以記憶t細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法
【專利摘要】來(lái)自外周血的淋巴細(xì)胞中，在施行活化培養(yǎng)前初始T細(xì)胞占其中的約50％，但該比率經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)將會(huì)降低。另一方面，培養(yǎng)開(kāi)始前為半數(shù)以下的記憶T細(xì)胞的占有率通過(guò)活化培養(yǎng)而增加、甚至達(dá)到95％，但如果進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)，其將逐漸減少。本發(fā)明的課題在于提供以不使用抗體等的方式簡(jiǎn)便且迅速地大量制備CD45RO陽(yáng)性的記憶T細(xì)胞群的方法、以通過(guò)所述方法制作的記憶T細(xì)胞群為主要成分的醫(yī)藥用組合物等。本發(fā)明的特征在于，通過(guò)如下工序制造以記憶T細(xì)胞為主要成分的大量的淋巴細(xì)胞群，所述工序?yàn)椋簩?duì)采集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)，以培養(yǎng)中的淋巴細(xì)胞群的細(xì)胞密度大于一定的閾值為指標(biāo)、檢測(cè)到淋巴細(xì)胞群中的記憶T細(xì)胞的占有率達(dá)到了期望的值，收獲所述細(xì)胞群，進(jìn)行冷凍保存；對(duì)所述冷凍保存細(xì)胞進(jìn)行解凍、培養(yǎng)以使其增殖。
【專利說(shuō)明】以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以記憶Τ細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的大量制造方法、含有所述淋 巴細(xì)胞群的醫(yī)藥組合物、以及所述淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)（裝置等手段的組合）等，所述大 量制造方法為用于簡(jiǎn)便地大量獲得來(lái)自含有Τ細(xì)胞的外周血的⑶45R0陽(yáng)性且⑶62L陽(yáng)性 的Τ細(xì)胞群、⑶45R0陽(yáng)性且⑶62L陰性的Τ細(xì)胞群的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 淋巴細(xì)胞作為支持用于機(jī)體防御的免疫系統(tǒng)的重要手段近年來(lái)備受關(guān)注。淋巴 細(xì)胞的表面表達(dá)有被稱作分化抗原的抗原型，淋巴細(xì)胞根據(jù)該抗原型被分類為各種各樣 的亞群（subset)。例如，根據(jù)單克隆抗體的反應(yīng)性對(duì)有無(wú)⑶3(⑶為分化簇（cluster of differentiation)的略稱）表達(dá)進(jìn)行檢驗(yàn)，由此將淋巴細(xì)胞區(qū)別為與細(xì)胞免疫相關(guān)的T淋 巴細(xì)胞（CD3陽(yáng)性，也表示為CD3+ ;以下有時(shí)也將陽(yáng)性記載為+、陰性記載為-)和與體液免 疫相關(guān)的Β淋巴細(xì)胞等（⑶3陰性，也表示為⑶3_)。而且這些淋巴細(xì)胞各自的功能也不同。 進(jìn)一步地，與細(xì)胞免疫相關(guān)的Τ淋巴細(xì)胞（也稱作Τ細(xì)胞）被分類為表達(dá)CD4的CD4陽(yáng)性 細(xì)胞和表達(dá)⑶8的⑶8陽(yáng)性細(xì)胞。以往，一直認(rèn)為⑶4陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)揮輔助功能、⑶8陽(yáng)性細(xì) 胞發(fā)揮細(xì)胞抑制性功能，因此迄今為止，多數(shù)情況下，將⑶4陽(yáng)性細(xì)胞和⑶8陽(yáng)性細(xì)胞分離 之后再進(jìn)行研究。
[0003] 通過(guò)形態(tài)對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行區(qū)別是困難的，多數(shù)情況下如上文所述根據(jù)抗原型將淋 巴細(xì)胞分為各亞群并對(duì)功能進(jìn)行分析。但是，其多半是使用與各細(xì)胞的抗原型相對(duì)應(yīng)的主 要為單克隆抗體（例如抗CD4單克隆抗體、抗CD8單克隆抗體）來(lái)進(jìn)行的。而且，是使淋巴 細(xì)胞與結(jié)合在磁性微珠粒（magnetic microbeads)上的抗體進(jìn)行反應(yīng)、從容器外部利用貼 附的磁石的磁力收集磁性微珠、分離介由抗體結(jié)合在所述珠粒（beads)上的細(xì)胞或者利用 分離柱來(lái)進(jìn)行分離的方法。此外，為了大量獲得CD4陽(yáng)性細(xì)胞、CD8陽(yáng)性細(xì)胞，也有在利用微 珠粒法將其各自分離之后，進(jìn)一步進(jìn)行活化、擴(kuò)增培養(yǎng)的方法（參見(jiàn)專利文獻(xiàn)2)。此外，近 來(lái)，由于測(cè)定儀器的進(jìn)步，利用針對(duì)各自的表面抗原的熒光標(biāo)記抗體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色、 使用細(xì)胞分選儀（cell sorter)進(jìn)行分辨的方法也被實(shí)施。該方法中，預(yù)先用熒光染料對(duì) 針對(duì)細(xì)胞表面抗原的抗體進(jìn)行標(biāo)記，使標(biāo)記抗體結(jié)合在淋巴細(xì)胞上，將該淋巴細(xì)胞供給至 使用細(xì)胞分選儀進(jìn)行的測(cè)定從而檢驗(yàn)表面抗原的表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)而對(duì)亞群進(jìn)行分離。但是，該 方法存在僅小規(guī)模適用的問(wèn)題（參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)2)。無(wú)論采用以往的何種方法，都無(wú)法避 免用高價(jià)的抗體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記等繁雜的操作，要獲得大量的細(xì)胞需要費(fèi)錢費(fèi)力。
[0004] 關(guān)于活化T淋巴細(xì)胞的制造方法，最初為由Sekine等人進(jìn)行的報(bào)道。這是對(duì)選 擇性地刺激活化T淋巴細(xì)胞群的增殖從而獲得經(jīng)增殖的活化T淋巴細(xì)胞群的方法的首次 報(bào)道，具體而言，其中將人外周血淋巴細(xì)胞（PBMC:Peripheral Blood Mononuclear Cell) 在固相化了 0KT3抗體（其為抗CD3抗體之一）的培養(yǎng)燒瓶中進(jìn)行第一期培養(yǎng)、將經(jīng)此培 養(yǎng)的細(xì)胞在不存在0KT3抗體的情況下進(jìn)行第二期培養(yǎng)。采用該方法獲得的活化淋巴細(xì) 胞群進(jìn)一步經(jīng)過(guò)在白細(xì)胞介素2(IL-2)存在下的培養(yǎng)，可以作為癌癥的過(guò)繼性免疫療法 (adoptive immunotherapy)施予至作為上述外周血采集來(lái)源的患者（參見(jiàn)專利文獻(xiàn)1)。 此外，以同樣的方式，將來(lái)自供體的外周血淋巴細(xì)胞在固相化了 0KT3抗體的培養(yǎng)容器中于 IL-2存在下進(jìn)行培養(yǎng)，從獲得的活化淋巴細(xì)胞群中分離CD4陽(yáng)性細(xì)胞，可以將作為以相對(duì) 于總細(xì)胞而言90%以上的量含有分離得到的CD4陽(yáng)性細(xì)胞的制劑的、用于預(yù)防及治療傳染 病、腫瘤復(fù)發(fā)、自身免疫性疾病的醫(yī)藥組合物施予至患者（參見(jiàn)專利文獻(xiàn)2)。作為它們的淋 巴細(xì)胞源，可使用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TIL :Tumor Infiltrating Lymphocyte)、臍帶血、骨髓 等（參見(jiàn)專利文獻(xiàn)2)。
[0005] 另外從功能性觀點(diǎn)來(lái)考慮，有時(shí)將淋巴細(xì)胞分類為初始淋巴細(xì)胞（na'i_ve lymphocyte)和記憶淋巴細(xì)胞（memory lymphocyte)。初始淋巴細(xì)胞是尚未受到抗原刺激 的、細(xì)胞表面表達(dá)有CD45RA抗原的淋巴細(xì)胞，已知其于在局部淋巴結(jié)等處與抗原相遇并受 到刺激的過(guò)程中被活化。記憶淋巴細(xì)胞是已經(jīng)受到抗原刺激（無(wú)論是特異性刺激還是非特 異性刺激）而表達(dá)有⑶45R0抗原的淋巴細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞還可以根據(jù)各自的 狀態(tài)分為初始T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞、初始B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。記憶T細(xì)胞可以進(jìn)一步分 為效應(yīng)型記憶（effector memory ;EM)T細(xì)胞和中央型記憶（central memory ;CM)T細(xì)胞。 中央型記憶T細(xì)胞具有歸巢至淋巴結(jié)、迎擊侵入體內(nèi)的異物和抗原的功能，效應(yīng)型記憶T細(xì) 胞具有處于本應(yīng)所在的部位、捕捉異物和抗原的作用。因此，預(yù)期含有記憶Τ細(xì)胞群作為主 要成分的制劑能夠在過(guò)繼性免疫療法中取得高的治療效果。因此，Osumi等人為了闡明在 過(guò)繼性免疫療法中使用的活化淋巴細(xì)胞的作用機(jī)制，著眼于記憶T細(xì)胞亞群，對(duì)活化擴(kuò)增 培養(yǎng)獲得的活化淋巴細(xì)胞群的功能進(jìn)行了分析。其結(jié)果，確認(rèn)了活化淋巴細(xì)胞群中包含的 效應(yīng)型記憶T細(xì)胞在與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)開(kāi)始24小時(shí)后呈現(xiàn)出對(duì)癌癥細(xì)胞的細(xì)胞抑制活 性；另一方面，中央型記憶T細(xì)胞在開(kāi)始與癌癥細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)、識(shí)別了腫瘤抗原的48小時(shí) 后呈現(xiàn)出對(duì)癌癥細(xì)胞的細(xì)胞抑制活性，那時(shí)分化成了效應(yīng)型記憶T細(xì)胞（參見(jiàn)非專利文獻(xiàn) 2)。
[0006] 關(guān)于采集記憶T細(xì)胞的報(bào)道，可追溯至由Sekine等人于2000年發(fā)表的文獻(xiàn)（參 見(jiàn)專利文獻(xiàn)3)，其將來(lái)自臍帶血的淋巴細(xì)胞于抗CD3抗體和IL-2的存在下進(jìn)行活化培養(yǎng)、 使其活化增殖7天，結(jié)果采集到了⑶3陽(yáng)性細(xì)胞的比例為98%、且⑶45R0陽(yáng)性細(xì)胞的比例 為73%的細(xì)胞團(tuán)。但是，此時(shí)期的細(xì)胞存在增殖不充分、細(xì)胞數(shù)少的問(wèn)題。
[0007] 上述活化淋巴細(xì)胞需要在增殖培養(yǎng)后迅速施予患者，難于進(jìn)行適應(yīng)病情的迅速施 予和穩(wěn)定的品質(zhì)管理。因此，有報(bào)道稱考慮到患者的方便，由患者血制備淋巴細(xì)胞時(shí)，在活 化培養(yǎng)后將淋巴細(xì)胞冷凍保存（參見(jiàn)非專利文獻(xiàn)1)。其中已經(jīng)算出了將經(jīng)冷凍、解凍的淋 巴細(xì)胞再次活化培養(yǎng)而得到的活化淋巴細(xì)胞中CD4淋巴細(xì)胞及CD8淋巴細(xì)胞的占有率，結(jié) 論為：幾乎所有種群（population)基本平行地進(jìn)行增殖。非專利文獻(xiàn)3中，公開(kāi)了分離來(lái) 自臍帶血及外周血的淋巴細(xì)胞、之后暫且冷凍保存、解凍后進(jìn)行活化培養(yǎng)、此時(shí)對(duì)培養(yǎng)期間 的亞群變化進(jìn)行跟蹤的結(jié)果。報(bào)道稱，來(lái)自臍帶血及外周血的淋巴細(xì)胞均存在下述情況：作 為記憶T細(xì)胞的亞群的中央型記憶T細(xì)胞在培養(yǎng)開(kāi)始后迅速增殖、于6天至7天內(nèi)達(dá)到增 殖的高峰、其后減少，效應(yīng)型記憶T細(xì)胞在培養(yǎng)后期增殖。此外，Sekine等人公開(kāi)了如下的 施予用制劑的制造方法：使患者的淋巴細(xì)胞在體外進(jìn)行增殖?活化培養(yǎng)，然后在超低溫冰 箱（freezer)內(nèi)冷凍?保存，使用時(shí)由冷凍狀態(tài)解凍后立即添加生理鹽水并混懸，從而制成 給藥用制劑（參見(jiàn)專利文獻(xiàn)4)。
[0008] 如上所述，在過(guò)繼性免疫療法中利用記憶T細(xì)胞的有效性已被暗示，可以說(shuō)大量 簡(jiǎn)便地采集記憶Τ細(xì)胞豐富的組分是社會(huì)性的需求。但是，現(xiàn)狀是沒(méi)有在不給淋巴細(xì)胞提 供者強(qiáng)加很大的負(fù)擔(dān)的情況下大量簡(jiǎn)便地采集為供給于臨床而所需的記憶Τ細(xì)胞的方法。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)平3-80076號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)2 :日本專利第4389039號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開(kāi)2002-171966號(hào)公報(bào)
[0014] 專利文獻(xiàn)4 :日本專利第4395644號(hào)公報(bào)
[0015] 非專利文獻(xiàn)
[0016] 非專利文獻(xiàn) 1 :Sekine Τ.，Human Cell, 5(3)243-245(1992)
[0017] 非專利文獻(xiàn)2 :第32屆癌癥免疫外科研究會(huì)議程（Program) ·摘要集103頁(yè)平成 23年4月
[0018] 非專利文獻(xiàn) 3 :Shikamura M.等人，Biotherapy 23(3)257-262(2009)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 來(lái)自外周血的淋巴細(xì)胞中，在施行活化培養(yǎng)前初始T細(xì)胞占其中的約50%，但該 比率通過(guò)活化培養(yǎng)而降低。另一方面，培養(yǎng)開(kāi)始前為半數(shù)以下的記憶T細(xì)胞的占有率通過(guò) 活化培養(yǎng)而增加、甚至達(dá)到95%，但如果進(jìn)一步繼續(xù)培養(yǎng)，其將逐漸減少。本發(fā)明的課題在 于提供以不使用抗體等的方式、利用簡(jiǎn)便且迅速的高增殖培養(yǎng)法大量地制備CD45R0陽(yáng)性 的記憶T細(xì)胞群的方法，提供以通過(guò)所述方法制作的以記憶T細(xì)胞群為主要成分的醫(yī)藥用 組合物等。
[0020] 本發(fā)明人等以提高活化淋巴細(xì)胞中包含的記憶T細(xì)胞的比率為目的，在各種各 樣的條件下反復(fù)進(jìn)行研究、付出努力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：如果將外周血淋巴細(xì)胞在抗CD3抗體固 相化燒瓶中、于含有IL-2的培養(yǎng)液中進(jìn)行活化培養(yǎng)，則隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞表面抗原為 CD45R0陽(yáng)性且CD62L陽(yáng)性（CD45R0+，CD62L+)的T細(xì)胞群和CD45R0陽(yáng)性且CD62L陰性 (⑶45R0+，⑶62L-)的T細(xì)胞群（即記憶T細(xì)胞群）增加，在淋巴細(xì)胞群中占有的比例上升。 但是還確認(rèn)到：由于在此時(shí)間點(diǎn)時(shí)總細(xì)胞數(shù)仍較少，所以還需要繼續(xù)培養(yǎng)，但如果繼續(xù)培養(yǎng) 的話，記憶T細(xì)胞群的比例轉(zhuǎn)為減少。因此，本發(fā)明人等對(duì)以不使記憶T細(xì)胞群的比例減少 的方式使淋巴細(xì)胞增殖、大量地制造以記憶T細(xì)胞群為主要成分的細(xì)胞群的方法進(jìn)行了銳 意研究。其結(jié)果，為了大量地獲得記憶T細(xì)胞，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)直至活化培養(yǎng)中的淋巴細(xì)胞群中 的表面抗原為CD45R0+、CD62L+和/或CD45R0+、CD62L-的T細(xì)胞群的比率上升至期望的比 率、然后收獲上升至該期望的比率的淋巴細(xì)胞群時(shí)，以細(xì)胞密度大于一定的閾值為指標(biāo)，將 所述收獲的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，然后再次進(jìn)行活化擴(kuò)增培養(yǎng)，由此解決了上述問(wèn)題。
[0021] 即，由于發(fā)現(xiàn)了記憶T細(xì)胞群的占有率的上升與活化培養(yǎng)淋巴細(xì)胞群的細(xì)胞密度 之間的關(guān)系，因此細(xì)胞密度達(dá)到作為收獲細(xì)胞的指標(biāo)的一定的閾值以上就意味著上述記憶 T細(xì)胞群達(dá)到了期望的占有率。由此，利用測(cè)定細(xì)胞密度這樣的簡(jiǎn)便且低成本的方法，就能 夠檢測(cè)到最適于收獲具有足夠的細(xì)胞數(shù)以及高的記憶T細(xì)胞群占有率的細(xì)胞群的時(shí)期。此 夕卜，還發(fā)現(xiàn)了通過(guò)對(duì)接種時(shí)的細(xì)胞密度進(jìn)行管理，能夠?qū)Φ绞斋@為止的培養(yǎng)期間進(jìn)行最合 適的控制，從而可以在短時(shí)間內(nèi)收獲具有足夠的細(xì)胞數(shù)以及高的記憶T細(xì)胞群占有率的細(xì) 胞群。如上所述，成功開(kāi)發(fā)了以不使用抗體等的方式簡(jiǎn)便且低成本地大量制造以記憶Τ細(xì) 胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的方法。
[0022] ΒΡ，本發(fā)明包括以下[1]?[4]的制造方法：
[0023] [1]以記憶Τ細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法，所述制造方法利用依次 包括以下工序（a)?（c)的高增殖培養(yǎng)法，所述工序?yàn)?：
[0024] 工序（a)，對(duì)采集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)；
[0025] 工序（b)，基于淋巴細(xì)胞密度檢測(cè)到記憶T細(xì)胞群的占有率上升，將工序（a)的淋 巴細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存；
[0026] 工序（c)，對(duì)被冷凍的淋巴細(xì)胞進(jìn)行解凍、活化培養(yǎng)；
[0027] [2]如上述[1]所述的制造方法，其特征在于，工序（b)中基于淋巴細(xì)胞密度對(duì)記 憶T細(xì)胞群的占有率上升進(jìn)行的檢測(cè)以懸浮于培養(yǎng)液中的淋巴細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)；
[0028] [3]如上述[1]或[2]所述的制造方法，其特征在于，工序（b)中的淋巴細(xì)胞密度 為：懸浮于培養(yǎng)液中的淋巴細(xì)胞數(shù)為4X 105個(gè)細(xì)胞/mL以上；
[0029] [4]如上述[1]?[3]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，活化培養(yǎng)為在IL-2 及固相化抗CD3抗體的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0030] 此外，本發(fā)明包括以下[5]?[9]的制造方法：
[0031] [5]如上述[1]?[4]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，工序（c)于解凍后 2周以內(nèi)完成；
[0032] [6]如上述[1]?[5]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，以記憶T細(xì)胞為主 要成分的淋巴細(xì)胞群為淋巴細(xì)胞群中記憶T細(xì)胞的占有率為75%以上的淋巴細(xì)胞群；
[0033] [7]如上述[1]?[6]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，記憶T細(xì)胞以占淋 巴細(xì)胞群的70%以上的比例含有中央型記憶T細(xì)胞；
[0034] [8]如上述[1]?[7]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，經(jīng)分離的淋巴細(xì)胞 來(lái)自人外周血；
[0035] [9]如上述[1]?[8]中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，淋巴細(xì)胞群是用于 施予至第三者的細(xì)胞群。
[0036] 此外，本發(fā)明包括以下[10]?[13]:
[0037] [10] -種淋巴細(xì)胞群，其特征在于，含有占淋巴細(xì)胞群的75 %以上的記憶T細(xì) 胞；
[0038] [11]如上述[10]所述的淋巴細(xì)胞群，其特征在于，含有占淋巴細(xì)胞群的70%以上 的中央型記憶T細(xì)胞；
[0039] [12] -種醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物以上述[10]或[11]所述的淋巴細(xì)胞群為 有效成分；
[0040] [13]以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)，所述制造系統(tǒng)為具備以 下（A)?（D)的手段的、利用高增殖培養(yǎng)法的制造系統(tǒng)，所述手段（A)?（D)為：
[0041] 手段（A)，淋巴細(xì)胞的活化培養(yǎng)手段；
[0042] 手段（B)，基于淋巴細(xì)胞密度檢測(cè)記憶T細(xì)胞群的占有率上升的手段；
[0043] 手段（C)，淋巴細(xì)胞的冷凍保存手段；
[0044] 手段（D)，對(duì)被冷凍的淋巴細(xì)胞進(jìn)行解凍的手段；
[0045] 根據(jù)本發(fā)明，能夠簡(jiǎn)便且大量地提供以來(lái)自外周血的活化淋巴細(xì)胞中含有的 ⑶45R0+且⑶62L+、⑶45R0+且⑶62L-的記憶T細(xì)胞群為主要成分的淋巴細(xì)胞群。在對(duì) 活化淋巴細(xì)胞群中包含的記憶T細(xì)胞群的增殖進(jìn)行追蹤時(shí)，能夠不采用以往的方法中進(jìn)行 的細(xì)胞表面抗原分析這樣的使用高價(jià)抗體的繁雜方法，而通過(guò)計(jì)測(cè)活化培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù) (特別是懸浮淋巴細(xì)胞數(shù)）而算出細(xì)胞密度、與預(yù)先設(shè)定的一定的閾值進(jìn)行比較這樣的極 其簡(jiǎn)便且廉價(jià)的方法，就能掌握記憶T細(xì)胞的增殖及占有率的狀況。由此，可以找到最適于 收獲細(xì)胞的時(shí)期來(lái)收獲細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)將該收獲的細(xì)胞冷凍保存，能夠維持處于記憶T細(xì) 胞占有率增加了的狀態(tài)的淋巴細(xì)胞群、并對(duì)其適當(dāng)?shù)厥褂谩＿M(jìn)一步地，通過(guò)將冷凍了的記憶 T細(xì)胞群于解凍后再次進(jìn)行活化培養(yǎng)，在維持高的記憶T細(xì)胞群的占有比例的同時(shí)，細(xì)胞群 得以擴(kuò)增，結(jié)果能夠獲得以記憶T細(xì)胞群為主要成分的大量的淋巴細(xì)胞群。此外，對(duì)淋巴細(xì) 胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間、以及最終獲得的以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的量進(jìn)行了詳細(xì) 的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的制造方法還具有能夠在解凍后2周以內(nèi)這樣的短時(shí)間內(nèi)大量 制造以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的效果。
[0046] 本發(fā)明中，對(duì)包含中央型記憶T細(xì)胞和效應(yīng)型記憶T細(xì)胞的記憶T細(xì)胞群的、由活 化培養(yǎng)引起的占有率增加進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)進(jìn)行冷凍處理的工序，制造記憶T細(xì)胞占有率高 的淋巴細(xì)胞群。中央型記憶T細(xì)胞具有歸巢至淋巴結(jié)、迎擊侵入體內(nèi)的異物和抗原的功能， 效應(yīng)型記憶T細(xì)胞具有處于本應(yīng)所在的部位、捕捉異物和抗原的作用。因此，所述以記憶 T細(xì)胞群為主要成分的淋巴細(xì)胞群可以作為施用回同一生物體的過(guò)繼性免疫療法或施予至 第三者的醫(yī)藥組合物使用，能夠期待其比以往被用于過(guò)繼性免疫療法等的、記憶T細(xì)胞占 有率低的淋巴細(xì)胞群具有高得多的治療效果。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0047] [圖1]是表示將活化培養(yǎng)期間第1、5、6、13天的淋巴細(xì)胞根據(jù)有無(wú)細(xì)胞表面抗 原（⑶45R0、⑶62L、⑶3)進(jìn)行分類的結(jié)果的圖（η = 3)。作為外周血淋巴細(xì)胞中存在的 ⑶45R0+⑶62L+的Τ淋巴細(xì)胞（CM)及⑶45R0+⑶62L-的Τ淋巴細(xì)胞（ΕΜ)的合計(jì)而言的記 憶T細(xì)胞（memory)的占有率在第5天、第6天時(shí)大于90%，但隨著培養(yǎng)的繼續(xù)有所降低。
[0048] [圖2]是表示在冷凍保存前進(jìn)行活化培養(yǎng)后的細(xì)胞群中占有率上升了的記憶T細(xì) 胞群在冷凍解凍后、活化培養(yǎng)及擴(kuò)增培養(yǎng)的過(guò)程中仍維持著高的存在比率的圖（η = 3)。
[0049] [圖3]是表示本發(fā)明的以記憶細(xì)胞為主要成分的醫(yī)療組合物的制造工序的概要 圖。
[0050] [圖4]是表示對(duì)采用不進(jìn)行冷凍保存的現(xiàn)有方法制作的活化淋巴細(xì)胞群（Α)和 通過(guò)本發(fā)明的方法制作的活化淋巴細(xì)胞群（Β)中各細(xì)胞的存在比率基于有無(wú)細(xì)胞表面抗 原（CD45R0、⑶62L、⑶3)進(jìn)行分類、調(diào)查獲得的結(jié)果的圖。"PBMC"表示培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的、由外 周血管采血分離的單核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞富集的組分）；"+50"表示在培養(yǎng)開(kāi)始后第4天馬 上要添加50mL培養(yǎng)基之前的細(xì)胞；"+150"及"冷凍"表示在培養(yǎng)開(kāi)始后第5天馬上要第2 次添加培養(yǎng)基或進(jìn)行冷凍處理之前的細(xì)胞；"生BP"表示未經(jīng)過(guò)冷凍工序、馬上要用"+150" 進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模之前的細(xì)胞；"生H"表示完成了上述生BP的培養(yǎng)、臨收獲前的細(xì)胞； "TW(解凍）"表示剛剛將冷凍細(xì)胞進(jìn)行解凍后的細(xì)胞；"0ΚΤ"表示擴(kuò)大培養(yǎng)完成后、馬上要 進(jìn)行利用0KT3抗體進(jìn)行活化培養(yǎng)2之前的細(xì)胞；"解凍BP"表示馬上要進(jìn)入擴(kuò)增培養(yǎng)之前 (活化培養(yǎng)2之后）的細(xì)胞；"解凍Η(收獲）"表示擴(kuò)增培養(yǎng)2之后的細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 本發(fā)明中所謂"記憶Τ細(xì)胞"，是指表達(dá)作為淋巴細(xì)胞表面抗原的⑶45R0的Τ細(xì) 胞，作為所述記憶Τ細(xì)胞，可以舉出中央型記憶Τ細(xì)胞、效應(yīng)型記憶Τ細(xì)胞。淋巴細(xì)胞在其表 面表達(dá)有多種細(xì)胞表面抗原，可根據(jù)表面抗原將其分類區(qū)別為多種亞群。例如，淋巴細(xì)胞可 以分為Τ細(xì)胞和Β細(xì)胞，而Τ細(xì)胞因在其表面具有CD3表面抗原而與Β細(xì)胞區(qū)別開(kāi)。進(jìn)一 步地，作為表面抗原，有⑶45R0和作為⑶45R0的異種型（isoform)的⑶45RA抗原，存在根 據(jù)有無(wú)這些抗原進(jìn)行的分類。⑶45R0是在表達(dá)⑶45RA的初始淋巴細(xì)胞受到抗原刺激（無(wú) 論是特異性的還是非特異性的）時(shí)取代CD45RA而表達(dá)的、成為記憶細(xì)胞的指標(biāo)之一的抗原 型。⑶62L是屬于選擇素家族（selectin family)的74kDa的糖蛋白，在大部分的淋巴細(xì)胞 中表達(dá)，是與淋巴細(xì)胞向淋巴結(jié)的歸巢有關(guān)的細(xì)胞粘附分子。其也作為細(xì)胞表面抗原表達(dá) 于初始細(xì)胞中，但伴有⑶45R0的表達(dá)時(shí)，根據(jù)⑶62L的表達(dá)強(qiáng)度，可區(qū)別中央型記憶、效應(yīng) 型記憶等記憶細(xì)胞亞群。而且，具有⑶45R0+且⑶62L+的表面抗原的T細(xì)胞被認(rèn)為是中央 型記憶T細(xì)胞，具有⑶45R0+且⑶62L-的表面抗原的T細(xì)胞被認(rèn)為是效應(yīng)型記憶T細(xì)胞。
[0052] S卩，在淋巴細(xì)胞表面表達(dá)抗原⑶3的⑶3陽(yáng)性（⑶3+)T細(xì)胞中，細(xì)胞表面抗原 ⑶45R0陽(yáng)性且⑶62L陽(yáng)性的Τ細(xì)胞群（⑶45R0+，⑶62L+)為中央型記憶Τ細(xì)胞群，細(xì)胞表面 抗原⑶45R0陽(yáng)性且⑶62L陰性的Τ細(xì)胞群（⑶45R0+、⑶62L-)為效應(yīng)型記憶Τ細(xì)胞群，這 些中央型記憶Τ細(xì)胞群和效應(yīng)型記憶Τ細(xì)胞群共同構(gòu)成記憶Τ細(xì)胞群。對(duì)所述細(xì)胞表面抗 原的檢驗(yàn)可以通過(guò)下述方法進(jìn)行：使用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體（抗⑶3抗體、抗⑶45R0抗 體、抗⑶62L抗體）對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色，例如利用FACS Calibur (Becton ·0?χ1?η8〇η公司 制）等流式細(xì)胞儀（Flow Cytometer)來(lái)計(jì)測(cè)有無(wú)該突光染料標(biāo)記抗體以及細(xì)胞數(shù)。此外， 也可以用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體、或用第一抗體及經(jīng)熒光標(biāo)記的第二抗體對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行 染色、用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
[0053] 通常，健康人的外周血淋巴細(xì)胞群中記憶Τ細(xì)胞的占有率為40%左右，但通過(guò)本 發(fā)明的制造方法能夠提高該占有率。作為本發(fā)明中的"以記憶Τ細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì) 胞群"（以下，也稱為"記憶Τ細(xì)胞含量高的淋巴細(xì)胞群")，表示記憶Τ細(xì)胞含量高的淋巴細(xì) 胞群中記憶Τ細(xì)胞的占有率為優(yōu)選60%以上、更優(yōu)選70%以上、75%以上、80%以上、85% 以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上的淋巴細(xì)胞群。其中，淋巴細(xì)胞群中的記憶Τ 細(xì)胞的占有率優(yōu)選為75%以上。進(jìn)一步地，作為本發(fā)明的淋巴細(xì)胞群，優(yōu)選地，淋巴細(xì)胞群 的70%以上、更優(yōu)選75%以上、80%以上、85%以上、更優(yōu)選90%、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上為 中央型記憶Τ細(xì)胞。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的以記憶Τ細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群并不 排除記憶Τ細(xì)胞以外的Τ細(xì)胞的混入。
[0054] 此外，本發(fā)明的以記憶Τ細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法中，通過(guò)依次 包括工序（a)?（c)的高增殖培養(yǎng)法，可以提供足以用于實(shí)施施用回同一生物體的過(guò)繼 性免疫療法或用于制備施予至第三者的醫(yī)藥組合物的量的、記憶T細(xì)胞含量高的淋巴細(xì)胞 群。此處，所謂高增殖培養(yǎng)法，是能夠使血樣中的淋巴細(xì)胞數(shù)增殖至500倍以上、優(yōu)選600 倍以上、700倍以上、800倍以上、更優(yōu)選900倍以上的培養(yǎng)方法，通過(guò)所述培養(yǎng)法，可以獲得 例如下述以高含量含有記憶T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群，其中，由50mL血液獲得的以記憶T細(xì)胞 為主要成分的淋巴細(xì)胞群中的總淋巴細(xì)胞數(shù)為優(yōu)選5Χ 108個(gè)以上、更優(yōu)選8Χ 108個(gè)、進(jìn)一 步優(yōu)選1X 1〇9個(gè)以上、最優(yōu)選3 X 109個(gè)以上。此外，可以獲得其中以記憶Τ細(xì)胞為主要成 分的淋巴細(xì)胞群的細(xì)胞密度為5Χ104個(gè)/mL以上、優(yōu)選1Χ10 5個(gè)/mL以上、5Χ105個(gè)/mL 以上、更優(yōu)選1X 1〇6個(gè)/mL以上的記憶T細(xì)胞含量高的淋巴細(xì)胞群。
[0055] 此外，作為工序（a)中的"采集的淋巴細(xì)胞"，可以舉出通過(guò)常規(guī)方法采集的來(lái)自 外周血或臍帶血、以及來(lái)自骨髓的淋巴細(xì)胞，但從采集的時(shí)機(jī)、采集的容易程度方面來(lái)看， 優(yōu)選來(lái)自外周血的淋巴細(xì)胞。作為所述外周血，可以舉出來(lái)自他人的外周血、來(lái)自自身的 外周血，用于過(guò)繼性免疫療法時(shí)，可以有利地使用來(lái)自自身的外周血。從對(duì)腫瘤及其復(fù)發(fā)、 以及病毒感染癥、自身免疫性疾病的預(yù)防及治療的觀點(diǎn)來(lái)考慮，對(duì)于接受了器官移植或骨 髓移植等的患者而言，優(yōu)選為來(lái)自移植器官或骨髓等的提供者的外周血。此外，作為采集的 淋巴細(xì)胞，優(yōu)選使用經(jīng)分離的淋巴細(xì)胞，所述經(jīng)分離的淋巴細(xì)胞可以通過(guò)用一般性方法對(duì) 利用從血管采血、利用單采法（pheresis)等采集的外周血（優(yōu)選采集自靜脈的外周血）進(jìn) 行處理來(lái)獲得。關(guān)于從外周血分離淋巴細(xì)胞，可以通過(guò)使用了蔗糖、市售的淋巴細(xì)胞分離劑 等的不連續(xù)密度梯度離心法等公知的淋巴細(xì)胞分離法來(lái)實(shí)現(xiàn)。關(guān)于用于分離淋巴細(xì)胞的外 周血，可以使用添加了肝素或檸檬酸以防止發(fā)生血液凝固的外周血。關(guān)于所述外周血的量， 沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)供體的負(fù)擔(dān)、采血所需的人力物力、淋巴細(xì)胞的分離操作等進(jìn)行適 當(dāng)設(shè)定，可以將單次采血的量設(shè)定為〇. OlmL?100mL左右、更優(yōu)選5mL?50mL左右、進(jìn)一 步優(yōu)選10mL?20mL。
[0056] 此外，淋巴細(xì)胞的來(lái)源并不特別地僅限定于人，也可以舉出猴、馬、綿羊、山羊、豬、 狗、貓、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠，在將本發(fā)明的淋巴細(xì)胞群施予人時(shí)，優(yōu)選為來(lái)自人的。此外，本發(fā) 明的淋巴細(xì)胞群可以為來(lái)自施予對(duì)象，也可以來(lái)自施予對(duì)象以外的個(gè)體，即，供體和受體可 以相同也可以不同。
[0057] 作為工序（a)和工序（c)中的"活化培養(yǎng)"，只要是通過(guò)體外培養(yǎng)能夠使記憶T細(xì) 胞群的占有率上升的活化培養(yǎng)（例如日本特開(kāi)平3-80076號(hào)公報(bào)中記載的公知的淋巴細(xì)胞 的活化培養(yǎng)）即可，沒(méi)有特別限定，優(yōu)選在白細(xì)胞介素2(IL_2)的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，更優(yōu) 選在IL-2和抗CD3抗體的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以優(yōu)選地舉出使淋巴細(xì)胞懸浮于含 有IL-2的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中、在固相化了抗CD3抗體的培養(yǎng)容器中進(jìn)行的培養(yǎng)。進(jìn)一步地， 可以根據(jù)需要使用各種分裂促進(jìn)劑（mitogen)來(lái)進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化。作為所述抗CD3抗 體，只要是能夠識(shí)別淋巴細(xì)胞表面的CD3表面抗原并促進(jìn)增殖?活化的抗體即可，可以使用 任意的抗CD3抗體。用于刺激淋巴細(xì)胞的活化的抗CD3抗體可以使用經(jīng)過(guò)純化的CD3分子 在動(dòng)物或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，但可有利地使用穩(wěn)定性、操作容易性優(yōu)異的市售品0KT-3抗體（制造 商：eBIO公司）。此外，作為以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)中的淋巴 細(xì)胞的活化培養(yǎng)手段，可以舉出通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的手段，例如細(xì)胞培養(yǎng)容器、細(xì)胞培養(yǎng)裝 置、細(xì)胞培養(yǎng)槽等。
[0058] 作為上述活化培養(yǎng)中的培養(yǎng)法，只要在高增殖培養(yǎng)法實(shí)施完成之后能夠以高增殖 率大量地制造以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群即可，其條件沒(méi)有特別限定。關(guān)于活 化培養(yǎng)，由于其以抗CD3抗體的刺激信息被傳達(dá)至淋巴細(xì)胞、以及記憶T細(xì)胞群增殖從而 相對(duì)于淋巴細(xì)胞群而言的占有率上升、進(jìn)而所述上升了的占有率不大幅地減少為前提，所 以作為活化培養(yǎng)的培養(yǎng)時(shí)期為獲得足夠數(shù)目的淋巴細(xì)胞為止，可以舉出1?10天、更優(yōu)選 2?8天、進(jìn)一步優(yōu)選3?7天、特別優(yōu)選4?6天。關(guān)于此培養(yǎng)時(shí)期中的培養(yǎng)基的更換頻 度，沒(méi)有特別限定，為了防止培養(yǎng)液劣化及IL-2活性降低，優(yōu)選1?7天進(jìn)行1次，優(yōu)選以 相對(duì)于添加前的培養(yǎng)液中的液量而言〇. 1?5倍左右的量添加。
[0059] 在工序（a)中進(jìn)行淋巴細(xì)胞的活化培養(yǎng)，通常，活化培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中既有附著于 燒瓶底面而增殖的細(xì)胞，又有經(jīng)過(guò)活化后以懸浮于培養(yǎng)液中的狀態(tài)進(jìn)行增殖的細(xì)胞。附著 增殖的細(xì)胞與懸浮細(xì)胞同為活細(xì)胞。關(guān)于培養(yǎng)方法，可以是培養(yǎng)液與活化培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培 養(yǎng)液等量的培養(yǎng)方法，也可以是在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)一步添加培養(yǎng)液、繼續(xù)活化培養(yǎng)數(shù)日（例 如1?2天）、進(jìn)一步增殖淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法。所述培養(yǎng)液的添加量?jī)?yōu)選為活化培養(yǎng)開(kāi)始 時(shí)的培養(yǎng)液量的0.5?2倍量，其中，可以優(yōu)選地舉出與活化培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的培養(yǎng)液量等量的 培養(yǎng)液。在進(jìn)一步添加上述培養(yǎng)液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以僅對(duì)懸浮于培養(yǎng)液中的淋巴細(xì)胞 進(jìn)行繼代培養(yǎng)，但也可以對(duì)懸浮淋巴細(xì)胞再加上粘附于培養(yǎng)容器的淋巴細(xì)胞的雙方均進(jìn)行 繼代培養(yǎng)。
[0060] 此外，工序（a)的活化培養(yǎng)中，關(guān)于培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的淋巴細(xì)胞數(shù)，沒(méi)有特別限定，但 如果細(xì)胞培養(yǎng)中培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)過(guò)少，則到細(xì)胞增殖曲線抬高所需的時(shí)期延長(zhǎng)，相反 地，如果過(guò)多，則提前達(dá)到平臺(tái)期，不能采用添加培養(yǎng)液來(lái)增加總量等的方法，所以無(wú)法獲 得足夠量的細(xì)胞。因此，優(yōu)選對(duì)開(kāi)始時(shí)的接種數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使淋巴細(xì)胞的增殖曲線迅速抬 高，同時(shí)上述T細(xì)胞群增殖、在活化淋巴細(xì)胞中占有的比例迅速地上升，從而能夠獲得足夠 量的細(xì)胞。例如，優(yōu)選調(diào)整為1. 0X105?1. 0X106個(gè)細(xì)胞/mL、優(yōu)選1.5 X105?6. 0X105 個(gè)細(xì)胞/mL、更優(yōu)選4. ΟΧ 105?6. ΟΧ 105個(gè)細(xì)胞/mL再開(kāi)始培養(yǎng)。此外，關(guān)于培養(yǎng)容器的 容量及培養(yǎng)液量，可以考慮操作性來(lái)進(jìn)行適當(dāng)選擇，可以舉出例如在225cm 2的燒瓶中使用 50mL培養(yǎng)液、在25cm2的燒瓶中使用5mL培養(yǎng)液的例子。
[0061] 如上所述，本發(fā)明中的活化培養(yǎng)中，關(guān)于抗CD3抗體，從淋巴細(xì)胞的增殖效率、操 作的容易性的觀點(diǎn)來(lái)考慮，優(yōu)選固相化后進(jìn)行使用。作為固相化抗CD3抗體的支持體，可 以使用由玻璃、聚氨酯、聚烯烴、聚苯乙烯等材質(zhì)構(gòu)成的各種燒瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板（plate)、 袋。因?yàn)槿菀撰@得，也可以使用市售的塑料制的已滅菌的細(xì)胞培養(yǎng)用燒瓶等器具，其大小可 以進(jìn)行適當(dāng)選擇。關(guān)于上述抗體的固相化方法，也可以施行利用非特異性吸附或化學(xué)鍵合 的方法，只要是通過(guò)固相化了的抗CD3抗體可以對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激的固相化方法，則可 以是任意方法。固相化可以通過(guò)將所述抗CD3抗體的稀釋液注入用來(lái)進(jìn)行固相化的器具 中、于例如4?37°C下靜置2?24小時(shí)來(lái)進(jìn)行。關(guān)于所述抗⑶3抗體的稀釋液，優(yōu)選將抗 ⑶3抗體在經(jīng)滅菌的杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)等生理 性緩沖液中稀釋成1?30 μ g/mL的濃度而用作為稀釋液。經(jīng)固相化的器具在直至使用前可 以保存在冷藏室（cold room)、冰箱（4°C )中，優(yōu)選在使用時(shí)除去所述稀釋液、用常溫的杜 氏磷酸鹽緩沖液等生理性緩沖液進(jìn)行清洗。此外，如上所述，在本發(fā)明中的活化培養(yǎng)中，從 淋巴細(xì)胞的增殖效率的觀點(diǎn)來(lái)考慮，優(yōu)選在培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基中使用白細(xì)胞介素2 (IL-2)。 優(yōu)選將IL-2稀釋為使培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基的濃度為1?2000U/mL而使用。作為所述IL-2,可 以使用市售品。IL-2可以溶解在水、生理鹽水、杜氏磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640、DMEM、MDA、 AIM-V等通常被廣泛使用的細(xì)胞培養(yǎng)用液體培養(yǎng)基等中而使用。此外，其一旦溶解，則優(yōu)選 冷藏保存以防止活性降低。
[0062] 此外，作為上述活化培養(yǎng)中的培養(yǎng)液，只要是適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)液即可， 沒(méi)有特別限定，可以使用含有血清等生物來(lái)源的成分的培養(yǎng)液，或在平衡鹽類溶液中加入 了氨基酸、維生素、核酸堿基等的合成培養(yǎng)基。具體而言，可以舉出RPMI_1640、DMEM、MDA、 AIM-V等，其中特別優(yōu)選AIM-V。關(guān)于培養(yǎng)用培養(yǎng)基，添加了正常人血清的培養(yǎng)基增殖效果 優(yōu)異，因此優(yōu)選。這些培養(yǎng)基及人血清可以使用市售品。培養(yǎng)可以按照通常的細(xì)胞培養(yǎng)方 法來(lái)進(jìn)行。例如，可以在C0 2培養(yǎng)箱（incubator)內(nèi)進(jìn)行。C02濃度為1?10%、特別優(yōu)選 為5%，溫度為30?40°C、特別優(yōu)選為37°C，濕度為90?100%、特別優(yōu)選為95%。
[0063] 本發(fā)明中的高增殖培養(yǎng)法中，在上述活化培養(yǎng)的前后，也可以進(jìn)行用于使淋巴細(xì) 胞增殖的培養(yǎng)。作為所述培養(yǎng)，可以舉出在存在IL-2、且不存在抗CD3抗體的條件下進(jìn)行的 培養(yǎng)（擴(kuò)大培養(yǎng)、擴(kuò)增培養(yǎng)），其培養(yǎng)基成分可以進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。例如，可以舉出在工序（c) 中對(duì)解凍了的淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)之后實(shí)施的擴(kuò)增培養(yǎng)中，對(duì)懸浮淋巴細(xì)胞及粘附淋巴 細(xì)胞進(jìn)行傳代、實(shí)施4?13天的培養(yǎng)。此外，作為上述擴(kuò)大培養(yǎng)、擴(kuò)增培養(yǎng)中的培養(yǎng)液，只要 是適于淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)的培養(yǎng)液即可，沒(méi)有特別限定，可以使用含有血清等生物來(lái)源的成 分的培養(yǎng)液，或在平衡鹽類溶液中加入了氨基酸、維生素、核酸堿基等的合成培養(yǎng)基，可以 獲得市售品。具體而言，可以舉出RPMI_1640、DMEM、IMDA、AIM-V等，其中特別優(yōu)選AIM-V。
[0064] 此外，工序（b)中的所謂"基于淋巴細(xì)胞密度……進(jìn)行檢測(cè)"，是指在工序（a)中對(duì) 淋巴細(xì)胞進(jìn)行的體外活化培養(yǎng)中，根據(jù)需要，直至細(xì)胞密度達(dá)到一定的閾值以上之前，在逐 次計(jì)測(cè)培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)的同時(shí)作出繼續(xù)進(jìn)行活化培養(yǎng)的判斷。如果細(xì)胞密度達(dá)到一定的 閾值、例如4X 105個(gè)細(xì)胞/mL以上，則為檢測(cè)到活化培養(yǎng)液中的記憶T細(xì)胞的占有率上升。 所述基于淋巴細(xì)胞密度的檢測(cè)，除包括使用顯微鏡對(duì)淋巴細(xì)胞數(shù)的直接測(cè)定、使用細(xì)胞計(jì) 數(shù)裝置的直接測(cè)定以外，還包括從一定的細(xì)胞培養(yǎng)條件下間接地檢測(cè)到淋巴細(xì)胞數(shù)。即，還 包括如下進(jìn)行的檢測(cè)：根據(jù)預(yù)先將規(guī)定細(xì)胞數(shù)的淋巴細(xì)胞在一定的活化培養(yǎng)條件下進(jìn)行培 養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞數(shù)的測(cè)定數(shù)據(jù)，間接地推測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)。此外，對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)時(shí)，一 部分細(xì)胞附著于培養(yǎng)容器的底面進(jìn)行活化增殖，一部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中進(jìn)行增殖。另 一方面，在活化培養(yǎng)中，一邊逐次計(jì)測(cè)培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)一邊繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。因此有時(shí)多次 計(jì)測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)。該情況下，如果將附著于底面的淋巴細(xì)胞用移液管等剝離、將剝離淋巴細(xì) 胞和懸浮淋巴細(xì)胞制成均勻的混懸液來(lái)進(jìn)行計(jì)測(cè)，則有時(shí)剝離了的淋巴細(xì)胞于剝離后停止 增殖。從收獲更多的淋巴細(xì)胞的觀點(diǎn)來(lái)考慮這存在問(wèn)題，因此，對(duì)培養(yǎng)中的細(xì)胞數(shù)的計(jì)測(cè)優(yōu) 選不使附著的細(xì)胞剝離地對(duì)懸浮淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)測(cè)。由于可以認(rèn)為懸浮淋巴細(xì)胞數(shù)與附 著淋巴細(xì)胞數(shù)和總淋巴細(xì)胞數(shù)在一定程度上相關(guān)，因此可以通過(guò)計(jì)測(cè)懸浮淋巴細(xì)胞數(shù)來(lái)推 算增殖的趨勢(shì)。因此，從操作簡(jiǎn)便的簡(jiǎn)便性和防止由其產(chǎn)生污染的觀點(diǎn)、以及從促進(jìn)增殖的 觀點(diǎn)來(lái)考慮，計(jì)測(cè)懸浮淋巴細(xì)胞是有用的。此外，從收率等觀點(diǎn)來(lái)考慮，優(yōu)選在培養(yǎng)結(jié)束時(shí) 通過(guò)輕拍將附著于培養(yǎng)容器底面的細(xì)胞也剝離下來(lái)、對(duì)總淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)測(cè)。
[0065] 因此，工序（b)中的所謂"記憶T細(xì)胞群的占有率上升"，是指工序（a)中經(jīng)過(guò)活化 培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的總數(shù)中的記憶T細(xì)胞的占有比例的上升，具體而言，記憶T細(xì)胞的占有率 達(dá)到例如80%以上、優(yōu)選85%以上、90 %以上、更優(yōu)選95%以上。該記憶T細(xì)胞的占有率也 可以通過(guò)使用流式細(xì)胞儀利用抗體直接對(duì)CD3、CD45R0、CD62L等細(xì)胞表面抗原進(jìn)行調(diào)查來(lái) 算出。此外，作為以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)中的、基于淋巴細(xì)胞密 度檢測(cè)記憶T細(xì)胞群的占有率上升的手段，可以舉出通常用于測(cè)定淋巴細(xì)胞數(shù)的手段，例 如懸浮淋巴細(xì)胞的細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置等。
[0066] 工序（b)中的"冷凍保存"可以按照通常的細(xì)胞冷凍方法來(lái)進(jìn)行。例如，可以將淋 巴細(xì)胞混懸于Bambanker (Lymphotec公司制）、CP_1 (極東制藥工業(yè)株式會(huì)社制）等細(xì)胞冷 凍保存液制品中并貯藏于冷凍保存容器中，將該容器放入凍存杯（BICELL)(日本Freezer 公司制）中，暫時(shí)保管于-80°C的超低溫冰箱（三洋電機(jī)株式會(huì)社制）中，2天后移入液氮 罐（MVE)中，作為冷凍保存細(xì)胞保存在液氮中。此外，從冷凍·解凍后的活化培養(yǎng)中的增殖 曲線抬高的觀點(diǎn)來(lái)考慮，優(yōu)選對(duì)1個(gè)冷凍保存容器中貯藏的淋巴細(xì)胞數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)，優(yōu)選每1 個(gè)冷凍保存容器中保存IX 1〇7?5. OX 107個(gè)細(xì)胞?？蓪⒈４嬗诙鄠€(gè)冷凍保存容器中的細(xì) 胞進(jìn)行合并、用于冷凍解凍后的培養(yǎng)，但是從操作的容易性及品質(zhì)管理的觀點(diǎn)來(lái)考慮，優(yōu)選 將1個(gè)冷凍保存容器中的淋巴細(xì)胞移至1個(gè)或2個(gè)以上的培養(yǎng)容器中進(jìn)行培養(yǎng)。此外，作 為以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)中的淋巴細(xì)胞的冷凍保存手段，可以 舉出通常被用于冷凍保存細(xì)胞的手段，例如冷凍保存容器、凍存杯、超低溫冰箱、液氮罐等。 [0067] 工序（c)中對(duì)被冷凍了的淋巴細(xì)胞的"解凍"可以按照通常的冷凍細(xì)胞的解凍方 法來(lái)進(jìn)行。例如，可以通過(guò)使用37°C的干式加熱單元（Dry thermo unit, Taitec公司制） 等加熱處理4分鐘來(lái)進(jìn)行解凍。優(yōu)選通過(guò)在將所述解凍了的淋巴細(xì)胞移入適量的培養(yǎng)基中 后于室溫下進(jìn)行離心操作、除去上清液來(lái)除去細(xì)胞冷凍保存液。此外，關(guān)于所述解凍后的 淋巴細(xì)胞的活化培養(yǎng)，還可以在抗CD3抗體存在下的活化培養(yǎng)之后進(jìn)一步繼續(xù)進(jìn)行不存在 抗CD3抗體的活化刺激下的擴(kuò)增培養(yǎng)。即，可以繼續(xù)在未固相化抗CD3抗體的器具（例如， 培養(yǎng)用燒瓶、轉(zhuǎn)瓶（roller bottle)、透氣性培養(yǎng)袋等）中繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)直至獲得大量的細(xì) 胞。此時(shí)，優(yōu)選為白細(xì)胞介素2(IL-2)存在下進(jìn)行。關(guān)于上述條件下的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)，除 沒(méi)有抗CD3抗體的刺激以外，人血清的濃度等優(yōu)選與存在活化刺激的培養(yǎng)的條件相同，從 操作性、成本性、安全性等方面來(lái)看，更優(yōu)選適時(shí)地使用無(wú)血清培養(yǎng)基。此外，作為以記憶T 細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)中的對(duì)被冷凍的淋巴細(xì)胞的解凍手段，可以舉出 通常用于冷凍細(xì)胞的解凍的手段，例如干式加熱單元等。
[0068] 根據(jù)本發(fā)明的以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法，能夠獲得包含 75%以上、優(yōu)選80%以上、85%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上的記憶T細(xì)胞 的淋巴細(xì)胞群，包含70%以上、更優(yōu)選75%以上、80%以上、85%以上、更優(yōu)選90%、進(jìn)一步 優(yōu)選95%以上的中央型記憶T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞群。此外，本發(fā)明可以制成含有上述以記憶 T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群作為有效成分的、用于過(guò)繼性免疫療法或用于施予至第三 者的醫(yī)藥組合物。所述醫(yī)藥組合物可以用作為抗腫瘤劑、HIV治療藥物、病毒感染癥治療藥 物、自身免疫性疾病治療藥物、細(xì)胞或器官移植后的移植細(xì)胞或器官的成活促進(jìn)藥物、預(yù)防 腫瘤復(fù)發(fā)的藥物。此外，本發(fā)明的以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群由于記憶T細(xì)胞 群的比率高達(dá)80%以上，所以可以不實(shí)施使用針對(duì)淋巴細(xì)胞群的細(xì)胞表面存在的表面抗原 的抗體等來(lái)分離記憶T細(xì)胞群等繁雜的分離濃縮操作，而將其混懸于合適的溶液中而得的 混懸液用作為醫(yī)藥材料。作為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的形態(tài)，優(yōu)選為非經(jīng)口施予，優(yōu)選為混懸 了本發(fā)明的淋巴細(xì)胞群的注射劑、點(diǎn)滴劑等液狀。特別地，更優(yōu)選為將本發(fā)明的淋巴細(xì)胞群 混懸于以0. 01?5%的量添加了人血清白蛋白的輸液用生理鹽水等中的注射劑、點(diǎn)滴劑， 但并不限定于此。作為施予方法，優(yōu)選為向靜脈的點(diǎn)滴或向靜脈、動(dòng)脈、局部等的注射。施 予的液量根據(jù)施予方法、施予的部位的不同而不同，通常優(yōu)選為1?500mL，優(yōu)選使此液量 中包含下文所述的淋巴細(xì)胞給藥量的淋巴細(xì)胞數(shù)。此外，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中，除含有記 憶T細(xì)胞含量高的淋巴細(xì)胞群以外，還可含有穩(wěn)定劑、緩沖液成分、其他治療藥物、補(bǔ)充劑 等。關(guān)于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的施予量、施予次數(shù)、施予時(shí)期等、以及本發(fā)明的醫(yī)藥組合物 中的淋巴細(xì)胞群的濃度，沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)施予對(duì)象的體征、病情、體重、年齡、性別 等進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，在通常的情況下，優(yōu)選以1X10 2個(gè)?1X109個(gè)為基準(zhǔn)來(lái)設(shè)定相對(duì)于施予 對(duì)象的每lKg體重的淋巴細(xì)胞施予量。為進(jìn)一步有效,優(yōu)選將相對(duì)每lKg體重的淋巴細(xì)胞 施予量設(shè)定為1X 1〇3個(gè)以上，但是由于即使大于5X 108個(gè)也不能預(yù)見(jiàn)到效力進(jìn)一步增大， 所以最優(yōu)選將每lKg體重的施予量設(shè)定為1 X 103個(gè)?5 X 108個(gè)。關(guān)于施予頻率，可以優(yōu)選 地舉出1次/天?1次/月，此外，施予次數(shù)必須為至少1次以上。在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物 的使用中，也可以并用其他的手術(shù)、給藥治療。
[0069] 以下給出實(shí)施例，具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于以下記載。
[0070] 實(shí)施例1
[0071] [淋巴細(xì)胞的活化增殖]
[0072] (1)外周血淋巴細(xì)胞的制備
[0073] 以添加肝素的方式從靜脈采集3名已征得同意的健康人的外周血各50mL。將各 采血測(cè)試樣品移至250mL的離心沉淀管（BD Falc〇n;352075)中，在每份測(cè)試樣品中加入 100mL清洗用溶液（添加了 0. 1%的人白蛋白的生理鹽水：生理鹽水500mL，制造商：大塚制 藥，2. OmL 25%人獻(xiàn)血白蛋白，制造商：田邊三菱制藥），慢慢地混合，稀釋3倍。包括本操 作在內(nèi)的以下操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。對(duì)于每1份測(cè)試樣品，在4支注入了 15mL的聚蔗糖 (Ficoll)(GE Healthcare Bioscience 公司制）的 50mL 離心沉淀管（BD Falcon ;352070) 中使經(jīng)3倍稀釋的血液重層，將該離心沉淀管于室溫下以ISOOrpm連續(xù)離心20分鐘（離心 機(jī)：株式會(huì)社K0KUSAN制；H-700)。將中間層的單核細(xì)胞層回收至預(yù)先注入了清洗用溶液 的50mL離心沉淀管中。蓋上離心沉淀管的蓋，顛倒混合2?3次，于室溫下以1800rpm離 心15分鐘。離心后除去上清液，使沉淀物分散，然后添加清洗用溶液，得到了總量為50mL 的細(xì)胞混懸液。將所述混懸液于常溫下以1800rpm離心10分鐘，在得到的沉淀物中加入 5〇1111^的培養(yǎng)基1(含有2 (%人血清（1^115)11(^6(3公司制）及 35011/1]11^的1'11^-2(?1'〇16111^11: Novartis公司制）的AIM-V培養(yǎng)基（Invitrogen公司制）），混懸，得到了細(xì)胞混懸液。
[0074] 將40μ L的提爾克氏溶液（Turk's solution)(武藤化學(xué)藥品公司制）注入至5mL 圓底試管（BD Falcon ;352008)中，向其中加入10 μ L上述細(xì)胞混懸液并混合，將10 μ L混 合液灌入Neubauer型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（Elmer公司制；9731)，在顯微鏡（Olympus光學(xué)工業(yè)株 式會(huì)社制；211320)下算出了細(xì)胞數(shù)。
[0075] 此外，將20 μ L的臺(tái)盼藍(lán)染色液（SIGMA公司制；93595)注入至5mL圓底試管（BD Falcon ;352008)中，向其中混合10 μ L上述細(xì)胞混懸液，將10 μ L混合液灌入Neubauer型 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)測(cè)未被染色的活細(xì)胞，算出了存活率。
[0076] ⑵0KT3固相化燒瓶的制備
[0077] 用生理鹽水將0KT3 (進(jìn)口銷售商：Janssen協(xié)和株式會(huì)社，制造商：0rtho Pharmaceutical :0KT3注）溶液調(diào)配為5 μ g/mL，將10mL調(diào)配液注入至底面積為225cm2的 培養(yǎng)用燒瓶（住友Bakelite株式會(huì)社制；MS-2180R)中，使底面全部被0KT3溶液覆蓋。靜 置3小時(shí)以上，然后用吸引機(jī)吸取燒瓶?jī)?nèi)的0KT3溶液，注入約100mL的生理鹽水（制造商： 大塚制藥），蓋上燒瓶蓋，劇烈振蕩，然后棄去其中的液體。再次將約lOOmL的生理鹽水（制 造商：大塚制藥）灌入燒瓶中，使固相化面朝下，于室溫下靜置15分鐘。其后，蓋上蓋，劇 烈振蕩1分鐘，棄去其中的液體。用吸引機(jī)小心地吸取殘留在燒瓶?jī)?nèi)和瓶蓋上的液體，得到 了 0KT3固相化燒瓶。如果在制備當(dāng)天不使用，則保留少量的生理鹽水，直至使用前保存于 4。。。
[0078] 對(duì)于底面積為25cm2的培養(yǎng)用燒瓶（住友Bakelite株式會(huì)社制；MS2105R)，也與 上述記載同樣地實(shí)施了固相化處理。
[0079] (3)對(duì)接種淋巴細(xì)胞數(shù)的研究-1
[0080] 將（1)中制備的細(xì)胞混懸液于室溫下以800rpm離心15分鐘。用培養(yǎng)基1將細(xì) 胞密度分別調(diào)配為 〇· 2X105 個(gè) /mL、l. 0X105 個(gè) /mL、2. 0X105 個(gè) /mL、2. 0X106 個(gè) /mL、 6. OX 106個(gè)/mL。將各細(xì)胞密度的細(xì)胞混懸液以各5mL分別注入接種至上述（2)中制備的 0KT3固相化25cm 2瓶中，用培養(yǎng)基1在TE-HER型C02培養(yǎng)箱（HIRASAWA公司制）內(nèi)以溫度 37.0±0.51：、濕度95.0±5.0%、0) 2濃度5.0±0.2%進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間中合適地采用 與（1)同樣的方法計(jì)測(cè)?算出懸浮細(xì)胞數(shù)和存活率，一邊觀察培養(yǎng)液隨增殖狀態(tài)的顏色變 化一邊適當(dāng)?shù)靥砑优囵B(yǎng)基1，連續(xù)培養(yǎng)10天。并且，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，輕拍培養(yǎng)燒瓶，將附著于 底面的淋巴細(xì)胞也進(jìn)行回收，用與（1)同樣的方法計(jì)測(cè)?算出了總淋巴細(xì)胞數(shù)及存活率。
[0081] 結(jié)果：
[0082] 由表1可知，接種細(xì)胞密度為0. 2 X 105個(gè)/mL時(shí)，即使培養(yǎng)10天也不能獲得足夠 的細(xì)胞數(shù)，此外，為6X106個(gè)/mL時(shí)，增殖低下、存活率也不良，由此判定了這兩種接種細(xì)胞 密度不合適。進(jìn)一步地，在存活率不會(huì)成為90%以下的接種細(xì)胞密度1. 0X105個(gè)/mL和 2. 0X106個(gè)/mL之間，對(duì)接種細(xì)胞密度進(jìn)行了進(jìn)一步研究。此外，本研究中，以培養(yǎng)液的顏 色變化和懸浮細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)加了培養(yǎng)基1，為了使操作更簡(jiǎn)便、實(shí)現(xiàn)更迅速的細(xì)胞 增殖，需要從細(xì)胞密度和培養(yǎng)天數(shù)來(lái)確定培養(yǎng)基的補(bǔ)加時(shí)期，因此對(duì)培養(yǎng)液補(bǔ)加時(shí)期進(jìn)行 了研究。
[0083] 表1接種細(xì)胞密度和增殖及存活率的變化
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造方法，所述制造方法利用依次包括以 下工序（a)?（C)的高增殖培養(yǎng)法來(lái)進(jìn)行， 工序（a)，對(duì)采集的淋巴細(xì)胞進(jìn)行活化培養(yǎng)； 工序（b)，基于淋巴細(xì)胞密度檢測(cè)到記憶T細(xì)胞群的占有率上升，將工序（a)的淋巴細(xì) 胞進(jìn)行冷凍保存； 工序（c)，對(duì)被冷凍的淋巴細(xì)胞進(jìn)行解凍、活化培養(yǎng)。
2. 如權(quán)利要求1所述的制造方法，其特征在于，工序（b)中基于淋巴細(xì)胞密度對(duì)記憶T 細(xì)胞群的占有率上升進(jìn)行的檢測(cè)以懸浮于培養(yǎng)液中的淋巴細(xì)胞數(shù)為指標(biāo)。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其特征在于，工序（b)中的淋巴細(xì)胞密度為：懸 浮于培養(yǎng)液中的淋巴細(xì)胞數(shù)為4X 105個(gè)細(xì)胞/mL以上。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，活化培養(yǎng)為在IL-2及固 相化抗CD3抗體的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，工序（c)于解凍后2周以 內(nèi)完成。
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，以記憶T細(xì)胞為主要成分 的淋巴細(xì)胞群為淋巴細(xì)胞群中記憶T細(xì)胞的占有率為75%以上的淋巴細(xì)胞群。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，記憶T細(xì)胞以占淋巴細(xì)胞 群的70%以上的比例含有中央型記憶T細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，經(jīng)分離的淋巴細(xì)胞來(lái)自人 外周血。
9. 如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，淋巴細(xì)胞群是用于施予至 第三者的細(xì)胞群。
10. -種淋巴細(xì)胞群，其特征在于，含有占淋巴細(xì)胞群的75%以上的記憶T細(xì)胞。
11. 如權(quán)利要求10所述的淋巴細(xì)胞群，其特征在于，含有占淋巴細(xì)胞群的70%以上的 中央型記憶T細(xì)胞。
12. -種醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物以權(quán)利要求10或11所述的淋巴細(xì)胞群為有效成 分。
13. 以記憶T細(xì)胞為主要成分的淋巴細(xì)胞群的制造系統(tǒng)，所述制造系統(tǒng)為包括以下 (A)?（D)的手段、利用高增殖培養(yǎng)法的制造系統(tǒng)，所述手段為： 手段（A)，淋巴細(xì)胞的活化培養(yǎng)手段； 手段（B)，基于淋巴細(xì)胞密度檢測(cè)記憶T細(xì)胞群的占有率上升的手段； 手段（C)，淋巴細(xì)胞的冷凍保存手段； 手段（D)，對(duì)被冷凍的淋巴細(xì)胞進(jìn)行解凍的手段。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104204195SQ201380018924
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月10日
【發(fā)明者】關(guān)根暉彬, 大隅一興, 小森啟一郎, 清水則夫 申請(qǐng)人:株式會(huì)社淋巴技術(shù)