用來源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌(Corynebacterium ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化了埃希氏菌(Escherichia?sp.)來源的果糖激酶基因以表達(dá)果糖激酶的棒桿菌(Corynebacterium?sp.)以及利用該菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法，所述果糖激酶顯示出足以將果糖轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的活性，從而阻止不必要的能量損耗。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的棒桿菌能從埃希氏菌來源的果糖激酶基因表達(dá)果糖激酶，以阻止果糖代謝期間不必要的能量損耗，產(chǎn)生更具成本效益的L-氨基酸的生產(chǎn)。因此，其可以被廣泛用于有效生產(chǎn)L-氨基酸。
【專利說明】用來源于埃希氏菌(Escherichia sp.)的果糖激酶基因轉(zhuǎn)
化的棒桿菌(Corynebacterium sp.)及使用該棒桿菌制備
L-氨基酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用埃希氏菌(Escherichia sp.)來源的基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌(Corynebacterium sp.)及使用該棒桿菌菌株生產(chǎn)L-氨基酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]棒桿菌,具體來說，谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum),是用于生產(chǎn)L-氨基酸的革蘭氏陽性的微生物。諸如L-賴氨酸的L-氨基酸被廣泛用于動物飼料生產(chǎn)、人類藥品生產(chǎn)、制藥工業(yè)等，并通過使用棒桿菌菌株的遺傳工程方法來大量生產(chǎn)。由于工業(yè)發(fā)展，對L-氨基酸的不斷增加的需求導(dǎo)致需要開發(fā)改良的棒桿菌菌株，以更有效和更經(jīng)濟地生產(chǎn)L-氨基酸。
[0003]一般來說，通過將特定的DNA(如L-氨基酸生物合成相關(guān)的基因)引入棒桿菌菌株內(nèi)或者通過改良棒桿菌菌株的活力已經(jīng)可以增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)。例如，韓國專利公開第2001-51915號和第2001-62279號公開了通過來源于谷氨酸棒桿菌的sucC和sucD基因以及zwa2基因的低表達(dá)，增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)力的方法。韓國專利公開第2001-62272號公開了通過來源于谷氨酸棒桿菌的zwal基因的過表達(dá)，增加棒桿菌的L-氨基酸生產(chǎn)力的方法。日本專利第1995-121228號公開了引入來源于大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的編碼檸檬酸合酶的基因的方法。
[0004]同時，棒桿菌能利用蔗糖、葡萄糖和果糖作為碳源。其中，蔗糖被磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)磷酸化并被運送到細(xì)胞內(nèi)。隨后，磷酸化的蔗糖被轉(zhuǎn)化酶水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖。產(chǎn)生的葡萄糖-6-磷酸進入糖酵解，而未磷酸化的果糖則被從細(xì)胞輸出。其被PTS磷酸化，隨后被運送到細(xì)胞內(nèi)，并在糖酵解中被利用。利用果糖作為碳源需要相對復(fù)雜的代謝途徑，因為棒桿菌沒有果糖激酶活性(Appl Environ Microbiol.(1996) 62:3878-3880)。另一方面，在表達(dá)果糖激酶的細(xì)菌內(nèi)，蔗糖被轉(zhuǎn)化酶水解為葡萄糖-6-磷酸和果糖，且果糖被果糖激酶磷酸化。隨后，葡萄糖-6-磷酸和磷酸化果糖可以進入糖酵解途徑。
[0005] 使用果糖作為培養(yǎng)棒桿菌的碳源有一個問題，由于復(fù)雜的代謝途徑，其需要不必要的能量損耗，因此已經(jīng)進行了許多研究來解決這一問題。例如，本發(fā)明發(fā)明人開發(fā)了使用轉(zhuǎn)化的菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的方法，所述轉(zhuǎn)化的菌株通過將來源于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)或枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)的果糖激酶基因引入棒桿菌內(nèi)來制備(韓國專利第564805號)。然而，隨后的研究表明，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌具有非常低的果糖激酶活性，且當(dāng)使用蔗糖作為培養(yǎng)棒桿菌的碳源時，來源于蔗糖的一部分果糖被轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸，且余下的部分在細(xì)胞外被PTS磷酸化，隨后被運送到細(xì)胞內(nèi)，這如同野生型內(nèi)的情形，因此引入果糖激酶基因并不提供足夠的產(chǎn)出。因此，有必要探索其他顯示出足以在棒桿菌內(nèi)將果糖轉(zhuǎn)化成為果糖-6-磷酸的活性的果糖激酶基因。[0006]從對調(diào)節(jié)蔗糖吸收和水解作用以賦予蔗糖同化能力的基因的研究中，鑒定出了期望的果糖激酶基因，且通過以下例證:沙門氏菌(Salmonella)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)和解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)中發(fā)現(xiàn)的 scr 調(diào)節(jié)子(J.Bacteriol.，151:68-76，1982;Mol.Microbiol.，2:1-8，1988;J.Bacteriol.，173:7464-7470，1991;J.Gen.Microbiol.，134:1635-1644，1988;J.Bacteriol.，182:5351-5358，2000;USP7, 179，623);來源于埃希氏菌的 csc 調(diào)節(jié)子(Appl.Environ.Microbiol., 58:2081-2088, 1992; USP6, 960，455)以及來源于革蘭氏陽性
的微生物-變異鏈球菌(Streptococcus mutans)的scr調(diào)節(jié)子和sac操縱子
(J.Bacteriol.，171:263-271，1989)。其中，在埃希氏菌中發(fā)現(xiàn)了兩種果糖激酶基因(cscK和mak)。cscK是屬于csc調(diào)節(jié)子的果糖激酶基因，且已知與cscB (質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運型鹿糖通透酶)和cscA (蔗糖水解酶)一起參與蔗糖代謝(J.Bacteriol.，184:5307-5316，2002)。Mak是編碼甘露糖激酶的基因，且已知甘露糖激酶具有將諸如甘露糖、果糖和葡萄糖的己糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸-酯形式的活性(Mol.Microbiol.，5:2913-2922，1991)。
[0007]發(fā)明概述
[0008]摶術(shù)問是頁
[0009]因此，本發(fā)明發(fā)明人分離了埃希氏菌的果糖激酶基因(cscK和mak)，并用該基因轉(zhuǎn)化棒桿菌菌株以提供具有增加的氨基酸生產(chǎn)力的菌株，從而完成本發(fā)明。
_0] 技術(shù)方案
[0011]本發(fā)明的一個目的是提供用埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化以表達(dá)果糖激酶的棒桿菌，所述果糖激酶顯示出足以在細(xì)胞內(nèi)將果糖轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的活性，而不需要通過水解磷酸化的蔗糖產(chǎn)生的胞內(nèi)果糖在輸出后的再次進入，從而阻止不必要的能量損耗。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的棒桿菌和從其收集L-氨基酸的步驟。
[0013]本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的棒桿菌和從其收集L-氨基酸的步驟。
[0014]本發(fā)明的有益.效果
[0015]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的棒桿菌能表達(dá)埃希氏菌來源的果糖激酶，從而避免果糖代謝期間不必要的能量損耗，產(chǎn)生更具成本效益的L-氨基酸生產(chǎn)。因此，其可以被廣泛用于有效生產(chǎn)L-氨基酸。
[0016]附圖簡要說明
[0017]圖1是顯示培養(yǎng)用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的谷氨酸棒桿菌后，存在于培養(yǎng)基中的蔗糖和果糖的定量結(jié)果的圖。
[0018]實施發(fā)明的最佳方式
[0019]一方面，為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌，其包含可操作地連接至基因表達(dá)單元的埃希氏菌來源的果糖激酶基因。就這一點而言，果糖激酶基因并不具體受限，且優(yōu)選為cscK或mak，且最優(yōu)選為cscK。根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，cscK具有SEQ ID N0.17的核苷酸序列，且mak具有SEQ ID N0.18 的核苷酸序列。
[0020]此外，基因表達(dá)單元被可操作地連接至載體，且優(yōu)選通過轉(zhuǎn)化插入到棒桿菌內(nèi)，或通過插入棒桿菌的染色體中而并入。該基因優(yōu)選通過基因表達(dá)調(diào)控區(qū)的修飾而被過表達(dá)。
[0021]例如，除了基因上游的固有啟動子，還可以連接其他的異質(zhì)啟動子，且異質(zhì)啟動子的例子可以包括pcj7啟動子、IysCPl啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子、aceA啟動子和aceB啟動子。優(yōu)選使用棒桿菌來源的啟動子——pcj7啟動子或IysCPl啟動子，且最優(yōu)選使用pcj7啟動子。[0022]如本文中所使用，術(shù)語“表達(dá)單元”指包含可操作地連接至編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸的啟動子和所述多核苷酸的片段，且可以進一步包括3’ -UTL、5’ -UTL、聚A尾等。如本文中所使用，術(shù)語“表達(dá)單元”與“表達(dá)盒”可互換。
[0023]如本文中所使用，術(shù)語“pcj7啟動子”指可以被表達(dá)的啟動子，其在產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)和埃希氏菌內(nèi)顯示優(yōu)良的啟動子活性,且還在谷氨酸棒桿菌內(nèi)顯示優(yōu)良的啟動子活性(韓國專利第0620092號)。
[0024]如本文中所使用，術(shù)語“l(fā)ysCPl啟動子”指通過編碼天冬氨酸激酶和天門冬氨酸半醛脫氫酶的基因的啟動子區(qū)的核苷酸置換而改良的啟動子，以及可增加天冬氨酸激酶基因的表達(dá)水平從而使酶活增加超過野生型約5倍的強啟動子(W02009/096689)。
[0025]本發(fā)明中，可以將果糖激酶基因引入的棒桿菌，可以包括屬于棒桿菌且具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的所有菌株。其實例可以優(yōu)選包括，但不限于:谷氨酸棒桿菌(ATCC13032)、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (FERM BP-1539)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) (ATCC14067)、發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium fermentum)(ATCC13869)，且更優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌KFCC10881 (韓國專利第0159812號)、KFCC_11074和 KFCCl1001I。
[0026]如本文中所使用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將果糖激酶基因引入宿主細(xì)胞一棒桿菌內(nèi)，以使其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的全部行為。就這一點而言，果糖激酶基因是能編碼果糖激酶的多核苷酸，包括DNA和RNA。只要基因能被引入宿主細(xì)胞內(nèi)并在其中表達(dá)，該基因就可以以任何形式被引入。例如，可以以表達(dá)盒將基因引入宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)盒是其自身包含用于表達(dá)該基因的完整元件的多核苷酸表達(dá)體(expressome)。表達(dá)盒包含可操作地連接至基因的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止信號、核糖體結(jié)合位點和翻譯終止信號。表達(dá)盒可以為能自我復(fù)制的表達(dá)載體?；蜻€可以單獨或以可操作地連接至在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必需的序列的多核苷酸表達(dá)體的形式被引入宿主細(xì)胞內(nèi)。
[0027]同時，另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括培養(yǎng)用埃希氏菌來源的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的棒桿菌；和從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸的步驟。
[0028]就這一點而言，L-氨基酸可以為所有類型的L-氨基酸，且優(yōu)選為L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。
[0029]棒桿菌的培養(yǎng)可以通過本領(lǐng)域已知的不同培養(yǎng)方法(Chmiel,Bipprozesstechnikl.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik,GustavFischer Ver lag,Stuttgart, 199 I ;Storhas,Bioreaktoren und periphereEinrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994),在合適的培養(yǎng)基中進行。培養(yǎng)方法的實例可以包括:分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和補料分批培養(yǎng)。補料分批培養(yǎng)包括補料分批法和重復(fù)補料分批法，但不限于此。
[0030]此外，根據(jù)培養(yǎng)模式和菌株，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以恰當(dāng)?shù)剡x擇本文中用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基(“普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(Manual of Methods for General Bacteriology) ”,美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會，美國華盛頓，1981)。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基包括不同的碳源、氮源和微量元素。用于培養(yǎng)棒桿菌的培養(yǎng)基可以包括所有的蔗糖、葡萄糖、果糖、脂質(zhì)、脂肪酸、醇、有機酸等。具體來說，本發(fā)明的棒桿菌具有果糖激酶活性，從而通過果糖激酶直接在細(xì)胞內(nèi)磷酸化果糖，而不需要通過水解磷酸化的蔗糖產(chǎn)生的胞內(nèi)果糖在輸出后的再次進入，因此可在糖酵解中利用磷酸化的果糖。因此，本發(fā)明的棒桿菌具有比已知棒桿菌改善的蔗糖同化能力。有用的碳源的具體實例包括:碳水化合物，如蔗糖一包括糖蜜、葡萄糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸；醇，如甘油和乙醇；以及有機酸，如醋酸?？梢砸圆煌姆绞绞褂煤线m量的碳源。氮源包括諸如蛋白胨、酵母提取物、肉湯、麥芽提取物、玉米漿和大豆粉的有機氮源，以及諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨的無機氮源。這些氮源可以單獨或組合使用。用于培養(yǎng)基的磷源的實例可以包括:磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和相應(yīng)的鈉鹽。另外，培養(yǎng)基可以包含諸如硫酸鎂或硫酸亞鐵的金屬鹽。此外，可以包含氨基酸、維生素和合適的前體物質(zhì)?？梢酝ㄟ^分批式或連續(xù)式方法將培養(yǎng)基或前體物質(zhì)加入到培養(yǎng)物中。
[0031]可以以合適的方法，通過在培養(yǎng)期間加入諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸的化合物來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH?？梢酝ㄟ^在培養(yǎng)期間使用諸如聚乙二醇脂肪酸酯的消泡劑來抑制氣泡的產(chǎn)生。為了維持培養(yǎng)物的需氧條件，可以將氧氣或含氧氣體(例如，空氣)注入到培養(yǎng)物中。培養(yǎng)溫度為20至45°C，且優(yōu)選為25至40°C?？梢猿掷m(xù)培養(yǎng)直到達(dá)到L-氨基酸生產(chǎn)的期望水平，且優(yōu)選持續(xù)10至160小時。
[0032]可以使用本領(lǐng)域已知的典型方法從培養(yǎng)基中分離L-氨基酸。分離方法的實例可以包括:離心、過濾、離子交換層析、結(jié)晶等。例如，可以通過低速離心從培養(yǎng)物中移除生物質(zhì)，并可以通過離子交換層析純化產(chǎn)生的上清液。
[0033]另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述棒桿菌，和從培養(yǎng)物分離L-氨基酸的步驟。就這一點而言，由生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌產(chǎn)生的L-氨基酸可以為，但不具體限于，L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。
[0034]在本發(fā)明的一個實施方案中，生產(chǎn)L-賴氨酸的方法包括在含有蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述棒桿菌，和從培養(yǎng)物收集L-氨基酸的步驟。
[0035]在本發(fā)明的另一個實施方案中，生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括以下步驟:將包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達(dá)載體和包含蘇氨酸生物合成相關(guān)基因及輸出相關(guān)基因的質(zhì)粒載體引入谷氨酸棒桿菌KFCC10881內(nèi)，以獲得轉(zhuǎn)化菌株，隨后培養(yǎng)該菌株并從培養(yǎng)物收集L-蘇氨酸。就這一點而言，包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達(dá)載體優(yōu)選為pDZTn-pCj7_CSCK或pDZTn-lySCPl_CSCK，但不具體限于此。包含蘇氨酸生物合成相關(guān)基因及輸出相關(guān)基因的質(zhì)粒載體優(yōu)選為pECCG117-homthrBCE，但不具體限于此。
[0036]在本發(fā)明的另一個實施方案中， 生產(chǎn)L-谷氨酸的方法包括以下步驟:將包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達(dá)載體引入谷氨酸生產(chǎn)菌株一谷氨酸棒桿菌KTCC10774內(nèi)，以獲得轉(zhuǎn)化菌株，隨后培養(yǎng)該菌株并從培養(yǎng)物收集L-谷氨酸。就這一點而言，包含cscK啟動子連接的果糖激酶基因cscK的表達(dá)載體優(yōu)選為pDZTn-pCj7_CSCK或pDZTn_lysCPl_cscK,但不具體限于此。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，相比引入已知的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutyricum)來源的果糖激酶基因-CFK(韓國專利第0564805號)，引入埃希氏菌
來源的果糖激酶基因cscK或mak極大地增加了 L-賴氨酸的生產(chǎn)力。具體來說，當(dāng)引入與異質(zhì)的啟動子pc j7或IysCPl而非其固有啟動子連接的果糖激酶基因cscK時，效果提高更多(表1)。此外，當(dāng)將通過引入與pcj7啟動子連接的果糖激酶基因cscK而轉(zhuǎn)化的菌株培養(yǎng)在含有蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基中時，由蔗糖水解產(chǎn)生的果糖并沒有被分泌到培養(yǎng)基中，因此通過存在于培養(yǎng)基中的蔗糖的胞內(nèi)水解產(chǎn)生的果糖被完全磷酸化，并在糖酵解中被利用(圖1)。此外，相比沒有引入果糖激酶基因的情形，當(dāng)引入果糖激酶基因時，果糖激酶活性增加了 1.95至4.24倍。相比引入已知的果糖激酶基因的情形，當(dāng)引入果糖激酶基因中的cscK時，果糖激酶活性增加了 1.80至2.16倍(表3)。
[0038]通過引入埃希氏菌來源的果糖激酶基因而轉(zhuǎn)化的菌株不僅增加了 L-賴氨酸的生產(chǎn)力，還增加了其他L-氨基酸一L-蘇氨酸(表4)和L-谷氨酸(表5)的生產(chǎn)力。因此，通過引入本發(fā)明的埃希氏菌來源的果糖激酶基因而轉(zhuǎn)化的菌株可以用于生產(chǎn)所有的L-氨基酸。
[0039]因此，本發(fā)明發(fā)明人將顯示最優(yōu)效果的用pDZTn_pcj7_cscK轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化株(KFCC-10881-Pcj7_cscK)命名為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)CA01-2012，并于2011年3月28日將其保藏于韓國微生物培養(yǎng)中心(Korean CultureCenter of Microorganisms,下文縮寫為“KCCM”，361-221，Yurim B/D, Hongje-l-dong, Seodaemun-gu, SEOUL 120-091, Republic of Korea)，其登錄號為 KCCMl 1183P。
[0040]本發(fā)明的實施例
[0041]下文中，將參考實施例對本發(fā)明進行更詳細(xì)地描述。然而，這些實施例僅用于說明目的，并且本發(fā)明并不意圖受限于此。
[0042]實施例1:大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因的獲得和載體的構(gòu)建
[0043]大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因的堿基序列已經(jīng)被清晰揭示和公開。來源于大腸埃希氏菌EC3231 (登錄號X81461)的cscK基因(SEQ ID N0.17)和來源于W3110(登錄號AC000091)的mak基因(SEQ ID N0.18)的序列信息從NIH GenBank獲得。
[0044]基于報導(dǎo)的堿基序列，合成了具有5’端EcoRI限制位點和3’端SpeI限制位點的引物，并使用購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的大腸埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色體作為模板，以PCR擴增包含啟動子區(qū)的約1200bp的cscK基因(使用以下的SEQ ID N0.1和2引物)，以及mak基因(使用以下的SEQ ID N0.3和4引物)。此時，在以下條件下進行PCR，包括94°C變性5分鐘，30個循環(huán)的94°C變性30秒、56 °C退火30秒和72°C聚合I分鐘，隨后72°C聚合7分鐘。
[0045]SEQ ID N0.1:5’-gcgaattcgaaaatggggataga-3’
[0046]SEQ ID N0.2:5，-gcactagtattacctgcctgtcg-3’
[0047]SEQ ID N0.3:5’ _cagaattcacgtgcgttaacgcatcg_3’
[0048]SEQ ID N0.4:5，_ctactagtcaccttttgtaggcctga_3，
[0049]用EcoRI和SpeI限制酶處理兩條擴增的果糖激酶基因的多核苷酸。得到每種DNA片段，隨后將其連接入PECCG117的EcoRI和SpeI位點內(nèi)，其中pECCG117為大腸埃希氏菌和棒桿菌的穿梭載體。其后，用該載體轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌DH5ci，并涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上。挑選用含有PCR擴增基因的載體轉(zhuǎn)化的克隆，隨后通過已知的質(zhì)粒抽提方法獲取質(zhì)粒，將其分別命名為“pECCG117-cscK”和“pECCG117_mak”。
[0050]實施例2:果糖激酶基因至賴氨酸生產(chǎn)菌株的引入和賴氨酸生產(chǎn)力的比較
[0051]使用電脈沖法，用pECCG117-cscK或pECCG117_mak載體轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KFCC10881，并挑選卡那霉素抗性克隆。
[0052]培養(yǎng)了用兩種來源于大腸埃希氏菌的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株和用上述丙酮丁醇梭菌來源的果糖激酶CFK (韓國專利第0564805號)轉(zhuǎn)化的菌株，并比較了它們的賴氨酸生產(chǎn)力。
[0053]將每種菌株接種到含有25ml種子培養(yǎng)基(加入了 25 μ Ι/ml的卡那霉素)的250ml角擋板瓶(corner-baffle flask)中，并在200rpm和30°C下震蕩培養(yǎng)20小時。此時,種子培養(yǎng)基(PH7.0)具有以下組份:蔗糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物10g、尿素5g、KH2P044g、K2HP048g、MgSO4.7Η200.5g、生物素100 μ g、鹽酸硫胺1000 μ g (基于IL的生產(chǎn)用水)。
[0054]接著，將Iml種子培養(yǎng)液接種到含有24ml生產(chǎn)培養(yǎng)基(加入了 25 μ Ι/ml的卡那霉素)的250ml角擋板瓶中，并在200rpm和30°C下振蕩培養(yǎng)72小時。此時，生產(chǎn)培養(yǎng)基(pH7.0)具有以下組分:蔗糖80g、糖蜜或預(yù)處理過的糖蜜(作為還原糖)20g、玉米漿 5g、(NH4) 2S0440g、尿素 4g、KH2PO4Ig' NaC12.5g、MgSO4.7H201g、FeSO4.7H2010mg、MnSO4.5Η2010π^、生物素 100 μ g、鹽酸硫胺 200 μ g、CaC0340g、L_ 亮氨酸 0.4g (如有必要)、L-蘇氨酸0.1g (如有必要)、L-甲硫氨酸0.1g (如有必要)(基于IL的生產(chǎn)用水)。
[0055]最后，結(jié)束培養(yǎng)，并通過HPLC測定L-賴氨酸的平均濃度(見表1)。
[0056]表1 [0057]依據(jù)引入的果糖激酶基因的L-賴氨酸濃度的比較(單位:g/L)
[0058]
實驗組j菌株Il-賴氨酸的平均濃度~
1KFCC10881/pECCG11732?9
2KFCC10881/pECCG117-cscK
3KFCC10881/pECCGII7-mak 35?4
4KFCC10881/pECCG-CFKΜΛ
[0059]如表1中所顯示，用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組2-4)比沒有用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組I)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。在用果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株中，用cscK或mak轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組2和3)比用已知的果糖激酶基因轉(zhuǎn)化的菌株(實驗組4)顯示更高的L-賴氨酸平均濃度。
[0060]因此，為了更有效地生產(chǎn)L-賴氨酸，使用來源于大腸埃希氏菌的果糖激酶基因比使用已知的果糖激酶基因更優(yōu)選。
[0061]實施例3:用于替代cscK基因啟動子的重組載體的構(gòu)建及染色體引入
[0062]為了將大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因引入棒桿菌的染色體內(nèi)，使用引入了棒桿菌的轉(zhuǎn)座子基因的載體PDZTn (韓國專利公開第2009-0107665號)作為基礎(chǔ)載體。從兩種大腸埃希氏菌來源的果糖激酶基因中挑選出了 cscK基因，因為其顯示高得多的賴氨酸生產(chǎn)力。將來源于棒桿菌的強啟動子連接到cscK基因起始密碼子的上游以增加其表達(dá)水平。
[0063]基于SEQ ID N0.17，僅擴增了 ORF區(qū)，并合成了具有5’端NdeI限制位點和3’端SpeI限制位點的引物(以下的SEQ ID N05和6)，且使用大腸埃希氏菌W菌株(ATCC9637)的染色體DNA作為模板來PCR擴增cscK基因的ORF (約900bp)。此時，使用與實施例1相同的方式進行PCR。
[0064]SEQ ID N0.5:5’ _atgccatatgtcagccaaagtatg_3’
[0065]SEQ ID N0.6:5’ _atgcactagtattacctgcctgtcg_3’
[0066]合成了能擴增產(chǎn)氨棒桿菌來源的pcj7啟動子并具有5’端SpeI限制位點和3’端NdeI限制位點的引物(以下的SEQ ID N0.7和8)，并使用產(chǎn)氨棒桿菌菌株的染色體DNA作為模板來PCR擴增約300bp的啟動子區(qū)。此時，在以下條件下進行PCR:包括94°C變性5分鐘，30個循環(huán)的94°C變性30秒、56 °C退火30秒、72 °C聚合30秒，隨后72°C聚合7分鐘。
[0067]SEQ ID N0.7:5’ _atgcactagtatagggagcgttgac_3’
[0068]SEQ ID N0.8:5’ _atgccatatgtgtttcctttcg_3’
[0069]此外，合成了能擴增谷氨酸棒桿菌來源的IysCPl啟動子并具有5’端SpeI限制位點和3’端NdeI限制位點的引物(以下的SEQ ID N0.9和10)，并使用谷氨酸棒桿菌菌株的染色體DNA作為模板來PCR擴增約300bp的啟動子區(qū)。此時，使用與上述的實施例3相同的方式進行PCR。
[0070]SEQ ID N0.9:5’ _ttcatatgtgtgcacctttcgatcta_3’
[0071]SEQ ID N0.10:5’-ttactagtgattgttaatgccgatgcta-3’
[0072]用SpeI和NdeI限制酶處理擴增的果糖激酶基因的多核苷酸和啟動子區(qū)的多核苷酸來獲得每種DNA片段。使用DNA連接酶，將啟動子和cscK基因的DNA片段連接到通過用限制酶SpeI處理pDZTn得到的DNA片段上，以構(gòu)建pDZTn-pc j7_cscK載體和pDZTn_lysCPl_cscK載體。
[0073]實施例4 =CSdi基因表達(dá)改良的菌株的賴氨酸生產(chǎn)力的比較
[0074]使用電脈沖法，用實施例3中制備的兩種表達(dá)載體——pDZTn-pcj7_cscK和PDZTn-lysCPl_cscK中的每種載體轉(zhuǎn)化L-賴氨酸生產(chǎn)菌株——谷氨酸棒桿菌KFCC10881。挑選在染色體的轉(zhuǎn)座子區(qū)具有果糖激酶基因啟動子替換的菌株，并以與實施例2中相同的方法進行培養(yǎng)。測定從中收集的L-賴氨酸的平均濃度(表2)。
[0075]表2
[0076]依據(jù)引入的啟動子的L-賴氨酸濃度的比較(單位:g/L)
[0077]
【權(quán)利要求】
1.用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其包含可操作地連接至基因表達(dá)單元的埃希氏菌(Escherichia sp.)來源的果糖激酶基因。
2.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述果糖激酶基因為cscK或mak。
3.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述果糖激酶基因具有SEQ ID N0.17或SEQ ID N0.18的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述基因表達(dá)單元被可操作地連接至載體，并通過轉(zhuǎn)化被包含在棒桿菌內(nèi)，或通過插入棒桿菌的染色體中被包含在棒桿菌內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述基因通過基因表達(dá)調(diào)控區(qū)的修飾而過表達(dá)。
6.如權(quán)利要求5所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述調(diào)控區(qū)為選自以下的啟動子:cscK啟動子、mak啟動子、pcj7啟動子、IysCPl啟動子、EF-Tu啟動子、groEL啟動子和aceAB啟動子。
7.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述L-氨基酸為L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒桿菌被用包含蘇氨酸生物合成相關(guān)基因和輸出相關(guān)基因的載體進一步轉(zhuǎn)化。
9.如權(quán)利要求8所述 的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述蘇氨酸生物合成相關(guān)基因為hom-thrB或hom_thrC,且所述蘇氨酸輸出相關(guān)基因為hom-thrE。
10.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒桿菌選自:谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)和發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium fermentum)。
11.如權(quán)利要求10所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒桿菌為L-賴氨酸生產(chǎn)菌株-谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KFCC10881。
12.如權(quán)利要求10所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述棒桿菌為谷氨酸生產(chǎn)菌株-谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)KTCC10774。
13.如權(quán)利要求1所述的用于生產(chǎn)L-氨基酸的棒桿菌(Corynebacteriumsp.),其中所述轉(zhuǎn)化的菌株具有登錄號KCCMl1183P。
14.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括以下步驟: (i)培養(yǎng)權(quán)利要求1至13中任一項所述的棒桿菌(Corynebacterium sp.);和 (?)從培養(yǎng)物中收集L-氨基酸。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述L-氨基酸為L-賴氨酸、L-蘇氨酸或L-谷氨酸。
16.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括以下步驟:(i)在包含鹿糖作為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1至13中任一項所述的棒桿菌(Corynebacterium sp.);和 (?)從培養(yǎng)物中收集L-氨 基酸。
【文檔編號】C12N1/21GK103476922SQ201280016303
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月1日
【發(fā)明者】裵賢原, 金亨俊, 文準(zhǔn)玉, 張在佑, 金鍾哲, 金泰韓, 成珍錫, 李庚翰, 金大哲, 金孝珍, 裵賢愛, 林相曹 申請人:Cj 第一制糖株式會社