自體誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng), 及其在利用腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)有用的代謝物中的用途
【專利摘要】本申請涉及利用經(jīng)過修飾以包含下述基因表達(dá)系統(tǒng)的腸桿菌科細(xì)菌，特別是屬于埃希氏桿菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)有用的代謝物的方法，所述的基因表達(dá)系統(tǒng)包含LysR型蛋白質(zhì)-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)(machinery)的元件，所述系統(tǒng)以下述方式被修飾，即，所述系統(tǒng)的自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)通過協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介。所述方法適合于生產(chǎn)支鏈L-氨基酸,特別是L-纈氨酸,L-異亮氨酸和L-亮氨酸；以及D-泛酸。
【專利說明】自體誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，及其在利用腸桿菌科細(xì)菌生產(chǎn)有用的 代謝物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，更具體而言，涉及通過腸桿菌科（Enterobacteriaceae) 細(xì)菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)有用的代謝物的方法，其中，所述細(xì)菌的LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的表達(dá)系 統(tǒng)已通過下述方式被修飾，即所述表達(dá)系統(tǒng)的功能由協(xié)誘導(dǎo)物（coinducer)介導(dǎo)，結(jié)果，增 強(qiáng)了由所述表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)水平。更具體而言，所述的表達(dá)系統(tǒng)和所述的方法 可用于提高來自L-氨基酸，例如支鏈L-氨基酸，合成途徑的代謝物的生產(chǎn)。

【背景技術(shù)】
[0002] -般地，L-氨基酸是利用由天然來源獲得的微生物的菌株或其突變體，通過發(fā)酵 的方法工業(yè)化生產(chǎn)。通常，要對所述的微生物進(jìn)行修飾，以提高L-氨基酸的產(chǎn)品收得率。
[0003] 已報道了很多提高L-氨基酸產(chǎn)品收得率的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物（參 見，例如，U. S. Patent No. 4, 278, 765)和例如啟動子，前導(dǎo)序列，和/或弱化子，或者其他 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的調(diào)節(jié)區(qū)的改變（參見，例如，US20060216796A1和W09615246A1)。其 他用于提高產(chǎn)品收得率的技術(shù)包括增加參與氨基酸生物合成的酶的活性和/或使被所得 的L-氨基酸反饋抑制的目標(biāo)酶脫敏（參見，例如，W09516042A1，EP0685555A1或U. S. Patent Nos. 4, 346, 170, 5, 661，012,和6, 040, 160)。例如，耐受L-纈氨酸反饋抑制的、突變體細(xì)菌 乙酰羥酸合酶I (也稱作乙酰乳酸合酶I，即下文中的AHAS I)已被用于改善相應(yīng)的L-氨基 酸生產(chǎn)菌株中支鏈L-氨基酸的生產(chǎn)（Russian Patent No. 2355763)。
[0004] 支鏈L-氨基酸（BCAAs)，如L-纈氨酸，L-亮氨酸，和L-異亮氨酸，的生物合 成通過分支生物合成途徑呈現(xiàn)。乙酰乳酸合酶（酶分類（EC)號2. 2. 1. 6)催化所述途 徑中的第一步反應(yīng)，其在全部三種氨基酸的生物合成途徑中是共同的。所述反應(yīng)包括 丙酮酸衍生的、活化的乙醛（2-(a-羥乙基）硫胺素二磷酸）與丙酮酸或2-氧代丁酸 (2-oxobutanoate)縮合，分別收獲2-乙酰乳酸（acetolactate，AL)或2-乙酰-2-輕基 丁酸（2-acet〇-2-hydroxybutanoate，AHB)。AL 是 L-纟顏氨酸和 L-亮氨酸的前體，AHB 是 L-異亮氨酸的前體。在大腸桿菌（E.coli)中，例如丙酮酸分子之間的反應(yīng)，以及丙酮酸分 子與2-氧代丁酸之間的反應(yīng)，被分別由ilvBN，ilvGM，和ilvIH基因編碼的三種AHAS同工 酶，AHAS I，AHAS II，和AHAS III催化。AHAS I和AHAS III是終產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸抑制（也 稱為反饋抑制）的靶。終產(chǎn)物反饋抑制在細(xì)菌內(nèi)這些途徑的生理控制中起主要作用。
[0005] AHAS催化的反應(yīng)的產(chǎn)物，AL或AHB，是2-乙酰輕酸異構(gòu)還原酶（acetohydroxy acid isomeroreductase)IlvC(EC 1.1.1.86)的底物，2_乙酰輕酸異構(gòu)還原酶IlvC由作為 ilvYC操縱子的成員的ilvC基因編碼。大腸桿菌的ilvYC操縱子是原型（prototypical) LysR蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的系統(tǒng)，其是細(xì)菌中最常見的正調(diào)節(jié)系統(tǒng)類型，存在于包括腸桿菌科到 根瘤菌科（Rhizobiaceae)的原核細(xì)菌科范圍（1^166 1(.￥.6七31.，？1'〇(3.似1:.4。3(1.3。;[. USA，1999, 96:14294-14299)。ilvY基因編碼LysR型調(diào)節(jié)蛋白IlvY，一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，其 以高度協(xié)作的方式與背馳-重疊（divergent-overlapping) ilvYC啟動子區(qū)的兩個串連的 操縱基因結(jié)合（圖1)。一旦結(jié)合所述的第一操縱基因區(qū)域，所述的IlvY調(diào)節(jié)物自體負(fù)調(diào)節(jié) (negatively auto-regulates)自ilvY啟動子的轉(zhuǎn)錄，因而弱化其自身的合成。除了這一 功能之外，IlvY還對ilvC基因的轉(zhuǎn)錄激活起關(guān)鍵作用。ilvC轉(zhuǎn)錄的激活需要IlvY調(diào)節(jié)物 與第二操縱基因區(qū)域的結(jié)合，以及協(xié)誘導(dǎo)物，如2-乙酰乳酸（AL)或2-乙酰-2-羥基丁酸 (AHB)，與在先形成的IlvY/DNA復(fù)合物的結(jié)合。一旦與協(xié)誘導(dǎo)物結(jié)合，所述的蛋白質(zhì)/DNA復(fù) 合物中出現(xiàn)構(gòu)象變化，其重塑ilvC啟動子的-35區(qū)并急劇提高RNA聚合酶結(jié)合能力（Rhee K. Y. et al.，J. Biol. Chem.，1998, 273:11257-11266)。
[0006] 在L-纈氨酸和L-亮氨酸生物合成中，2-乙酰乳酸（AL)通過IlvC蛋白轉(zhuǎn)化成 2, 3_ 二輕基 _3_ 甲基丁酸（2, 3-dihydroxy-3_methylbutanoate)(也稱作 2, 3_ 二輕基-異 戊酸（2, 3-dihydroxy-isovalerate, DHIV)(圖2)。在L-異亮氨酸生物合成中2-乙酰-2-輕 基丁酸（AHB)通過 IlvC 轉(zhuǎn)化成 2, 3_ 二輕基 _3_ 甲基戊酸（2, 3-dihydroxy-3_methylpent anoate)(也稱作 2, 3_ 二輕基-3-甲基戊酸（2, 3-dihydroxy-3_methylvalerate), DHMV)。
[0007] 最近，自體誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)因優(yōu)于常規(guī)遺傳方法增強(qiáng)所需基因表達(dá)而非常 引人注目。例如，有文獻(xiàn)提供了人工設(shè)計的、基于正反饋的基因表達(dá)系統(tǒng)，其能夠起到 遺傳信號放大器的作用，增強(qiáng)對于蛋白質(zhì)誘導(dǎo)物信號的靈敏度，且無需外部輔因子酰 基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL，也簡寫作HSL)而提高最高表達(dá)水平（Nistala G.J. et al.，J. Biol.Eng. ,2010,4:4)。所述的設(shè)計系統(tǒng)利用來自費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri)的、 細(xì)胞密度感受（QS)調(diào)節(jié)物L(fēng)uxR (lux操縱子）的組成性活性變體，其因 Ala221Val 點突變而不依賴自誘導(dǎo)物（8111：〇-；[11(111。61'，4見）（3350^0.]\6七31.，13；[0(3116111. Biophys.Res. Commun. , 2007, 363:667-673 ；Poellinger K.A.et al. , FEMS Microbiol Lett.，1995, 129:97-101)。具有微小變異的類似基因表達(dá)系統(tǒng)已被應(yīng)用于操控大腸桿 菌中的模型膜蛋白，細(xì)胞色素 bd醌醇氧化酶的表達(dá)動力學(xué)（Bansal K.et al.，J.Biol. Eng.，2010, 4:6)。
[0008] 基于來自費(fèi)氏弧菌（lux生物發(fā)光基因）的細(xì)胞密度感受機(jī)構(gòu)（machinery)、并依 賴于內(nèi)源性自誘導(dǎo)物（HSL)的所述的自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)的活化系統(tǒng)，已被應(yīng)用于表達(dá)重 組蛋白，如用于制備藥物組合物的抗原（W02010136897A2)。
[0009] 但是，到目前為止還未見關(guān)于下述LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)，以及所述 基因表達(dá)系統(tǒng)在生產(chǎn)來自L-氨基酸，如支鏈L-氨基酸，生物合成途徑和/或其分支途徑的 有用代謝物中的應(yīng)用，的相關(guān)數(shù)據(jù)報道，所述的LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)以所述 表達(dá)系統(tǒng)的功能通過協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介的方式被修飾。
[0010] 發(fā)明簡述
[0011] 本發(fā)明一方面提供包含LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的元件的基因表達(dá)系統(tǒng)， 所述系統(tǒng)以其自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)通過協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介的方式被修飾。
[0012] 本發(fā)明的另一方面提供腸桿菌科的細(xì)菌，其可能屬于埃希氏桿菌屬 (Escherichia),更具體而言，屬于大腸桿菌（Escherichia coli)種，所述細(xì)菌經(jīng)修飾以包 含上述的表達(dá)系統(tǒng)。
[0013] 本發(fā)明的另一方面提供用于生產(chǎn)有用的代謝物的方法，所述的代謝物例如，L-氨 基酸，如支鏈L-氨基酸或其鹽，特別是L-纈氨酸，L-異亮氨酸，和L-亮氨酸，或其鹽。該 目的通過對于編碼耐受L-纈氨酸的反饋抑制的突變型乙酰乳酸合酶的基因修飾的發(fā)現(xiàn)實 現(xiàn)，所述的修飾使得所述基因的表達(dá)受LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)，結(jié)果使得支鏈 L-氨基酸的產(chǎn)量增加，所述轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)中的表達(dá)通過由乙酰乳酸合酶反應(yīng)產(chǎn)生的協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn) 行中介。
[0014] 本發(fā)明的一方面提供基因表達(dá)系統(tǒng)，所述基因表達(dá)系統(tǒng)包含，包括啟動子和操縱 基因、其中的表達(dá)通過LysR型調(diào)節(jié)蛋白和協(xié)誘導(dǎo)物正調(diào)節(jié)的LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī) 構(gòu)，以及與所述轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)可操作連接的所關(guān)注的基因，其中，所關(guān)注的基因編碼參與所述協(xié) 誘導(dǎo)物，或所述協(xié)誘導(dǎo)物的底物或前體的生物合成的蛋白質(zhì)，由此，所述表達(dá)系統(tǒng)的自體誘 導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)由所述協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介。
[0015] 本發(fā)明的另一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)或假單胞菌科（Pseudomonadaceae)的細(xì)菌。
[0016] 本發(fā)明的又一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于腸桿菌科的 細(xì)菌。
[0017] 本發(fā)明的再一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于埃希氏桿菌 屬（Escherichia)的細(xì)菌。
[0018] 本發(fā)明的另外一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的細(xì)菌屬于大腸桿菌種。
[0019] 本發(fā)明的又一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自L-氨基酸的生物 合成途徑，所述L-氨基酸選自支鏈L-氨基酸，L-賴氨酸，L-半胱氨酸，L-甲硫氨酸，以及 L-色氨酸。
[0020] 本發(fā)明的再一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自支鏈L-氨基酸的 生物合成途徑。
[0021] 本發(fā)明的另一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的啟動子是PilvC啟動子， 所述的LysR型調(diào)節(jié)蛋白是IlvY蛋白，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是2-乙酰乳酸（acetolactatic acid)，2-乙酰-2-羥丁酸或其鹽。
[0022] 本發(fā)明的再一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是2-乙酰乳酸或 其鹽。
[0023] 本發(fā)明的又一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的所關(guān)注的基因編碼乙酰羥 酸合成酶。
[0024] 本發(fā)明的另一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的所關(guān)注的基因編碼選自下 述的蛋白質(zhì)：
[0025] ⑷下述Al和A2的組合：
[0026] (Al)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID NO:2的氨基酸序 列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與A2的蛋白質(zhì)在一起 具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和
[0027] (A2)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序 列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與Al的蛋白質(zhì)在一起 具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；
[0028] (B)下述Bl和B2的組合：
[0029] (BI)包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:6的氨基酸序 列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與B2的蛋白質(zhì)在一起 具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和
[0030] (B2)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序 列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與Bl的蛋白質(zhì)在一起 具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和
[0031] (C)下述Cl和C2的組合：
[0032] (Cl)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID NO:32的氨基酸 序列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與C2的蛋白質(zhì)在一 起具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和
[0033] (C2)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID NO:34的氨基酸 序列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與Cl的蛋白質(zhì)在一 起具有乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明的再一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的乙酰羥酸合成酶是耐受 L-纈氨酸反饋抑制的突變型乙酰乳酸合酶I。
[0035] 本發(fā)明的又一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的操縱基因包含與所述的 LysR型調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的區(qū)域。
[0036] 本發(fā)明的另外一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的LysR型調(diào)節(jié)蛋白選自：
[0037] (D)包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和
[0038] (E)變體蛋白，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘 基的取代，缺失，插入，或添加，并具有LysR型調(diào)節(jié)蛋白活性。
[0039] 本發(fā)明的再一方面提供上述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的啟動子包含：
[0040] (F)包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列的DNA ;或
[0041] (G)變體DNA，其包含SEQ ID NO: 30的核苷酸序列，但其包括一個或數(shù)個核苷酸殘 基的取代，缺失，插入，或添加，并具有SEQ ID NO: 30的核苷酸序列的活性。
[0042] 本發(fā)明的一個方面提供屬于腸桿菌科的、L-氨基酸-產(chǎn)生細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌 經(jīng)修飾以包含上述的表達(dá)系統(tǒng)。
[0043] 本發(fā)明的另一方面提供上述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌包含編碼LysR型調(diào)節(jié)蛋白 的基因。
[0044] 本發(fā)明的再一方面提供上述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌屬于埃希氏桿菌屬。
[0045] 本發(fā)明的又一方面提供上述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌屬于大腸桿菌種。
[0046] 本發(fā)明的另外一方面提供上述的細(xì)菌，其中，所述的L-氨基酸是支鏈L-氨基酸。
[0047] 本發(fā)明的再一方面提供上述的細(xì)菌，其中，所述的支鏈L-氨基酸選自L-纈氨酸， L-亮氨酸和L-異亮氨酸。
[0048] 本發(fā)明的一個方面提供生產(chǎn)支鏈L-氨基酸的方法，該方法包括：
[0049] ⑴在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的細(xì)菌，由此在所述的培養(yǎng)基中積累所述的支鏈L-氨基 酸；和
[0050] (ii)從所述的培養(yǎng)基中收集所述的支鏈L-氨基酸。
[0051] 本發(fā)明的另一方面提供用于生產(chǎn)上述的支鏈L-氨基酸的方法，其中，所述的支鏈 L-氨基酸選自：L-纈氨酸，L-亮氨酸，和L-異亮氨酸。
[0052] 附圖描述
[0053] 圖1顯示ilvY和ilvC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的示意圖。
[0054] IlvY是LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。
[0055] AL或AHB是協(xié)誘導(dǎo)物，2-乙酰乳酸或2-乙酰-2-羥基丁酸。
[0056] 01和02是操縱基因區(qū)域1和2。
[0057] TSilvc指iIvC基因的轉(zhuǎn)錄起點。
[0058] TSilvy指iIvY基因的轉(zhuǎn)錄起點。
[0059] 減號㈠ 指對基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)影響。
[0060] 加號（+)指對基因轉(zhuǎn)錄的正影響。
[0061] 圖2顯示從丙酮酸到L-纈氨酸的生物合成示意圖。
[0062] AL是2-乙酰乳酸。
[0063] DHIV是2, 3-二羥基-異戊酸。
[0064] AHAS是乙酰乳酸合酶。
[0065] IlvC 是異構(gòu)還原酶（isomeroreductase)。
[0066] 發(fā)明詳述
[0067] 以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0068] L 細(xì)菌
[0069] 短語"有用的代謝物"并不是特別的限定，只要所述的代謝物可以由酶促反應(yīng)或 生物合成途徑產(chǎn)生即可，其包括L-氨基酸，高級醇和D-泛酸。
[0070] 短語"生產(chǎn)L-氨基酸的細(xì)菌"可以指腸桿菌科的細(xì)菌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌 時，其具有產(chǎn)生L-氨基酸并使其在所述培養(yǎng)基中積累的能力。所述的生產(chǎn)L-氨基酸的能 力可以指所述細(xì)菌的下述能力，即，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌時，所述的細(xì)菌在培養(yǎng)基中 或細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)L-氨基酸，并使得所述L-氨基酸積累至能夠從所述的培養(yǎng)基或細(xì)菌細(xì) 胞中收集所述L-氨基酸的程度。
[0071] 短語"L-氨基酸"可包括L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-半 胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨 酸，L-甲硫氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和 L-纈氨酸。
[0072] 短語"分支L-氨基酸"可包括L-纈氨酸，L-亮氨酸和L-異亮氨酸。
[0073] 所述的細(xì)菌可能是固有地具備生產(chǎn)有用的代謝物，如L-氨基酸的能力，或者可能 是利用突變方法或DNA重組技術(shù)進(jìn)行修飾從而具有此種能力。
[0074] 屬于腸桿菌科的細(xì)菌可來自腸桿菌屬（Enterobacter)，歐文氏桿菌屬 (Erwinia),埃希氏桿菌屬（Escherichia),克雷白氏桿菌屬（Klebsiella), (Morganella), 泛菌屬（Pantoea),發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus),普羅威登斯菌屬（Providencia),沙門氏 菌屬（Salmonella),耶爾森氏菌屬（Yersinia),等等，并具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力。更具 體而言，可以利用根據(jù) NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫 (www. ncbi. nlm. nih. gov/ /Browser/wwwtax. cgi ? id = 543)中所使用的分類學(xué)被 分入腸桿菌科的那些細(xì)菌。可以被修飾的來自腸桿菌科的菌株示例包括，埃希氏桿菌屬，腸 桿菌屬或泛菌屬的菌株。
[0075] 可以被修飾以獲得本申請所公開的主題中的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的埃希氏 桿菌屬的細(xì)菌菌株沒有特別的限定，更具體而言，可以使用Neidhardt等人的工作 (Bachmann, B. J. , Derivations and genotypes of some 突變型 derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. In F. C. Neidhardt et al. (ed. ), E.coli and Salmonella:cellular and molecular biology,2nd ed. ASM Press,Washington,D.C.，1996)中所描述的那些。大 腸桿菌種是一個具體的示例。大腸桿菌的具體示例包括來自原型野生型菌株，K-12菌株的 大腸桿菌W3110(ATCC27325)，大腸桿菌MG1655(ATCC47076)等。這些菌株可以從，例如美 國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection ;P.0.Boxl549, Manassas, VA 20108, United States of America)獲得。S卩，每個菌株均有其登記號，可以利用這些登記 號訂購所述的菌株(請見www. atcc. orR)。所述菌株的登記號列于美國典型培養(yǎng)物保藏中 心的目錄中。
[0076] 腸桿菌屬細(xì)菌的示例包括成團(tuán)腸桿菌（Enterobacter agglomerans)，產(chǎn)氣腸桿 菌（Enterobacter aerogenes)等。泛菌屬（Pantoea)細(xì)菌的不例包括菠蘿泛菌（Pantoea ananatis)等。最近，根據(jù)16S rRNA核苷酸序列分析等，成團(tuán)腸桿菌的一些菌株被重新歸 類到成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans),菠蘿泛菌或斯獲氏泛菌（Pantoea stewartii)中。 只要是歸類于腸桿菌科的細(xì)菌，屬于腸桿菌屬或是泛菌屬的細(xì)菌都可以使用。可以使用經(jīng) 遺傳工程技術(shù)培育的菠蘿泛菌菌株，菠蘿泛菌AJ13355菌株（FERM BP-6614)，AJ13356菌株 (FERM BP-6615)，AJ13601菌株（FERM BP-7207)及其衍生物。在將這些菌株分離出來時，它 們曾被鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并作為成團(tuán)腸桿菌保藏。但是，如上所述，最近根據(jù)16S rRNA核 苷酸序列分析等，這些菌株被重新歸類為菠蘿泛菌。
[0077] 屬于假單胞菌科的細(xì)菌的示例可以是來自假單胞菌屬的細(xì)菌。假單胞菌屬的細(xì)菌 的示例包括惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)，銅綠假單胞菌（P. aeruginosa),和丁香 假單胞菌（P. syringae)。
[0078] 短語"經(jīng)修飾以包含所述表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)菌"可以指細(xì)菌，例如腸桿菌科的L-氨基 酸產(chǎn)生菌，其中，LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的表達(dá)系統(tǒng)被修飾為，所述系統(tǒng)的自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié) 功能通過協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介。例如，短語"經(jīng)修飾以包含所述表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)菌"可以指具有 生產(chǎn)L-氨基酸，如支鏈L-氨基酸，的能力的腸桿菌科細(xì)菌，其經(jīng)修飾而具有了所述基因表 達(dá)系統(tǒng)。
[0079] 支鏈L-氨某酸產(chǎn)牛菌
[0080] 短語"支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌"可以指，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌時，其具有生產(chǎn)并 使得所述培養(yǎng)基中積累支鏈L-氨基酸，如L-纈氨酸，L-亮氨酸和L-異亮氨酸，的能力。所 述的支鏈L-氨基酸，除了 L-纈氨酸，L-亮氨酸和L-異亮氨酸之外，還可以包括非天然的 支鏈L-氨基酸，如L-高亮氨酸和L-高異亮氨酸。可以通過培育（breeding)賦予或增強(qiáng) 所述的支鏈L-氨基酸生產(chǎn)能力。短語"支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌"還可以表示，與未經(jīng)修飾的 菌株，如野生型或親本菌株，相比，能夠生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累更大量的支鏈L-氨基酸的 細(xì)菌，也可以指能夠生產(chǎn)并在培養(yǎng)基中積累不低于0. 5g/L，甚或不低于I. Og/L的量的支鏈 L-氨基酸的細(xì)菌。
[0081] 所述的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌可以是腸桿菌科的細(xì)菌，通過包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白和 協(xié)誘導(dǎo)物的復(fù)合物正面影響乙酰乳酸合酶基因的表達(dá)，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是乙酰乳酸合酶催 化的反應(yīng)的產(chǎn)物。而且，所述的細(xì)菌可以是具有提高的突變型乙酰乳酸合酶活性的、腸桿菌 科的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌。具體而言，所述的細(xì)菌可以是腸桿菌科的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生 菌，其中，通過將所述調(diào)節(jié)區(qū)引入所述細(xì)菌，增強(qiáng)突變型乙酰乳酸合酶的活性，使得所述細(xì) 菌的支鏈L-氨基酸產(chǎn)量增加。所述細(xì)菌是屬于埃希氏桿菌屬的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌，其 中，所述細(xì)菌的支鏈L-氨基酸的產(chǎn)量可通過增強(qiáng)耐受L-纈氨酸反饋抑制的突變型乙酰乳 酸合酶的活性提高。
[0082] 所述的腸桿菌科支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌并不限于上述公開的細(xì)菌。更具體而言，所 述的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌也可以是L-纈氨酸，L-亮氨酸，和/或L-異亮氨酸-產(chǎn)生菌。
[0083] L-纈氨酸-產(chǎn)牛菌
[0084] 用于衍生L-纈氨酸-產(chǎn)生菌的親本菌株的示例，可包括但不限于，經(jīng)修飾以過表 達(dá)ilvGMEDA操縱子的菌株（U. S. Patent No. 5, 998, 178)。可以對弱化所需的、ilvGMEDA操 縱子區(qū)域進(jìn)行去除，以使得所述操縱子的表達(dá)不因其所產(chǎn)生的L-纈氨酸而弱化。此外，需 要破壞所述操縱子中的ilvA基因，以使得蘇氨酸脫氨酶活性降低。
[0085] 用于衍生L-纈氨酸-產(chǎn)生菌的親本菌株的示例還可包括具有氨基-?；鵷-RNA 合成酶突變的突變體（U.s. Patent No. 5,658,766)。例如，可使用E. coli VL1970,其具 有編碼異亮氨酸t(yī)RNA合成酶的ileS基因中的突變。E. coli VL1970已于1988年6月24 號，保藏于俄國國家工業(yè)微生物保藏中心（Russian National Collection of Industrial Microorganisms, VKPM ；Russian Federation, 117545Moscow, 1st Dorozhny Proezd, I),保 藏號VKPM B-4411。此外，需要用于生長的硫辛酸和/或缺少H+-ATP酶的突變株的也可以 用作親本菌株（W096/06926)。
[0086] 作為親本菌株，可以應(yīng)用屬于埃希氏桿菌屬的L-纈氨酸產(chǎn)生菌，如H-81 (VKPM B-8066)，NRRL B-12287 和 NRRL B-12288(US Patent N〇.4,391，907)，VKPM B-4411(US Patent No. 5, 658, 766)，VKPM B-7707 (歐洲專利申請 EP1016710A2)，NS1610 (參見，專利 EP1942183,實施例7和其中所提及的示例）等。
[0087] L-亮氨酸-產(chǎn)牛菌
[0088] 用于衍生L-亮氨酸-產(chǎn)生菌的親本菌株，可包括但不限于屬于埃希氏桿菌 屬的菌株，如耐受亮氨酸的大腸桿菌菌株（例如，菌株57(￥即118-7386川.5.?&仏1^ No. 6, 124, 121))或耐受亮氨酸類似物，包括P -2-噻嗯基丙氨酸，3-羥基亮氨酸，4-氮雜 亮氨酸，5, 5, 5-三氟亮氨酸的大腸桿菌菌株（JP62-34397B和JP8-70879A);在W096/06926 中描述的基因工程方法獲得的大腸桿菌菌株；大腸桿菌H-9068 (JP8-70879A)，等等。
[0089] 所述的細(xì)菌可通過增強(qiáng)一個或以上參與L-亮氨酸生物合成的基因的表達(dá)改良。 示例包括IeuABCD操縱子的基因，編碼異丙基蘋果酸合酶的突變型IeuA基因不受L-亮氨 酸反饋抑制可作為其例證（US Patent6, 403, 342)。此外，所述的細(xì)菌可通過增強(qiáng)一個或以 上編碼用于從細(xì)菌細(xì)胞排出L-氨基酸的蛋白質(zhì)的基因來改良。此種基因的示例包括b2682 和 b2683 基因 （ygaZH 基因）（EP1239041A2)。
[0090] 作為親本菌株，可以使用屬于埃希氏桿菌屬的L-亮氨酸產(chǎn)生菌，如 H-9070(FERM BP-4704)和 H-9072(FERM BP-4706)(US5744331)，VKPM B-7386 和 VKPM B-7388(RU2140450), W1485atpA401/pMffdAR6, W14851ip2/pMffdAR6,以及 AJ12631/ pMWdAR6(EP0872547)等。
[0091] L-異亮氨酸-產(chǎn)牛菌
[0092] 用于衍生L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的親本菌株，可包括但不限于，耐受6-二甲基氨基 嘌呤的突變株（JP5-304969A)，耐受異亮氨酸類似物，如硫代異亮氨酸（thiaisoleucine) 和異亮氨酸氧肟酸的突變株，以及還耐受DL-乙基硫氨酸和/或精氨酸氧肟酸的突變株 (JP5-130882A)。此外，用編碼參與L-異亮氨酸生物合成的蛋白質(zhì)，如蘇氨酸脫氨酶和乙 酰輕酸合酶（acetohydroxate synthase),的基因轉(zhuǎn)化的重組菌株，也可以用作親本菌株 (JP2-458A，F(xiàn)R0356739,和 U. S. Patent No. 5, 998, 178)。
[0093] 作為親本菌株，可以使用屬于埃希氏桿菌屬的L-異亮氨酸產(chǎn)生菌，如 菌株（NZ10)TDH6/pVIC40，pMWD5(Hashiguchi K.et al，Biosci. Biotechnol. Biochem.，1999,63(4) :672-679)或歐洲專利申請 EP685555A1 中所描述的菌株 AJ12919， 等。
[0094] 高級醇和D-泛酸-產(chǎn)牛菌
[0095] 所述的腸桿菌科L-氨基酸產(chǎn)生菌，更具體而言，腸桿菌科的支鏈L-氨基酸產(chǎn)生菌 可用于生產(chǎn)高級醇和有機(jī)酸，以及它們的衍生物。例如，高級醇如異丁醇，2-甲基-1-丁醇， 和3-甲基-1-丁醇；有機(jī)酸，如D-泛酸（維生素 B5)可以利用這樣的細(xì)菌生產(chǎn)。
[0096] 本領(lǐng)域已知，在腸桿菌科的細(xì)菌中，L-纈氨酸，L-亮氨酸和L-異亮氨酸的生物合 成途徑通過酮酸中間體進(jìn)行。更具體而言，2-氧代異戊酸（2-酮基異戊酸，2-KIV)是L-纈 氨酸和L-亮氨酸的前體；2-氧代丁酸（oxobutanoate)是L-異亮氨酸的前體。本領(lǐng)域還 已知，由于Ehrlich降解途徑酮酸中間體或其衍生物可作為帶有兩個碳原子以上的碳鏈的 高級醇的前體（Yan Y. and Liao J.C.J. Ind. Microbiol. Biotechnol. ,2009, 36:471-479)。 例如，2-氧代異戊酸是異丁醇的前體，衍生物4-甲基-2-氧代戊酸是3-甲基-1-丁醇的 前體；2_氧代丁酸是正丙醇的前體。2-氧代丁酸的衍生物3-甲基-2-氧代戊酸是2-甲 基_1_ 丁醇的如體。
[0097] 可通過將來自于宿主微生物的寬底物范圍（broad-substrate-range)酮酸脫羧 酶（KDC)和乙醇脫氫酶（ADH)編碼基因（kivd和adh2)引入原本不具備生產(chǎn)高級醇能力 的大腸桿菌菌株賦予其生產(chǎn)高級醇的能力。例如，可以使用來自枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)的kivd基因，和來自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis)的adh2基因。這一方 面可以參考文獻(xiàn) Connor M. R?和 Liao J.C.，Appl. Env. Mocrobiol. ,2008, 74:5769-5775; 以及專利申請W02009046370A2。
[0098] 因此，通過將所述的基因表達(dá)系統(tǒng)以及來自宿主微生物的合適的異源基因，例如， kivd和adh2或它們的變體引入腸桿菌科的L-氨基酸產(chǎn)生菌，可以賦予所述的細(xì)菌生產(chǎn)高 級醇，如異丁醇，3-甲基-1-丁醇，和2-甲基-1-丁醇的能力。
[0099] 本領(lǐng)域已知，在腸桿菌科的細(xì)菌中，2-氧代異戊酸是D-泛酸的前體，因而，利用所 述的基因表達(dá)系統(tǒng)修飾腸桿菌科的細(xì)菌，即可賦予所述的細(xì)菌生產(chǎn)D-泛酸的能力。
[0100] 2.表汰系統(tǒng)
[0101] 所述的表達(dá)系統(tǒng)可以是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其包括LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī) 構(gòu)的元件。所述LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的元件可以包括啟動子，操縱基因，其中的 表達(dá)受到LysR型調(diào)節(jié)蛋白和協(xié)誘導(dǎo)物的正調(diào)節(jié)。
[0102] 所述表達(dá)系統(tǒng)還可以包括與上述轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)可操作連接的、所關(guān)注的基因。短語〃 可操作連接〃指所關(guān)注的基因與調(diào)節(jié)序列，如啟動子和操縱基因以允許所述基因表達(dá)的方 式連接。
[0103] 所述所關(guān)注的基因可編碼參與所述協(xié)誘導(dǎo)物，或所述協(xié)誘導(dǎo)物的底物或前體的生 物合成的蛋白質(zhì)。
[0104] 根據(jù)以上描述的表達(dá)系統(tǒng)的設(shè)計，所述系統(tǒng)的表達(dá)可以是自體誘導(dǎo)的并可被正反 饋調(diào)節(jié)，所述的正反饋調(diào)節(jié)由協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是在所關(guān)注基因的表達(dá) 產(chǎn)物參與下產(chǎn)生的。此種表達(dá)系統(tǒng)可被稱為"自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)"，但簡便起見， 也可以簡稱作表達(dá)系統(tǒng)。所述的表達(dá)系統(tǒng)可由協(xié)誘導(dǎo)物正反饋自體調(diào)節(jié)，所述的協(xié)誘導(dǎo)物 可能是生物合成途徑，更具體而言，支鏈L-氨基酸生物合成途徑和/或其支鏈途徑，中有用 的代謝物的底物或前體。
[0105] 所述的"LysR型調(diào)節(jié)蛋白"也可稱作"LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物（LTTR) "，LysR家族 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物，或簡單地稱為"調(diào)節(jié)物"。所述的LysR型調(diào)節(jié)蛋白可能屬于調(diào)節(jié)響應(yīng)多 種環(huán)境信號的多種的轉(zhuǎn)錄單元的、多樣的寡聚細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族的成員可以 作為轉(zhuǎn)錄激活物和/或轉(zhuǎn)錄阻抑物，并具有若干共同的結(jié)構(gòu)特征，如Schell M. A.，Ann. Rev. Microbiol.，1993,47:597-626中所述的，i)DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，應(yīng)用螺旋-轉(zhuǎn)角-螺 旋基序（可以是LTTR的N-末端的第1-65位的殘基），（ii)參與所述協(xié)誘導(dǎo)物識別和 /或應(yīng)答的結(jié)構(gòu)域（可以是第100-173以及第196-206位殘基），和（iii)DNA結(jié)合和 協(xié)誘導(dǎo)物應(yīng)答所需的結(jié)構(gòu)域（可以是第227-253位殘基）。如Schell M.A.，Ann. Rev. Microbiol.，1993,47:597-626中所述，不存在協(xié)誘導(dǎo)物時，LTTR可經(jīng)由具有共同結(jié)構(gòu) 和位置（-65附近）的15-bp二聯(lián)體區(qū)域與調(diào)節(jié)啟動子結(jié)合。存在協(xié)誘導(dǎo)物時，可能出 現(xiàn)LTTR與-35RNA聚合酶結(jié)合位點和/或DNA彎曲（bending)附近區(qū)域的額外相互作 用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄激活作用（Schell M.A., Ann. Rev. Microbiol. ,1993, 47:597-626)。此外， LysR型調(diào)節(jié)蛋白家族的一些元件可能具有四種另外的功能性特征，如：（i)是多種大小的 協(xié)誘導(dǎo)物-應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物蛋白，如276-324氨基酸殘基范圍，（ii)不依賴于協(xié)誘導(dǎo)物 的存在，與具有類似的位置和結(jié)構(gòu)基序的操縱基因 DNA區(qū)域調(diào)節(jié)的靶結(jié)合，（iii)被從非 常接近被調(diào)節(jié)的所關(guān)注的基因的啟動子或與之重疊的啟動子分叉（divergently)轉(zhuǎn)錄， 和（iv)以不同的程度阻抑它們自身的轉(zhuǎn)錄，如3-到10-倍，即如Schell M.A.，Ann. Rev. Microbiol.，1993, 47:597-626 所述的、自體負(fù)調(diào)節(jié)。
[0106] 例如，但不限于，所述的表達(dá)系統(tǒng)可包括LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)，其包括 自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)啟動子和操縱基因，以及所關(guān)注的基因。所述的表達(dá)系統(tǒng)受LysR型 調(diào)節(jié)蛋白和協(xié)誘導(dǎo)物正調(diào)節(jié)。自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)的示例可包括Pilvc啟動子。所述LysR 型調(diào)節(jié)蛋白的示例可包括IlvY蛋白。協(xié)誘導(dǎo)物的示例可包括2-乙酰-2-羥基羧酸的成 員，如2-乙酰乳酸（AL)，2-乙酰-2-羥丁酸（AHB，也稱作2-乙酰-2-羥基丁酸）及其鹽。 所關(guān)注的基因的示例可包括編碼乙酰乳酸合酶I，II和/或III的基因，或其突變型變體。 示例性的表達(dá)系統(tǒng)可以示意圖的形式描述，不對其類型，數(shù)量以及所述表達(dá)系統(tǒng)的元件的 排布進(jìn)行限定。
[0107] 圖1中，所述的ilvY和ilvC基因并列反向排列，ilvY和ilvC基因的轉(zhuǎn)錄分別由 反向重疊（divergent-overlapping)啟動子ilvY和ilvC起始。但是，詞語〃ilvC啟動子 〃或"Pilv。啟動子〃可包含ilvY和ilvC啟動子的含義。在所述的啟動子區(qū)域內(nèi)有兩個串 連的操縱基因（圖1)。
[0108] 所述所關(guān)注的基因與所述轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)，更具體地，與啟動子，可操作連接。例如，當(dāng)所 關(guān)注的基因是編碼乙酰乳酸合酶I的ilvBN基因，且所述的啟動子是ilvC啟動子時，位于 ilvBN基因上游的天然啟動子區(qū)域被包括ilvC基因的誘導(dǎo)型啟動子以及第二操縱基因區(qū) 域的DNA片段替換，所述基因的表達(dá)受控于所述的啟動子。例如，編碼耐受L-纈氨酸反饋抑 制的AHAS I的ilvBM操縱子上的基因被置于ilvC啟動子控制之下，其只有在AL或AHB， 所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物IlvY，以及所述第二操縱基因區(qū)域之間的復(fù)合物形成時才成為轉(zhuǎn)錄活化 的。包括Pilvc啟動子和ilvBM操縱子基因的表達(dá)盒使得ilvBM基因被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生AHAS I。所述的AHAS將2摩爾的丙酮酸轉(zhuǎn)化成1摩爾的2-乙酰乳酸（AL)，或依賴于2-氧代丁 酸的存在，將1摩爾的丙酮酸和1摩爾的2-氧代丁酸轉(zhuǎn)化成1摩爾的2-乙酰-2-羥基丁 酸（娜)。
[0109] 作為本發(fā)明的一種有益效果，一部分的AHAS I催化的反應(yīng)產(chǎn)物（AL或AHB)作為 協(xié)誘導(dǎo)物，結(jié)合于IlvY/DNA復(fù)合物，誘導(dǎo)ilvBM操縱子基因的轉(zhuǎn)錄，由此提供AL或AHB的 合成。另一部分的AL或AHB可通過乙酮醇酸還原異構(gòu)酶IlvC以及上述分支L-氨基酸生 物合成途徑中其他的酶，轉(zhuǎn)化進(jìn)入終產(chǎn)物支鏈L-氨基酸（L-纈氨酸，L-亮氨酸或L-異亮 氨酸）。
[0110] 持續(xù)地向所述表達(dá)系統(tǒng)提供2-乙酰乳酸或2-乙酰-2-羥基丁酸可解釋其自體誘 導(dǎo)性質(zhì)；通過所述自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)可重復(fù)的循環(huán)可導(dǎo)致向支鏈L-氨基酸生 物合成途徑持續(xù)提供前體，如用于L-纈氨酸的3-羥基-3-甲基-2-氧代丁酸，用于L-異 亮氨酸的L-亮氨酸或3-羥基-3-甲基-2-氧代戊酸。
[0111] 所建議的基因表達(dá)方法可稱為具有協(xié)誘導(dǎo)物AL或AHB介導(dǎo)的正反饋調(diào)節(jié)的自體 誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)。
[0112] 所述的自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)表達(dá)系統(tǒng)并不限于包括上述IlvY轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的表達(dá) 系統(tǒng)。還可以包括其他利用LysR型調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，其示例列于表1。
[0113] 表I. LysR型調(diào)節(jié)蛋白
[0114]

【權(quán)利要求】
1. 基因表達(dá)系統(tǒng)，包括： LysR型蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)，其包含啟動子和操縱基因，該操縱基因的表達(dá)受LysR 型調(diào)節(jié)蛋白和協(xié)誘導(dǎo)物正調(diào)節(jié)，和 所關(guān)注的基因，其與所述轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)可操作連接，其中，所述所關(guān)注的基因編碼參與所述 協(xié)誘導(dǎo)物，或所述協(xié)誘導(dǎo)物的底物或前體的生物合成的蛋白質(zhì)， 由此，所述表達(dá)系統(tǒng)的自體誘導(dǎo)正反饋調(diào)節(jié)由所述協(xié)誘導(dǎo)物進(jìn)行中介。
2. 權(quán)利要求1所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)或假單胞菌科（Pseudomonadaceae)的細(xì)菌。
3. 權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于腸桿菌科的細(xì)菌。
4. 權(quán)利要求3所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自屬于埃希氏桿菌屬 (Escherichia)的細(xì)菌。
5. 權(quán)利要求4所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的細(xì)菌屬于大腸桿菌（Escherichia coli) 種。
6. 權(quán)利要求1至5任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自L-氨基酸的生物合 成途徑，所述L-氨基酸選自支鏈L-氨基酸，L-賴氨酸，L-半胱氨酸，L-甲硫氨酸，以及 L-色氨酸。
7. 權(quán)利要求6所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的系統(tǒng)來自支鏈L-氨基酸的生物合成途徑。
8. 權(quán)利要求1至7任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的啟動子是Pilv。啟動子，所 述的LysR型調(diào)節(jié)蛋白是IlvY蛋白，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是2-乙酰乳酸（acetolactatic acid)，2-乙酰-2-羥丁酸或其鹽。
9. 權(quán)利要求8所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的協(xié)誘導(dǎo)物是2-乙酰乳酸或其鹽。
10. 權(quán)利要求1至9任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的所關(guān)注的基因編碼乙酰羥酸 合成酶。
11. 權(quán)利要求10所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的所關(guān)注的基因編碼選自下述的蛋白質(zhì)： (A) 下述A1和A2的組合： (A1)包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:2的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與A2的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和 (A2)包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與A1的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)； (B) 下述B1和B2的組合： (B1)包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與B2的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和 (B2)包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與B1的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和 (C) 下述C1和C2的組合： (Cl)包含SEQ ID N0:32的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:32的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與C2的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)；和 (C2)包含SEQ ID N0:34的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或包含SEQ ID N0:34的氨基酸序列， 但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，或添加，并與C1的蛋白質(zhì)在一起具有 乙酰乳酸合酶活性的蛋白質(zhì)。
12. 權(quán)利要求11所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的乙酰羥酸合成酶是耐受L-纈氨酸反饋 抑制的突變型乙酰乳酸合酶I。
13. 權(quán)利要求1至12任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的操縱基因包含與所述的 LysR型調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合的區(qū)域。
14. 權(quán)利要求1至13任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的LysR型調(diào)節(jié)蛋白選自： (D) 包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和 (E) 變體蛋白，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，但其包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的 取代，缺失，插入，或添加，并具有LysR型調(diào)節(jié)蛋白活性。
15. 權(quán)利要求1至14任一項所述的表達(dá)系統(tǒng)，其中，所述的啟動子包含： (F) 包含SEQ ID N0:30的核苷酸序列的DNA ;或 (G) 變體DNA，其包含SEQ ID N0:30的核苷酸序列，但其包括一個或數(shù)個核苷酸殘基的 取代，缺失，插入，或添加，并具有SEQ ID NO: 30的核苷酸序列的活性。
16. 屬于腸桿菌科的L-氨基酸產(chǎn)生菌，其中，所述的細(xì)菌經(jīng)修飾以包含權(quán)利要求1至 15任一項的表達(dá)系統(tǒng)。
17. 權(quán)利要求16所述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌包含編碼LysR型調(diào)節(jié)蛋白的基因。
18. 權(quán)利要求16所述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌屬于埃希氏桿菌屬。
19. 權(quán)利要求18所述的細(xì)菌，其中，所述的細(xì)菌屬于大腸桿菌種。
20. 權(quán)利要求16至19任一項所述的細(xì)菌，其中，所述的L-氨基酸是支鏈L-氨基酸。
21. 權(quán)利要求20所述的細(xì)菌，其中，所述的支鏈L-氨基酸選自L-纈氨酸，L-亮氨酸， 以及L-異亮氨酸。
22. 生產(chǎn)支鏈L-氨基酸的方法，該方法包括： (i) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求20的細(xì)菌，由此在所述的培養(yǎng)基中積累所述的支鏈L-氨 基酸；和 (ii) 從所述的培養(yǎng)基中收集所述的支鏈L-氨基酸。
23. 權(quán)利要求22所述的生產(chǎn)支鏈L-氨基酸的方法，其中，所述的支鏈L-氨基酸選自 L-纈氨酸，L-亮氨酸，以及L-異亮氨酸。
【文檔編號】C12N15/70GK104334729SQ201380018978
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年4月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月2日
【發(fā)明者】E.V.西切瓦, V.V.薩姆索諾夫, E.A.薩夫拉索娃, N.S.埃爾米娜, N.V.格拉斯基納, N.V.斯托伊諾瓦 申請人:味之素株式會社