的海藻酸鈉； 硫酸軟骨素平均分子量為2-40kDa。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述定向分化包括干細(xì)胞向神經(jīng)、心肌、肝、胰島、成骨、軟骨或脂肪細(xì)胞定向分化。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述定向分化所使用的培養(yǎng)容器為靜態(tài)培養(yǎng)體系或生物反應(yīng)器； 靜態(tài)培養(yǎng)體系指使用培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、或培養(yǎng)袋培養(yǎng)； 生物反應(yīng)器包括旋轉(zhuǎn)式反應(yīng)器、灌注式反應(yīng)器、攪拌式反應(yīng)器、或氣升式反應(yīng)器。
【文檔編號】C12N5/079GK104046587SQ201310076323
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月11日
【發(fā)明者】馬小軍, 劉洋, 王淑君, 孫廣煒 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所