專利名稱：萊氏野村菌微菌核誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑領(lǐng)域，具體的說，涉及一種萊氏野村菌微菌核誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
斜紋夜蛾屬鱗翅目夜蛾科的一種世界性分布的暴食性農(nóng)業(yè)害蟲，危害藤菜、蓮藕和十字花科多種蔬菜作物達(dá)99科290多種，是我國蔬菜安全生產(chǎn)的重大威脅，造成蔬菜作物大量減產(chǎn)和質(zhì)量下降。目前害蟲防控主要依靠化學(xué)防治，化學(xué)農(nóng)藥的大量施用導(dǎo)致斜紋夜蛾等夜蛾科害蟲抗藥性產(chǎn)生，并且污染生態(tài)環(huán)境、影響蔬菜農(nóng)產(chǎn)品安全、威脅人民身體健康，還大量殺傷害蟲天敵，破壞生態(tài)平衡。近年來，以綠僵菌、白僵菌為代表的真菌生物農(nóng)藥是國際上微生物農(nóng)藥研究的熱點(diǎn)之一，具有使用安全、不污染環(huán)境、可擴(kuò)散流行和害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。蟲生真菌主要類群為絲狀真菌，通常產(chǎn)生菌絲體和分生孢子，少數(shù)種類也可產(chǎn)生厚垣孢子。有的植物病原真菌如油菜核盤菌、棉花黃萎病菌等的生活史后期往往在寄主組織內(nèi)由菌絲體糾集形成菌核或微菌核等休眠結(jié)構(gòu)，以度過不良環(huán)境，作為再次接種體感染靶標(biāo)害蟲。萊氏野村菌YNomir腿rileyi (Farlow)]屬于真菌界、子囊菌門、酵母菌亞門、盤菌綱、糞殼菌綱、肉座菌亞綱、肉座菌目、麥角菌科、野村菌屬，是一種世界性廣泛分布的蟲生真菌，可以感染多種鱗翅目害蟲，特別是對多種危害較大的斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、粉紋夜蛾、棉鈴蟲和煙青蟲等夜蛾科害蟲具有很高的生物活性。目前國內(nèi)外關(guān)于絲狀真菌微菌核自然形成的報(bào)道寥寥無幾，僅見于棉花黃萎病的大麗輪枝菌、微菌核鏈霉菌、向日葵炭腐菌，未見萊氏野村菌大量誘導(dǎo)產(chǎn)生微菌核的方法。萊氏野村菌微菌核具有耐熱、耐旱、抗逆性好、殺蟲毒力強(qiáng)等特點(diǎn)。但與目前大量生產(chǎn)使用的絲狀真菌基于孢子粉菌體的制劑相比， 野村菌產(chǎn)孢因需要光照刺激、產(chǎn)孢條件苛刻、產(chǎn)孢周期長，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高，產(chǎn)業(yè)化難度大。而液體發(fā)酵產(chǎn)生的芽生孢子因不耐儲(chǔ)存，殺蟲活性降低等缺陷，嚴(yán)重制約了萊氏野村菌的規(guī)模化生產(chǎn)。因此有必要開發(fā)侵染活力高、抗逆性強(qiáng)的萊氏野村菌微菌核粉或高孢粉，為殺蟲真菌制劑的創(chuàng)制提供高質(zhì)量的母藥或原粉，解決該菌液固兩相發(fā)酵中的技術(shù)難題，已成為國內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化研究的熱點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可大規(guī)模生產(chǎn)的萊氏野村菌微菌核誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法， 所制得沉淀微菌核和菌體具有侵染活力高、抗逆性強(qiáng)的特性。本發(fā)明具體按如下步驟進(jìn)行
(1)把萊氏野村菌菌種活化，待用；
(2)接種體制備將活化的野村菌接種于SMAY培養(yǎng)基上，在25 下連續(xù)光照培養(yǎng) 144-192h，用0. 1% 0. 5%的Tween80水溶液將平板上的孢子或菌絲體洗下，配備萊氏野村菌接種體懸浮液；(3)液體發(fā)酵誘導(dǎo)將接種體加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得的發(fā)酵液過濾， 棄去上清液，得到沉淀微菌核和菌體，干燥，保存；
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液單位體積內(nèi)所含有的各種原料干物質(zhì)重量如下葡萄糖l(T50g/L，酵母膏 5 10g/L，蛋白胨 2 5g/L，KH2P04 3 5g/L，CaCl2. 2Η20 0· 7 0. 9g/L，MgS04. 7H20 0· 5 0. 7g/L，F(xiàn)eSO4. 7H20 0· 1 0. 2g/L, CoCl2. 6H20 35 40mg/L, MnSO4. H2O 15 20mg/ L，ZnSO4. 7H20 15 20mg/L，脫離子水配制；
上述液體發(fā)酵的工藝條件為培養(yǎng)基？11=5.4 6.5，溫度為2318°C，搖床轉(zhuǎn)速為 200 250rpm或者發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為80 lOOrpm，培養(yǎng)時(shí)間為144 19濁。作為優(yōu)化，上述誘導(dǎo)培養(yǎng)液單位體積內(nèi)所含有的各種原料干物質(zhì)重量如下葡萄糖 10 40g/L、酵母浸膏 5. O 8. Og/L、蛋白胨 2 3g/L、KH2PO4 3 4g/L、Cacl2. 2H20 0. 7 0. 8g/L、MgSO4. 7H20 0. 6 0. 7g/L、FeSO4. 7H20 0. Γθ. 2g/L、CoCl2. 6H20 36 37mg/L、 MnSO4. H2O 16 18mg/L、ZnSO4. 7H20 16 18mg/L，脫離子水配制；上述液體發(fā)酵的工藝條件為培養(yǎng)基pH=5. 5 6. 0，溫度為25 26°C，搖床轉(zhuǎn)速為250rpm或者發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為lOOrmp， 培養(yǎng)時(shí)間為150 19 ；所得到的沉淀微菌核和菌體可以用凍干粉保存。傳統(tǒng)的野村菌產(chǎn)孢需要光照刺激、產(chǎn)孢條件苛刻、產(chǎn)孢周期長、生產(chǎn)成本高，產(chǎn)業(yè)化難度大，而且芽生孢子不耐儲(chǔ)存，殺蟲活性低等缺點(diǎn)。本發(fā)明對產(chǎn)孢條件進(jìn)行了優(yōu)化，可以大量生產(chǎn)萊氏野村菌休眠體微菌核的方法， 本發(fā)明中所用的液體發(fā)酵工序操作簡單，發(fā)酵液易于配制，重復(fù)性好，所用的原料易于獲取，操作工藝簡單，易于控制，產(chǎn)生的休眠結(jié)構(gòu)微菌核性能穩(wěn)定，易于保存，具有很強(qiáng)的殺蟲生物活性，可以進(jìn)行大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。微菌核是蟲生真菌度過高溫、低溫或干旱等不良環(huán)境的休眠體，是菌絲體互相糾結(jié)，菌絲變態(tài)分化產(chǎn)生的顏色加深、質(zhì)地堅(jiān)硬的菌絲組織體，能夠在條件合適時(shí)，重新萌動(dòng)長出菌絲體。微菌核具有抗逆耐儲(chǔ)、能夠適應(yīng)高溫、干旱等外界不良環(huán)境的特點(diǎn)。微菌核作為生物制劑的有效成分，可用于規(guī)?；a(chǎn)新型殺蟲真菌農(nóng)藥。有益效果
本發(fā)明所用的培養(yǎng)液的配制和液體發(fā)酵工序可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，所用原料易于獲取，產(chǎn)生的休眠結(jié)構(gòu)微菌核性能穩(wěn)定，易于保存，具有很強(qiáng)的殺蟲生物活性，本方法可以大批量生產(chǎn)、發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，為野村菌等蟲生真菌制劑的規(guī)?；a(chǎn)提供了新的方法。


圖1為萊氏野村菌CQNrOl菌株液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)48h的顯微觀察； 圖2為萊氏野村菌CQNrOl菌株液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)96h的顯微觀察；
圖3為萊氏野村菌CQNrOl菌株液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)144h的顯微觀察； 圖4為萊氏野村菌CQNrOl菌株液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)19 的顯微觀察。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本發(fā)明誘導(dǎo)萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的方法如下(1)萊氏野村菌的取材
所用萊氏野村菌菌株分離純化自重慶沙坪壩區(qū)蔬菜地斜紋夜蛾幼蟲僵蟲體表菌體，經(jīng)形態(tài)與分子鑒定為萊氏野村菌OVofiK/raea rileyi)菌株編號為=CQNrOl。(2)菌種活化
采用SMAY培養(yǎng)基進(jìn)行活化，pH為5. 5，SMAY培養(yǎng)基配制為麥芽糖40g/L、酵母粉15g/ L、蛋白胨10g/L、瓊脂粉20g/L。(3)接種體的制備
將萊氏野村菌CQNrOl接種到SMAY平板上，在25 °C、光照條件下培養(yǎng)192h，用0. 3% TweenSO溶液將平板上的孢子和/菌體洗下，調(diào)節(jié)懸浮液濃度，制備成1. 0 X IO7孢子/毫升的接種體懸浮液。(4)誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方
葡萄糖:20g/L,酵母膏:6g/L,蛋白胨:6g/L, KH2PO4:4. 0 g/L，CaCl2. 2Η20:0· 8g/ L, MgSO4. 7H20:0. 6/L, FeSO4. 7H20:0. Ig /L, CoCl2. 6H20 :37mg/L，MnSO4. H20:16mg/L, ZnSO4. 7H20:Hmg/L，脫離子水配制；將液體培養(yǎng)液分別以IOOmL的量分裝到250mL三角瓶中，調(diào)節(jié)PH值為5. 5，進(jìn)行121°C高溫高壓滅菌30分鐘。冷卻后接種。(5)液體發(fā)酵工藝為
按照1:100的體積比把萊氏野村菌CQNrOl的接種體接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵工藝條件為培養(yǎng)基pH=5. 5，溫度為25°C，搖床轉(zhuǎn)速為230rpm，培養(yǎng)時(shí)間為19池。(6)萊氏野村菌微菌核的培養(yǎng)形態(tài)與休眠結(jié)構(gòu)觀察
將萊氏野村菌菌株按照上述方法進(jìn)行液體發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)，每天觀察液體培養(yǎng)基中的微菌核產(chǎn)生狀況。接種后振蕩培養(yǎng)Μ、》ι后，分生孢子萌發(fā)形成菌絲，菌液顏色未見變化，而培養(yǎng)液粘度及菌體生物量逐漸增加，4 如圖1所示；培養(yǎng)7 后后菌液開始變混濁，此時(shí)菌懸液中的菌量繼續(xù)增加，部分菌絲體前端開始膨大，明顯加粗；在光學(xué)顯微鏡下觀察未見微菌核產(chǎn)生，；培養(yǎng)后，發(fā)酵菌液逐漸變紅而粘稠，取樣在顯微鏡下觀察，可見由數(shù)十個(gè)細(xì)胞的微菌核休眠結(jié)構(gòu)。微菌核呈褐紅色，邊緣光滑，中間緊密，如圖2所示；培養(yǎng)144h后， 菌液變得更加粘稠，顏色呈深紅色，微菌核數(shù)量劇烈增加，有少量的微菌核周圍開始萌發(fā)菌絲，如圖3所示；19 后微菌核數(shù)量不再明顯增加，部分微菌核四周形成細(xì)長的菌絲，如圖4 所示；用此法產(chǎn)生的微菌核經(jīng)過干燥后進(jìn)行生物學(xué)特性測定，具有明顯的侵染活性和抗逆性。(7)將所得萊氏野村菌CQNrOl的發(fā)酵液分別過濾，棄去上清液，得到沉淀微菌核和菌體，低溫干燥，計(jì)數(shù)保存。(8)通過以上方法所得出的微菌核數(shù)量在72h、96h、120h、144h和192h分別為0、 2. 5 X 104、4· 0 X ΙΟ6、1· 9 X IO8 個(gè) /mL 和 2. O X IO8 個(gè) /mL。實(shí)施例2
本實(shí)施例其他的步驟與實(shí)施例1完全相同，不同的有以下幾點(diǎn) (1)所用萊氏野村菌菌株分離純化自云南昆明蔬菜地斜紋夜蛾僵蟲體表菌體，菌株編號為YNNr02。(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方如下葡萄糖10g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨8g/L， KH2PO4:5. Og/L, CaCl2. 2Η20:0· 85g/L, MgSO4. 7Η20:0· 7/L, FeSO4. 7Η20:0· 12g/L, CoCl2. 6H20 35mg/L, MnSO4. H20:15mg/L, ZnSO4. 7H20:15mg/L,脫離子水配制。(3)發(fā)酵培養(yǎng)工藝的條件如下培養(yǎng)基pH=6.0，溫度為^°C，液體發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為 80rpm，培養(yǎng)時(shí)間為150h。(4)通過以上方法所得出的微菌核數(shù)量在72h、96h、120h、150h分別為0、 1. 5 X 104、1. 7 X IO6、1. 5 X IO8 個(gè) /mL。實(shí)施例3
本實(shí)施例其他的步驟與實(shí)施例1完全相同，不同的有以下幾點(diǎn) (1)本實(shí)施例所用萊氏野村菌菌株分離純化自山東臨沂蔬菜地粘蟲僵蟲體表菌體，菌株編號為SDNr02。(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方如下葡萄糖30g/L，酵母膏9g/L，蛋白胨9g/L， KH2PO4:4. 5g/L, CaCl2. 2Η20:0· 9g/L, MgSO4. 7Η20:0· 5/L, FeSO4. 7Η20:0· 15g/L, CoCl2. 6H20 36mg/L, MnSO4. H20:18mg/L, ZnSO4. 7H20:18mg/L,脫離子水配制。(3)發(fā)酵培養(yǎng)工藝的條件如下培養(yǎng)基pH=6. 0，溫度為M°C，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為90rpm， 培養(yǎng)時(shí)間為16 。(4)通過以上方法所得出的微菌核數(shù)量在72h、96h、120h、144h和168h分別為0、 1.0X 104、8· 5X IO5 和 7. 0X IO7 個(gè) /mL、7. 1 X IO7 個(gè) /mL。實(shí)施例4
本實(shí)施例其他的步驟與實(shí)施例1完全相同，不同的有以下幾點(diǎn) (1)本實(shí)施例所用萊氏野村菌菌株分離純化自江蘇興化蔬菜地斜紋夜蛾僵蟲體表菌體，菌株編號為JSNr04。(2 )誘導(dǎo)培養(yǎng)液的配方如下葡萄糖40g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L， KH2PO4: 3g/L, CaCl2. 2Η20:0· 7g/L, MgSO4. 7Η20:0· 6/L, FeSO4. 7Η20:0· 2g/L, CoCl2. 6H20 40mg/L, MnSO4. H20:20mg/L, ZnSO4. 7H20:20mg/L，脫離子水配制。(3)發(fā)酵培養(yǎng)工藝的條件如下培養(yǎng)基pH=6. 5，溫度為^°C，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為 lOOrpm，培養(yǎng)時(shí)間為180h。(4)通過以上方法所得出的微菌核數(shù)量在72h、96h、120h、144h和180h分別為O、 1. 5 X 104、2· O X IO6 和 1. 6 X IO8 個(gè) /mL、1. 7 X IO8 個(gè) /mL。
權(quán)利要求
1.一種萊氏野村菌微菌核誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行(1)把萊氏野村菌菌種活化，待用；(2)接種體制備將活化的野村菌接種于SMAY培養(yǎng)基上，在25 下連續(xù)光照培養(yǎng) 144-192h，用0. 1% 0. 5%的Tween80水溶液將平板上的孢子或菌絲體洗下，配制萊氏野村菌接種體懸浮液；(3)液體發(fā)酵誘導(dǎo)將接種體加入誘導(dǎo)培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將所得的發(fā)酵液過濾， 棄去上清液，得到沉淀微菌核和菌體，干燥，保存；所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液單位體積內(nèi)所含有的各種原料干物質(zhì)重量如下葡萄糖l(T50g/L，酵母膏 5 10g/L，蛋白胨 5 10g/L, KH2PO4 3 5g/L, CaCl2. 2Η20 0· 7 0. 9g/L,MgSO4. 7H20 0· 5 0. 7g/L，F(xiàn)eSO4. 7H20 0· 1 0. 2g/L, CoCl2. 6H20 35 40mg/L, MnSO4. H2O 15 20mg/ L，ZnSO4. 7H20 14 20mg/L,脫離子水配制；所述液體發(fā)酵的工藝條件為培養(yǎng)基？11=5.4 6.5，溫度為2318°C，搖床轉(zhuǎn)速為 200 250rpm或者發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為80 lOOrpm，培養(yǎng)時(shí)間為144 19濁。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液單位體積內(nèi)所含有的各種原料干物質(zhì)重量如下葡萄糖10 40g/L、酵母浸膏5 8g/L、蛋白胨 5 8g/L、KH2PO4 3 4g/L、Cacl2. 2H20 0. 7 0. 8g/L、MgSO4. 7H20 0. 6 0. 7g/ L、FeSO4. 7H20 0. Γθ. 2g/L、CoCl2. 6H20 36 37mg/L、MnSO4. H2O 16 18mg/L、ZnSO4. 7H20 16 18mg/L，脫離子水配制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的方法，其特征在于所述液體發(fā)酵的工藝條件為培養(yǎng)基pH=5. 5 6. 0，溫度為25 26°C，搖床轉(zhuǎn)速為22(T250rpm或者發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為8(Tl00rmp，培養(yǎng)時(shí)間為150 19濁。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)萊氏野村菌產(chǎn)生微菌核的方法，其特征在于所得到的沉淀微菌核和菌體可以用凍干粉保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種萊氏野村菌微菌核誘導(dǎo)產(chǎn)生的方法，對萊氏野村菌菌種活化，制備接種體，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液，對發(fā)酵液進(jìn)行過濾，棄去上清液，得到微菌核和菌體，該方法可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，所用原料易于獲取，產(chǎn)生的休眠結(jié)構(gòu)微菌核性能穩(wěn)定，易于保存，具有很強(qiáng)的殺蟲生物活性，可以大批量生產(chǎn)、發(fā)酵周期短，生產(chǎn)成本低，為野村菌等蟲生真菌制劑的規(guī)模化生產(chǎn)提供了新的方法。
文檔編號C12R1/645GK102337221SQ20111030331
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者王中康 申請人:重慶大學(xué)