一種甲基化dna檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測方法，該方法有以下步驟：提取DNA、設計并合成探針、雜交反應、加入單克隆抗體反應、加入偶聯(lián)單克隆抗體反應、加入檢測試劑、測定并計算。本發(fā)明能夠有效排除非甲基化DNA的影響，因此本發(fā)明具有檢測特異性高、不容易被干擾、假陽性率低等優(yōu)點，同時還具有適用范圍大、方法簡單、需要樣本量小、適用混合樣本等好處，在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。
【專利說明】—種甲基化DNA檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體涉及一種甲基化DNA的檢測方法。

【背景技術】
[0002]DNA甲基化是指DNA鏈上CpG位點的胞嘧啶(C)殘基的5’碳上被修飾了一個甲基。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修飾之一，是表觀遺傳學的重要組成部分。DNA甲基化特征性地發(fā)生在DNA鏈上的CG 二核苷酸的胞嘧啶殘基上，這常見于基因5’端表達調控序列。DNA甲基化在基因表達的調控中具有重要作用，參與了動物胚胎發(fā)育、基因印記和X染色體失活等過程。研究表明，DNA甲基化的改變能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及蛋白質互相作用方式的改變，從而控制基因表達。
[0003]DNA甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個重要因素。CpG島局部甲基化水平的異常升聞，可以導致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機率就會提高，所以DNA甲基化在腫瘤早期檢測中的應用十分引人注目。研究表明，表觀遺傳的變化伴隨腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，因而檢測DNA甲基化改變可以有助于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)。目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因，這是因為人們發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生可能與抑癌基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此DNA甲基化的檢測可以用于腫瘤發(fā)生的早期預測。
[0004]CpG島甲基化的檢測方法眾多，其原理分別基于甲基化敏感的限制性內切酶消化法和基于亞硫酸鈉修飾DNA的PCR檢測法。甲基化敏感性限制性內切酶/Southern法(methyIat1n-sensitive restrict1n Endonuclease/Southern, MSRE- Southern)是比較傳統(tǒng)的方法，靈敏度低，樣品需要量大。甲基化DNA特異性PCR法(Methylat1n SpecificPCR, MSP)及其衍生的甲基化DNA檢測方法，是目前檢測DNA甲基化的常用方法，其靈敏度較高，但容易受干擾，特異性差，從而導致檢測的假陽性率也很高。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明提供一種甲基化DNA檢測方法，能夠有效地排除非甲基化DNA的影響，很好地解決了現(xiàn)有技術檢測特異性低、容易被干擾、假陽性高等缺點。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是，一種甲基化DNA檢測方法，所述甲基DNA檢測方法包括如下步驟:
步驟I，提取待測樣品DNA;
步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在檢測區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設計并合成的探針的5’端進行標記；
步驟3，用標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA作為檢測的陽性標準對照和陰性標準對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標準DNA樣品分別進行雜交反應；
步驟4，將步驟3的反應物分別加入反應載體中，捕捉經(jīng)過進行雜交反應的被標記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑進行反應；
步驟8，終止反應并用酶標儀進行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟2中對探針進行標記是用生物素或具有抗原性質的物質進行標記。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟3的雜交反應是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應溫度條件下進行的。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟3中標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟5中的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應溫度條件下進行的。
[0011 ] 優(yōu)選的，所述步驟6中的偶聯(lián)單克隆抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應溫度條件下進行的。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟7中的HRP檢測試劑為HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
[0013]優(yōu)選的，所述待測樣品為人類正常和癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
[0014]優(yōu)選的，所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液。
[0015]本發(fā)明在用特異性的檢測探針進行雜交捕獲后，有效地消除全局性DNA甲基化(Global DNA me thy I at i on )的影響,使得僅有目標檢測區(qū)域的甲基化DNA得以保存,結合免疫學檢測技術，特異性地定位檢測甲基化DNA分子的存在，使這一技術可以檢測到樣品中存在的極微量的甲基化DNA。
[0016]相比于現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明能夠有效排除非甲基化DNA的影響，因此本發(fā)明具有檢測特異性高、不容易被干擾、假陽性率低等優(yōu)點，同時還具有適用范圍大、方法簡單、需要樣本量小、適用混合樣本等好處，在腫瘤早期檢測、個性化治療、病情判斷和復發(fā)監(jiān)控等方面有著重要的意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明甲基化DNA檢測方法流程圖。

【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附后權利要求書限定的范圍。
[0019]實施例1，
步驟I，提取待測樣品DNA;
步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在檢測區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設計并合成的探針的5’端進行標記；
步驟3，用標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA作為檢測的陽性標準對照和陰性標準對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標準DNA樣品分別進行雜交反應；
步驟4，將步驟3的反應物分別加入反應載體中，捕捉經(jīng)過進行雜交反應的被標記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑進行反應；
步驟8，終止反應并用酶標儀進行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。
[0020]實施例2，
取正常人和已經(jīng)證實為結腸癌病人糞便5克，加入5倍體積IxTE并充分混合，用等體積氯仿抽提一次，用0.6倍的異丙醇沉淀獲得總DNA。以此DNA為待測樣品，在與實施例一相同的條件下，檢驗本發(fā)明的實用性。
[0021]其中與上述施例一相同的條件，指的是除以實際臨床樣品提取的DNA為待測樣品外，所有操作與上述施例一相同。
[0022]實施例二中的待測DNA樣品，可以為人類正常和癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、各種體液DNA或各種排泄物DNA的樣品。
[0023]所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述各種體液包括血液、腦脊髓液、胃液及各種消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。
[0024]步驟I，提取待測樣品DNA ；
步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在檢測區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設計并合成的探針的5’端進行標記；
步驟3，用標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA作為檢測的陽性標準對照和陰性標準對照，按比例作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標準DNA樣品分別進行雜交反應；
步驟4，將步驟3的反應物分別加入反應載體中，捕捉經(jīng)過進行雜交反應的被標記的探針，并洗漆;
步驟5，加入單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進行反應并洗滌；
步驟7，加入HRP檢測試劑進行反應；
步驟8，終止反應并用酶標儀進行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。
[0025]實施例3，
檢測探針的設計檢測探針的設計
P16基因轉錄啟動區(qū)的甲基化是肺癌等多種癌癥細胞具有的特征。P16基因轉錄啟動區(qū)的序列如下，有下劃線的部分為所選的要檢測的區(qū)域。
[0026]Homo sapiens pl6 protein (CDKN2A) gene, CpG island and partial cds,DQ325544.1
基因組 DNA 正鏈(sense strand)
5， -CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG-3，
設計的檢測探針:
5， -b1tin-TGCTCTCCCCCTCTCCGCAGCCGCCGAGCGCACGCGGTCCG-3，
上述內容為本發(fā)明的具體實施例的例舉，對于其中未詳盡描述的試劑、設備、操作方法等，應當理解為采取本領域已有的普通及常規(guī)試劑、設備、操作方法等來予以實施。
[0027]以上為對本發(fā)明實施例的描述，通過對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業(yè)技術人員能夠實現(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業(yè)技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
【權利要求】
1.一種甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述甲基化DNA檢測方法包括以下步驟: 步驟I，提取待測樣品DNA; 步驟2，確定待測基因的檢測區(qū)域，在檢測區(qū)域選擇一段序列，以這一段序列的互補序列作為檢測探針的序列，使這一段序列長18-120堿基；對所設計并合成的探針的5’端進行標記； 步驟3，用標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA作為檢測的陽性標準對照和陰性標準對照，作梯度稀釋；用所述的檢測探針與待測樣品DNA、梯度稀釋的標準DNA樣品分別進行雜交反應； 步驟4，將步驟3的反應物分別加入反應載體中，捕捉經(jīng)過進行雜交反應的被標記的探針，并洗漆; 步驟5，加入單克隆抗體，進行反應并洗滌； 步驟6，加入偶聯(lián)單克隆抗體，進行反應并洗滌； 步驟7，加入HRP檢測試劑進行反應； 步驟8，終止反應并用酶標儀進行測定，計算甲基化DNA的濃度和量。
2.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟2中對探針進行標記是用生物素或具有抗原性質的物質進行標記。
3.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟3的雜交反應是在2xSSC的鹽濃度、pH值為8.0、60°C的反應溫度條件下進行的。
4.根據(jù)權利要求3所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟3中標準甲基化DNA和標準非甲基化DNA，是經(jīng)確定的純的人類甲基化DNA和非甲基化DNA。
5.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟5中的單克隆抗體是小鼠抗甲基化胞嘧啶單克隆抗體，所述步驟5的反應是在IxPBST的鹽濃度、pH8.0、0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應溫度條件下進行的。
6.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟6中的偶聯(lián)單克隆抗體是HRP偶聯(lián)的羊抗小鼠單克隆抗體，所述步驟6的反應是在IxPBST的鹽濃度、PH8.0,0.5%的脫脂奶粉作為封閉劑、25°C的反應溫度條件下進行的。
7.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述步驟7的HRP檢測試劑是HRP底物:TMB，3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺。
8.根據(jù)權利要求1所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為人類正常和癌細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、血細胞DNA、血清DNA、體液DNA或排泄物DNA的樣品。
9.根據(jù)權利要求8所述的甲基化DNA檢測方法，其特征在于，所述癌細胞為肺癌細胞、胃癌細胞、結腸細胞、直腸細胞、肝癌細胞、乳腺癌細胞、淋巴癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞、腎癌細胞或胰腺癌細胞；所述腫瘤組織為肺癌組織、胃癌組織、結腸組織、直腸組織、肝癌組織、乳腺癌組織、淋巴癌組織、膀胱癌組織、卵巢癌組織、腎癌組織或胰腺癌組織；所述體液包括血液、腦脊髓液、胃液及消化液、精液、唾液、淚液、汗液、尿液、陰道分泌液等。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046678SQ201310076396
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月11日 優(yōu)先權日:2013年3月11日
【發(fā)明者】孫喜元 申請人:蘇州承美生物科技有限公司