酯化反應(yīng)法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及脂肪酸進(jìn)料在使用微生物酶的生物柴油制備中的使用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】酯化反應(yīng)法
[0001]對(duì)序列表的引用
[0002]本申請(qǐng)包含一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表,其通過(guò)引用的方式合并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及一種在生物柴油的制備中應(yīng)用脂肪酸進(jìn)料的新方法。
【背景技術(shù)】
[0004]由于日益增長(zhǎng)的對(duì)可再生能源尤其是生物燃料的興趣，已開(kāi)發(fā)出多種方法來(lái)制備脂肪酸與低碳醇的酯，這些酯也被稱(chēng)為“生物柴油”。生物柴油可以以?xún)刹矫复俜ㄟM(jìn)行制備，其中在第一脂肪酶催化的工序步驟(“酯交換步驟”)中，甘油三酯原料與低碳醇(例如甲醇或乙醇)反應(yīng)，形成脂肪酸甲酯、游離脂肪酸和游離甘油。將脂肪酸甲酯與游離脂肪酸分離，然后在第二脂肪酶催化的工序步驟(“酯化步驟”)中與低碳醇(如例甲醇或乙醇)反應(yīng)，形成具有非常低游離脂肪酸含量的脂肪酸甲酯組合物。
[0005]生物柴油的規(guī)格對(duì)于例如金屬離子和磷脂的含量日益嚴(yán)格。為滿(mǎn)足這些規(guī)格，需要蒸餾生物柴油產(chǎn)品。蒸餾通常作為酯化工序之后的最后工序步驟而進(jìn)行。然而，還需要制備生物柴油的其他方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]令人驚訝的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在上述兩步酶促生物柴油方法中，在酯化工序步驟前進(jìn)行蒸餾是有利的。蒸餾所得的高純度原料確保酶在第二脂肪酶催化酯化步驟中的較長(zhǎng)壽命，并促使例如在填充床柱中的固定化酶的使用。在傳統(tǒng)的生物柴油方法中，在填充床柱中使用固定化酶是不切實(shí)際的 ，因?yàn)橹鶗?huì)因原料中的雜質(zhì)而堵塞。
[0007]因此，本發(fā)明提供一種由脂肪酸原料制備脂肪酸烷基酯(FAAE)的方法，包括以下步驟:(a)提供含有脂肪酸進(jìn)料、低碳醇與水的反應(yīng)混合物I ;(b)使反應(yīng)混合物I與脂肪酶接觸；(c)使反應(yīng)混合物I反應(yīng)，形成脂肪酸烷基酯；(d)從反應(yīng)混合物I的FAAE/FFA (游離脂肪酸)相中分離水/甘油相；(e)蒸餾反應(yīng)混合物I的FAAE/FFA相，獲得所蒸餾的含有脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸的脂肪酸進(jìn)料；(f)提供含有所蒸餾的脂肪酸進(jìn)料和低碳醇的反應(yīng)混合物2 ; (g)使反應(yīng)混合物2與脂肪酶接觸；以及(h)使反應(yīng)混合物2反應(yīng)，生成脂肪酸烷基酯；其中在步驟(e)、(f)和(g)的任意過(guò)程中，將水從反應(yīng)混合物2中除去。
【具體實(shí)施方式】
[0008]牛物柴油
[0009]短鏈醇的脂肪酸烷基酯(FAAE)，例如脂肪酸甲酯(FAME)和脂肪酸乙酯(FAEE)，也稱(chēng)為生物柴油，因?yàn)樗鼈儽挥米骰裼偷奶砑觿┗蛱娲铩?br> [0010]需要強(qiáng)調(diào)的是，由本發(fā)明方法制備的脂肪酸烷基酯不是專(zhuān)門(mén)用于生物柴油，也能夠在油化學(xué)工業(yè)的更下游方法中用作基本的油化學(xué)品。[0011]座
[0012]用在本發(fā)明方法中的醇優(yōu)選為短鏈、支鏈或直鏈、碳原子為I至5個(gè)(Cp C2, C3、C4或C5)的醇及其混合物(“低碳醇”)。優(yōu)選的低碳醇是甲醇、乙醇、丙醇及其混合物。相對(duì)于反應(yīng)混合物(游離脂肪酸以及結(jié)合甘油的脂肪酸)中脂肪酸的量，醇的含量?jī)?yōu)選為小于4、3、
2、1.5或1.0摩爾當(dāng)量。醇可以在反應(yīng)全程或一部分時(shí)段中逐步(例如在I個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)或更多步驟中)和/或持續(xù)加入至反應(yīng)混合物中。
[0013]脂肪酸進(jìn)料
[0014]術(shù)語(yǔ)“脂肪酸進(jìn)料”在本文中定義為包含甘油三酯的脂肪酸進(jìn)料基質(zhì)。該基質(zhì)還可以包含脂肪酸烷基酯、甘油二酯、甘油單酯、游離脂肪酸或其任意組合。包含脂肪酸的任何植物或動(dòng)物來(lái)源的油脂可以在本發(fā)明方法中用作制備脂肪酸烷基酯的基質(zhì)。
[0015]脂肪酸進(jìn)料可以是選自海藻油、芥花籽油、椰子油、蓖麻油、椰子油(椰子殼油)、玉米油、棉籽油、亞麻油、魚(yú)油、葡萄籽油、大麻油、麻瘋果油、荷荷巴油、芥子油、芥花籽油、棕櫚油、棕櫚油硬脂、軟棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、油菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油、妥爾油、鹽生植物油、菥蓂油、亞麻薺油、荷荷巴油、芫荽籽油、白芒花籽油(meadowfoamoil)、海濱錦葵油、微生物油脂的油及其任意組合。
[0016]脂肪酸進(jìn)料可以是選自動(dòng)物脂肪(包括來(lái)自豬、牛、和羊的動(dòng)物脂)、豬油、雞油、魚(yú)油、黃油脂(yellow grease)、褐色油脂(brown grease)的脂肪或其任意組合。
[0017]脂肪酸進(jìn)料可以是粗制進(jìn)料、精制進(jìn)料、漂白進(jìn)料、脫臭進(jìn)料、脫膠進(jìn)料或其任意組合。
[0018]食品級(jí)質(zhì)量的油脂較為昂貴，因此處理它們所得的廢物和副產(chǎn)物、以及非食品級(jí)的油脂，已經(jīng)逐漸演變?yōu)橛糜谥苽渲舅嵬榛サ挠形Φ倪M(jìn)料。皂腳是煉油廠中通過(guò)用堿處理油而將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為肥皂(例如鈉皂)而得到的油組分。皂腳除肥皂外，通常包含甘油酯組分。酸化油是煉油廠中通過(guò)酸化皂腳以溶解肥皂而得到的副產(chǎn)物。其主要包含游離脂肪酸(FFA)和?；视?。餾分例如棕櫚脂肪酸餾分(PFAD)是油精煉的副產(chǎn)物，來(lái)自于從油中消除游離脂肪酸的蒸餾工序。
[0019]進(jìn)料可以是油脂精煉的中間產(chǎn)物、廢產(chǎn)物或副產(chǎn)物，選自皂腳；酸化油；脂肪酸餾分例如PFAD、大豆脂肪酸餾分、油菜籽脂肪酸餾分、米糠脂肪酸餾分、家禽脂肪脂肪酸餾分、牛脂脂肪酸餾分等；脫膠所得的膠；由魚(yú)油制備ω-3脂肪酸衍生物的副產(chǎn)物；隔油池油脂；黃油脂和棕色油脂、游離脂肪酸例如油酸；或通過(guò)物理分離得到的油組分；或其任意組合。
[0020]酶的固定
[0021]由于新技術(shù)的發(fā)展，固定化酶在油處理中的應(yīng)用經(jīng)歷了顯著增長(zhǎng)，提供成本有效的方法。固定化酶的根本性?xún)?yōu)點(diǎn)是，它們可以通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)濾從批量制備中進(jìn)行回收和再利用。
[0022]固定脂肪酶的多種方法在本領(lǐng)域熟知。關(guān)于脂肪酶固定的綜述可以在“Immobilized lipase reactors for modification of fats and oils - a review (用于脂肪和油的修飾的固定化脂肪酶反應(yīng)器-綜述)”Malcata, FX.，等(1990) J.Am.0il Chem.Soc.Vol.67p.890-910中找到，其中示出了代表性的脂肪酶固定載體的實(shí)例，包括無(wú)機(jī)載體例如硅藻土、二氧化硅、多孔玻璃等；多種合成樹(shù)脂和合成樹(shù)脂離子交換劑；以及天然多糖載體例如引入離子交換基團(tuán)的纖維素和交聯(lián)糊精。[0023]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中脂肪酶固定在載體上；通過(guò)誘捕在天然基質(zhì)或合成基質(zhì)例如溶膠-凝膠、藻酸鹽、和角叉菜膠中；通過(guò)交聯(lián)法，例如在交聯(lián)酶晶體(CLEC)和交聯(lián)酶聚集體(CLEA)中；或通過(guò)沉淀在鹽晶體例如蛋白包被的微晶(PCMC)上。
[0024]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中載體是選自包含以下物質(zhì)的組的親水性載體:由氧化鋁、二氧化硅或硅酸鹽構(gòu)成的多孔無(wú)機(jī)顆粒，例如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤(rùn)土、蛭石、水滑石；以及由糖類(lèi)聚合物例如瓊脂糖或纖維素構(gòu)成的多孔有機(jī)顆粒。
[0025]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種方法，其中載體是選在包含以下物質(zhì)的組的疏水性載體:合成的聚合物例如尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯；以及活性炭。
[0026]塵
[0027]用于本發(fā)明的合適脂肪酶是具有分類(lèi)在E.C.3.1.1.3的酶活性的脂肪酶。脂肪酶可以具有其他活性，例如選自磷脂酶活性、角質(zhì)酶活性、和?；D(zhuǎn)移酶活性的活性。脂肪酶可以選自W088/02775中公 開(kāi)的南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A (CALA)、W088/02775中公開(kāi)并在本文SEQ ID NO:1中示出的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB)、在EP258068中公開(kāi)的疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces Ianuginosus)(以前稱(chēng)為柔毛腐質(zhì)霉(Humicola Ianuginosus))脂肪酶、在 W02000/60063 或 W01995/22615 中公開(kāi)的疏棉狀嗜熱絲孢菌變體特別是在W095/22615的SEQ ID NO:2的I-269位示出的脂肪酶、Hyphozyma sp.脂肪酶(W098/018912)和米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(W02004/099400中的SEQ ID NO:5);來(lái)自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes) (EP218272)、洋蔥假單胞菌(P.cepacia) (EP331376)、穎殼假單胞菌(P.glumae)、斯氏假單胞菌(P.stutzeri) (GB1，372，034)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)、假單胞菌(Pseudomonas sp.)菌株 SD705 (W095/06720 和 W096/27002)、P.wisconsinensis (W096/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌(Bacillus)脂肪酶，例如來(lái)自枯草芽抱桿菌(B.subtilis) (Dartois 等人(1993)，Biochemica et BiophysicaActa, 1131, 253-360) > 嗜熱脂肪芽胞桿菌(B.stearothermophiIus) (JP64/744992)或短小芽孢桿菌(B.pumilus) (W091/16422)。還優(yōu)選自來(lái)自任何下列微生物的脂肪酶:尖刀鐮孢菌(Fusarium oxysporum)、反射犁頭霉(Absidia reflexa)、傘枝犁頭霉(Absidia corymbefera)、米黑根毛霉、德式根霉(米根霉)(Rhizopus delemar (oryzae))、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)、異孢鐮刀霉(Fusarium heterosporum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、沙門(mén)柏干酪青霉(Peniciliumcamembertii)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、黑曲霉、米曲霉和疏棉狀嗜熱絲孢菌,例如選自W02004/099400中SEQ ID NOs:1-15的任意脂肪酶。
[0028]優(yōu)選地，脂肪酶是與任意上述脂肪酶具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
[0029]更優(yōu)選地，脂肪酶與本文SEQ ID NO:1的I-342位示出的氨基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%的同一'I"生。
[0030]適合用在本發(fā)明方法中的固定化脂肪酶以及市售可得的固定化脂肪酶的實(shí)例包括以商品名 Novozym435、Lipozyme RM IM 或 Lipozyme TL IM、Lipozyme TL100L、LipozymeTL HC (以上來(lái)自 Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)、或 Amano PS (來(lái)自 Amano, Japan)進(jìn)行售賣(mài)的那些。
[0031]通常情況下，酶以lLU/g脂肪酸進(jìn)料至1000LU/g脂肪酸進(jìn)料的濃度進(jìn)行使用。優(yōu)選地，酶以5LU/g脂肪酸進(jìn)料至500LU/g脂肪酸進(jìn)料的濃度使用，更優(yōu)選為10LU/g脂肪酸進(jìn)料至100LU/g脂肪酸進(jìn)料。
[0032]通常情況下，酶以lPLU/g脂肪酸進(jìn)料至1000PLU/g脂肪酸進(jìn)料的濃度進(jìn)行使用。優(yōu)選地，酶以5PLU/g脂肪酸進(jìn)料至500PLU/g脂肪酸進(jìn)料的濃度使用，更優(yōu)選為10PLU/g脂肪酸進(jìn)料至100PLU/g脂肪酸進(jìn)料。
[0033]酶的來(lái)源
[0034]用在本發(fā)明方法中的脂肪酶可以源自或得自任何本文所提及的來(lái)源。術(shù)語(yǔ)“源自”在上下文中表示，酶可以已經(jīng)從其天然所處的有機(jī)體中分離出，即該酶的氨基酸序列的識(shí)別(identity)與天然酶相同。術(shù)語(yǔ)“源自”也指，酶可以在宿主有機(jī)體中重組制備，重組產(chǎn)生的酶具有與天然酶相同的識(shí)別或具有修飾的氨基酸序列，例如具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、插入和/或取代，即重組產(chǎn)生的酶為天然氨基酸序列的突變體和/或片段。天然酶的含義包含天然變體。此外，術(shù)語(yǔ)“源自”包括通過(guò)例如肽合成而合成性產(chǎn)生的酶。術(shù)語(yǔ)“源自”也包括在體內(nèi)或體外經(jīng)由例如糖基化、磷酸化等修飾的酶。術(shù)語(yǔ)“得自”在上下文中表示，酶具有與天然酶相同的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)包括已經(jīng)從其天然所處的有機(jī)體中分離出的酶、或是已經(jīng)在相同種類(lèi)有機(jī)體或其他有機(jī) 體中重組表達(dá)的酶、或是通過(guò)例如肽合成而合成性制備的酶。對(duì)于重組產(chǎn)生的酶，術(shù)語(yǔ)“得自”和“源自”是指酶的識(shí)別特征，而不是指其重組制備的宿主有機(jī)體的識(shí)別特征。
[0035]因此，脂肪酶可以通過(guò)使用任何合適的技術(shù)從微生物中獲得。例如，酶制劑的獲得可以通過(guò)合適微生物的發(fā)酵，隨后通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法從所得的發(fā)酵液或微生物中分離出酶制劑。酶也可以通過(guò)使用重組DNA技術(shù)而獲得。這些方法通常包括對(duì)轉(zhuǎn)化有重組DNA載體的宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，其中重組DNA載體包含編碼目的酶的DNA序列以及與合適的表達(dá)信號(hào)可操作連接的DNA序列，從而載體能夠在使得酶表達(dá)的條件下于培養(yǎng)基中進(jìn)行酶表達(dá)并能夠從培養(yǎng)物中回收酶。DNA序列也可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中。DNA序列可以是基因組DNA、cDNA或合成來(lái)源的DNA或其任意組合，并且可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行分離或合成。
[0036]酶活性的最佳參數(shù)將根據(jù)所用的酶而變化。酶降解的速率依賴(lài)于本領(lǐng)域已知的因素，包括酶濃度、底物濃度、溫度、抑制劑的存在與否以及水的存在。這些參數(shù)可以調(diào)整，以?xún)?yōu)化酯化反應(yīng)。
[0037]在酶處理步驟中，混懸液的溫度應(yīng)該調(diào)整成提供有效的酶活性?；径?，使用溫度為約30°C至約90°C，特別是約35°C至約60°C。
[0038]方法設(shè)計(jì)
[0039]在當(dāng)前用于酶促制備生物柴油的方法中，包含甘油三酯進(jìn)料、低碳醇(例如甲醇或乙醇)和水的反應(yīng)混合物1，在第一脂肪酶催化的酯交換工序步驟中，形成脂肪酸烷基酯、游離脂肪酸和游離甘油。此外，甘油可以加至反應(yīng)混合物I。
[0040]應(yīng)用在第一脂肪酶催化的工序步驟(酯交換反應(yīng)步驟)中的脂肪酶可以是載體上的固定化脂肪酶；固定化脂肪酶可以通過(guò)攪拌在反應(yīng)混合物中保持為混懸液。使用固定化脂肪酶，水含量?jī)?yōu)選為約0.5%。
[0041]應(yīng)用在第一脂肪酶催化的工序步驟中的脂肪酶也可以是非固定化的脂肪酶，即液體配方的脂肪酶。在這種情況下，第一脂肪酶催化的工序步驟優(yōu)選在反應(yīng)混合物I中水含量為10%至50%、15%至40%、或甚至20%至30%的條件下進(jìn)行；在第一脂肪酶催化的工序步驟后，反應(yīng)混合物I中含有非固定化脂肪酶的水/甘油相從反應(yīng)混合物I中分離，并可以再循環(huán)至新批次的甘油三酯進(jìn)料中。反應(yīng)混合物I的油相通過(guò)蒸餾來(lái)分離，得到非常純的脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸餾分，其中水含量不多于500ppm的水、300ppm的水、或甚至200ppm的水。術(shù)語(yǔ)“蒸餾”旨在包括任何類(lèi)型的蒸餾方法，例如蒸汽蒸餾、真空汽提和除臭(Lipid Handbook s245.3ed ed.Gunstone 等人，CRC Press2007)。反應(yīng)混合物 2 由脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸餾分以及低碳醇(例如甲醇或乙醇)形成。在第二脂肪酶催化的工序步驟(酯化步驟沖，剩余的游離脂肪酸與低碳醇反應(yīng)，形成FFA含量非常低的脂肪酸烷基酯組分。第二脂肪酶催化的工序步驟優(yōu)選使用固定化酶來(lái)進(jìn)行，例如通過(guò)使反應(yīng)混合物2經(jīng)過(guò)填充床柱中的固定化酶。水是反應(yīng)產(chǎn)物，需要在整個(gè)反應(yīng)期間從反應(yīng)混合物2中去除，在多個(gè)步驟(例如實(shí)施例1中通過(guò)真空處理)中進(jìn)行或持續(xù)進(jìn)行(例如US2010/167360中通過(guò)惰性氣流的汽提)，以將反應(yīng)驅(qū)動(dòng)向酯的那側(cè)。在第二脂肪酶催化的工序步驟后的終產(chǎn)物是非常純的脂肪酸烷基酯組分，具有少于0.25%的FFA、少于0.20%的FFA、少于0.15%的FFA、或甚至少于0.10%的FFAJP /或少于300ppm的水、少于200ppm的水、少于IOOppm的水、或甚至少于50ppm的水。應(yīng)用于甘油三酯酯交換反應(yīng)的第一脂肪酶催化工序步驟中的低碳醇可以是任何低碳醇，優(yōu)選甲醇、乙醇和/或丙醇。
[0042]應(yīng)用于FFA酯化反應(yīng)的第二脂肪酶催化工序步驟中的低碳醇可以是任何低碳醇，優(yōu)選甲醇、乙醇和/或丙醇。不同的低碳醇可以應(yīng)用于第一和第二脂肪酶催化的工序步驟中(即應(yīng)用在反應(yīng)混合物I和2中)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，乙醇應(yīng)用于第一脂肪酶催化的工序步驟中，甲醇應(yīng)用于第二脂肪酶催化的工序步驟中。
[0043]材料與方法
[0044]同一件稈度
[0045]對(duì)于本發(fā)明的目的，可以根據(jù)在Needleman, S.B.andWunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45 中描述的方法，適當(dāng)?shù)卮_定同一性程度，且應(yīng)用如下的設(shè)置進(jìn)行多肽序列比較:空位(GAP)產(chǎn)生罰分為3.0，GAP擴(kuò)展罰分為0.1?？梢酝ㄟ^(guò)已知計(jì)算機(jī)程序的方式，例如在GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package,版本 8，Augustl994, Genetics ComputerGroup, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)，來(lái)實(shí)現(xiàn)確定。
[0046]可以根據(jù)Needleman和Wunsch (同上)記載的方法,使用相同的參數(shù)來(lái)對(duì)兩個(gè)給定的序列進(jìn)行比對(duì)。這也可以通過(guò)GAP程序(同上)的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0047]脂肪分解活性
[0048]脂肪分解活性可以使用三丁酸甘油酯作為底物來(lái)確定。這種方法基于酶對(duì)三丁酸甘油酯的水解，并且水解過(guò)程中保持PH恒定的堿消耗記錄為時(shí)間函數(shù)。一個(gè)脂肪酶單位(LU)定義為，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即，在30°C，pH7.0，含0.1% w/v阿拉伯樹(shù)膠作為乳化劑以及0.16M三丁酸甘油酯作為底物)每分鐘釋放I微摩爾可滴定丁酸的酶量。一個(gè)KLU是1000LU。[0049]固定化脂肪酶的酯合成活性可以確定為每克產(chǎn)物的月桂酸丙酯單位:PLU/g。固定化脂肪酶酯化月桂酸與1-丙醇，形成月桂酸丙酯?；钚?μπιο?/g/min)通過(guò)所形成的月桂酸丙酯和所消耗的月桂酸的GC量化來(lái)確定。
[0050]一個(gè)PLU單位定義為，在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即，在60°C，反應(yīng)時(shí)間20分鐘)每分鐘形成I微摩爾月桂酸丙酯的酶量。
[0051]塵
[0052]Novozym435是Novozymes A/S的商業(yè)酶產(chǎn)品，含有南極假絲酵母(本文的SEQ IDNO:1)的固定化脂肪酶B。該產(chǎn)品具有10000PLU/g的活性。
[0053]LipexlOOL是Novozymes A/S的商業(yè)酶產(chǎn)品,含有疏棉狀嗜熱絲孢菌(本文的SEQID NO:2)的固定化脂肪酶。該產(chǎn)品具有100KLU/g的活性。
[0054]Lipozyme TLlOOL是Novozymes A/S的商業(yè)酶產(chǎn)品,含有疏棉狀嗜熱絲孢菌(本文的SEQ ID NO:2)的液體配方脂肪酶。該產(chǎn)品具有100KLU/g的活性。
[0055]實(shí)施例1
[0056]本發(fā)明的方法可以包括:
[0057]1.酯交換，使用
[0058]a.液體配方脂肪酶，或
[0059]b.固定化脂肪酶，
[0060]2.將FAME/FFA酯相與水/甘油相分離，
[0061 ] 3.從FAME/FFA相蒸餾出FAME和FFA，以及
[0062]4.餾出物中FFA的酯化。
[0063]Ia.[0064]大豆油與水和甘油以80:10:10w/w比例進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)至40°C。將液體配方的酶(Lipozyme TL100L, Novozymes Denmark)以油的0.5%的劑量加入。將反應(yīng)混合物于40°C在攪拌下孵育22小時(shí)。甲醇以相對(duì)于油中脂肪酸的1.3摩爾當(dāng)量加入(14.1克甲醇對(duì)應(yīng)100克油)。甲醇在孵育的最初5小時(shí)內(nèi)逐漸加入。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，F(xiàn)AME和FFA在FAME/FFA相中的含量預(yù)計(jì)分別為約92%及6%。
[0065]Ib.[0066]大豆油與水和甘油以80:10:10w/w比例進(jìn)行混合，調(diào)節(jié)至40°C。將固定化酶(Lipozyme TL HC, Novozymes Denmark)以油的5%的劑量加入。將反應(yīng)混合物于40°C在攪拌下孵育22小時(shí)。甲醇以相對(duì)于油中脂肪酸的1.3摩爾當(dāng)量加入(14.1克甲醇對(duì)應(yīng)100克油)。甲醇在孵育的最初5小時(shí)內(nèi)逐漸加入。當(dāng)反應(yīng)完成時(shí)，F(xiàn)AME和FFA在FAME/FFA相中的預(yù)計(jì)含量分別為約92%及6%。
[0067]2.[0068]通過(guò)除去水/甘油相來(lái)獲得FAME/FFA相。當(dāng)使用液體酶時(shí)，水/甘油相包含酶并且能夠再利用于其他批次的FAME制備。
[0069]3.[0070]蒸餾FAME/FFA相，獲得蒸餾的脂肪酸進(jìn)料，預(yù)計(jì)由6 %油酸和94% FAME構(gòu)成。
[0071]4.[0072]所蒸餾的脂肪酸進(jìn)料(a)通過(guò)在50°C下的真空處理干燥成水含量<200ppm，(b)加入4%的甲醇，以及(c)將反應(yīng)混合物泵送經(jīng)過(guò)保持在40°C的含固定化脂肪酶(Novozym435, Novozymes Denmark)的填充床柱。此處理(a、b和c)進(jìn)行三次,將最終的反應(yīng)產(chǎn)物真空干燥至含水量<200pm。通過(guò)三次經(jīng)過(guò)柱，F(xiàn)FA含量預(yù)計(jì)減少到〈0.25%，且產(chǎn)物可以用作生物柴油。在反應(yīng)混合物的真空干燥過(guò)程中收集的濕甲醇可以在步驟I (a或b)的酯交換反應(yīng)中再利用， 因?yàn)樵摲磻?yīng)耐受于水。
【權(quán)利要求】
1.一種由脂肪酸進(jìn)料制備脂肪酸烷基酯(FAAE)的方法，包括以下步驟: Ca)提供包含脂肪酸進(jìn)料、低碳醇和水的反應(yīng)混合物I ; (b)使所述反應(yīng)混合物I與脂肪酶接觸； (c)使所述反應(yīng)混合物I反應(yīng)，形成脂肪酸烷基酯； Cd)從所述反應(yīng)混合物I的FAAE/FFA相中分離出水/甘油相； Ce)蒸餾所述反應(yīng)混合物I的FAAE/FFA相，獲得蒸餾的含有脂肪酸烷基酯和游離脂肪酸的脂肪酸進(jìn)料； Cf)提供包含蒸餾的脂肪酸進(jìn)料和低碳醇的反應(yīng)混合物2 ； (g)使所述反應(yīng)混合物2與脂肪酶接觸；以及 (h)使所述反應(yīng)混合物2反應(yīng)，形成脂肪酸烷基酯； 其中在步驟(e)、(f)和(g)的任意步驟中，從所述反應(yīng)混合物2中除去水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(e)、(f)和(g)重復(fù)一次或多次。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)、(g)和(h)的任意步驟中，通過(guò)惰性氣體的氣提、閃蒸或持續(xù)蒸發(fā)，從所述反應(yīng)混合物2中除去水。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(f)、(g)和(h)的任意步驟中的水量保持在300ppm以下。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂肪酸進(jìn)料得自海藻油、芥花籽油、椰子油、蓖麻油、椰子油(椰子殼油)、玉米油、棉籽油、亞麻油、魚(yú)油、葡萄籽油、大麻油、麻瘋果油、荷荷巴油、芥子油、芥花籽油、棕櫚油、棕櫚油硬脂、軟棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、油菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油、妥爾油、鹽生植物油、菥蓂油、亞麻薺油、荷荷巴油、芫荽籽油、白芒花籽油、海濱錦葵油、微生物油脂中的任一種，或其組合。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 在步驟(a)和/或步驟(f)中的醇選自甲醇、乙醇和丙醇，包括其混合物。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)中的脂肪酶是液體配方的脂肪酶和/或固定化脂肪酶。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(b)中的脂肪酶是液體配方的脂肪酶且所述反應(yīng)混合物I中的水含量為10%至50%。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用固定化脂肪酶進(jìn)行步驟(f)。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述脂肪酶固定在載體上，例如是選自包含以下物質(zhì)的組的親水性載體:由氧化鋁、二氧化硅或硅酸鹽構(gòu)成的多孔無(wú)機(jī)顆粒，例如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨潤(rùn)土、蛭石、水滑石，以及由糖類(lèi)聚合物例如瓊脂糖或纖維素構(gòu)成的多孔有機(jī)顆粒；或例如選自包含以下物質(zhì)的組的疏水性載體:合成的聚合物例如尼龍、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯，以及活性炭。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在填充床柱中進(jìn)行步驟(g)。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(e)和/或步驟(f)中的脂肪酶是南極假絲酵母脂肪酶B和/或與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(e)和/或步驟(f)中的脂肪酶是疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶和/或與SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或甚至至少99%同一性的酶。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述反應(yīng)混合物I中含有酶的水/甘油相在酯交換反應(yīng)中進(jìn)行再利用。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述反應(yīng)混合物I中應(yīng)用的低碳醇是乙醇，在所 述反應(yīng)混合物2中應(yīng)用的低碳醇是甲醇。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK103459607SQ201280016597
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月30日
【發(fā)明者】P·M·尼爾森, H·C·霍爾姆 申請(qǐng)人:諾維信公司