專利名稱：快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬基因工程技術領域，涉及一種快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法，用于多種質粒的高效轉化與染色體基因的敲除。
背景技術：
黃單胞菌Xcc 8004是一種具有植物致病性的革蘭氏陰性菌，可引起十字花科植物的“黑腐病”，會對農業(yè)生產造成極大的影響。黃單胞菌可通過植物的氣孔、根系或者傷口感染十字花科植物如卷心菜、西蘭花、花菜及擬南芥等。開展對黃單胞菌質粒轉化與基因改造方法的研究有利于提高其DNA轉化、基因敲除及染色體修飾的效率，推進其致病機制的研究和防范策略的開發(fā)。
因黃單胞菌可分泌多種胞外酶和胞外多糖，其對化學處理十分不敏感，因此電轉化方法成為外源DNA進入黃單胞菌的首選方法。但是，已報道的黃單胞菌電轉化方法的質粒轉化效率遠遠低于大腸桿菌的電轉化效率，主要是黃單胞菌胞外分泌的多種蛋白和多糖的去除效率會直接影響電轉化感受態(tài)細胞的敏感性，外源DNA難于進入細胞內，因而降低了電轉化效率。另一方面，基因改造是開展黃單胞菌致病機制研究的必經步驟?，F(xiàn)有的黃單胞菌基因替換方法是利用不可復制質粒，通過與特定的大腸桿菌菌株進行接合，來實現(xiàn)質粒整合與基因重組。這種方法操作復雜，耗時較長，且效率偏低。因此，開發(fā)新方法來提高黃單胞菌的質粒轉化與基因改造效率，簡化黃單胞菌基因修飾過程，具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的，是為了提高黃單胞菌的DNA轉化和基因替換效率，簡化操作步驟，提供一種快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法及其應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術方案一種快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法，包括如下步驟a、將黃單胞菌8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時；b、挑取單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過夜培養(yǎng);C、等分過夜培養(yǎng)物到四個5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min,收集細胞；d、用Iml的250mM鹿糖溶液重懸菌體,室溫下以12000rpm/min離心2min,重復上述重懸-離心步驟三次，收集細胞；e、每管細胞中加入25μ I的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細胞后，分裝50μ I/管，-80°C凍存，得到細胞終濃度為109-101(lCFU/ml的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞。上述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，包括以下步驟A、取50 μ I黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞，加入相應量的質粒DNA，混勻后轉入預冷的電轉化杯電擊；
B、電擊后，迅速在電轉化杯中加入Iml LB液體培養(yǎng)基并轉移至試管中，28°C搖培I 3小時；C、將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個小時后觀察克隆生長情況與計算克隆數(shù)目。上述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其中，所述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的細胞濃度0D_為O. 4-1. 2，所述相應量的質粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時的電擊強度為10_20KV/cm。經檢測，上述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法的最佳條件是，黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的細胞濃度0D_為O. 6-1. 0，質粒DNA的量為50ng I μ g，電擊時的電擊強度為14-18KV/cm，28°C搖培時間為2小時。上述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其中，所述的質粒包括可復制質粒和不可復制質粒，可復制質粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed ;不可復制質粒包括pK18mobsacB-Xcl075 和 pK18mobsacB_Xc2659 ;可復制質粒 DNA 的量為 50ng I μ g，不可復制質粒DNA的量為500ng I μ g。上述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其中，所述的抗性平板含四環(huán)素10 μ g/ml或卡那霉素10 μ g/ml。上述快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法用于可復制質粒與不可復制質粒的高效轉化；可復制質粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed ;不可復制質粒包括pK18mobsacB_Xcl075 或 pK18mobsacB_Xc2659。本發(fā)明利用蔗糖溶液在室溫下經重懸-離心方法處理過夜培養(yǎng)細胞，來制備黃單胞菌高效電轉化感受態(tài)細胞，全程僅需十五分鐘。該方法克服了傳統(tǒng)電轉化方法的耗時較長，效率偏低，操作復雜等缺點。與現(xiàn)有轉化方法相比，本發(fā)明的方法的轉化效率提高了約100倍。本方法可用于可復制質粒與不可復制質粒的高效快速轉化。在最佳條件下，可復制質粒的轉化效率可達IO9CFU/μ g DNA，不可復制質粒的轉化效率約150CFU/l·! g DNA。因此，本方法簡化了黃單胞菌電轉化操作，推進了基因敲除的進程。


圖I、圖2、圖3為不同條件下Xcc8004感受態(tài)細胞的電轉化效率。圖中所用質粒均為pUFR027，其中圖I為DNA濃度的影響。DNA濃度為50ng至I μ g，其它條件為=OD6tltl = O. 8，電擊強度為14KV/cm，孵育時間為2小時。圖2為細胞濃度的影響。選用處于不同濃度的細胞制備感受態(tài)，細胞濃度為0D_=O. 4 I. 2，其它條件為200ng質粒DNA，電擊強度為14KV/cm，孵育時間為2小時。圖3為電擊強度的影響。電擊強度為12KV/cm 20KV/cm，其它條件為200ng質粒DNA，OD600 = O. 8，孵育時間為2小時。上述實驗均重復三次，計算平均值后作圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施不局限于此。
實施例I :可復制質粒的電轉化和不同條件下的轉化效率檢測一、電轉化感受態(tài)細胞的制備本例中使用Xcc8004作為目標菌株來制備電轉化感受態(tài)細胞。將Xcc8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時。挑取單克隆接種于IOml LB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過夜培養(yǎng)。等分過夜培養(yǎng)物到四個5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min，收集細胞。用Iml的250mM蔗糖溶液重懸菌體，室溫下以12000rpm/min離心2min。重復該重懸-離心步驟三次。最后每管細胞中加入25 μ I的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細胞后，分裝50 μ I/管，-80°C凍存。細胞終濃度為109-101(lCFU/ml。二、電轉化質粒；本例中使用電轉化儀為Bio-Rad GenePulser II,電轉化杯為O. Icm電擊杯。測定 質粒大小、質粒濃度、細胞濃度、電場強度及孵育時間對黃單胞菌電轉化效率的影響。在細胞生長至0D_介于O. 4 I. 2時，按照上述方法制備感受態(tài)細胞。取50 μ I感受態(tài)細胞，加入不同濃度質粒(50ng Iyg)，混勻后轉入預冷的電擊杯，以不同電場強度電擊(10KV/cm 20KV/cm)。電擊后,迅速在電轉化杯中加入Iml LB液體培養(yǎng)基并轉移至試管中，28°C搖培I 3小時。將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個小時后觀察克隆生長情況與計算克隆數(shù)目。本例中檢測了三種可在黃單胞菌中復制的質粒pUFR027、pDN19和pRKaraRed，分別對三種質粒進行轉化，測定其轉化效率，結果見圖I、圖2、圖3。我們選擇了以下條件來進行感受態(tài)細胞的制備與質粒的電轉化細胞濃度0D_ = 0. 8，200ng的質粒DNA，電擊強度14KV/em，孵育時間2小時。結果顯示，這三種質粒均可在黃單胞菌中復制，轉化克隆數(shù)目約為IO9CFUz^g DNA，轉化效率比公開的報道高出約100倍。之后，我們選用質粒pUFR027來檢測DNA濃度、細胞濃度、電擊強度及復蘇時間對電轉化效率的影響。結果顯示，增加質粒DNA的濃度可顯著提高轉化效率。當質粒DNA濃度從50ng增加到I μ g時，相同條件下的轉化效率可從IO6CFU/ μ g DNA提高到IO8CFU/ μ g DNA (參見圖I)。但50_100ng質粒DNA的轉化效率即可滿足大多數(shù)實驗的要求。同時，選用不同濃度的細胞來制備感受態(tài)細胞，其轉化效率存在差異。以細胞濃度在0D_ = O. 6 I. O時，其轉化效率最高(參見圖2)。電擊強度也會影響電轉化的效率，過低或過高的電擊強度均會影響轉化效率。當電擊強度為14 18KV/em時，電轉化的效果最好(參見圖3);此時電擊時間約為5. 0ms。此外,復蘇時間對電轉化效率具有十分顯著的影響。若電擊后細胞不經復蘇直接涂抗性平板，轉化效率僅為IO3CFUz^g DNA。然而，若在電擊后孵育一到兩小時可顯著地提高轉化效率，參見表I。一小時的復蘇培養(yǎng)是提高轉化效率所必需的條件，兩小時的孵育培養(yǎng)則可基本達到最高轉化效率。因此，經過優(yōu)化，黃單胞菌Xcc8004的感受態(tài)制備與電轉化最佳條件為·》50ng可復制質粒DNA或彡500叩不可復制質粒0嫩，細胞00_為0.6 1.0，電擊強度為14 18KV/cm,電擊后培養(yǎng)兩小時。實施例2 :不可復制質粒的轉化和基因XC_1075、XC_2659的敲除不可復制質粒主要用于染色體整合、基因修飾和基因敲除。傳統(tǒng)的黃單胞菌基因改造方法是通過與大腸桿菌S17-l( λ pir)接合來實現(xiàn)的。本例以本發(fā)明方法來制備電轉化感受態(tài)細胞，采用將不可復制質粒直接電擊轉化到黃單胞菌Xcc8004的方法來實現(xiàn)質粒的整合與基因的敲除。XC_1075和XC_2659兩個基因被選為目標基因，編碼了黃單胞菌的葡萄糖脫氫酶基因。引物由Invitrogen公司(上海，中國)合成。PCR反應使用KOD plus聚合酶(Τ0Υ0Β0,日本)擴增。限制性內切酶與T4連接酶均購自Fermentas公司(加拿大)。質粒DNA的提取與PCR產物純化均使用試劑盒(Qiagen，德國)。我們首先利用不可復制質粒pK18mobsacB構建了兩個重組質粒pK18mobsacB-Xcl075和pK18mobsaeB_Xc2659。每個基因使用兩個引物對來擴增目標基因的上游500bp片段(U500)和下游500bp片段(D500)XC1075-U-F :5，-GTAGGAATTCatgactgatcaatcctetaaacgcggg-3，；XC1075-U-R :5，_ctgaacggcgttgccgcatc_3，XC1075-D-F :5，-gcagcaagaccaagggctacatg-3，；
XC1075-D-R :5，-GTAGAAGCTTttatttggcgctggcggcc-3，。XC2659-U-F :5，-GTAGGAATTCatgtcgacattgcttcgtccctccc-3’ ；XC2659-U-R :5，-gggcgattgaccacacctgcg-3，；XC2659-D-F :5，-gtggcgatgecggtggtgc-3，；XC2659-D-R :5，-GTAGAAGCTTttaccgctgcggcaacgcgtag-3，。同時，以質粒pEX18Gm為模板，分別PCR擴增兩側帶有與XC1075-U500/D500和XC2659-U500/D500片段同源的20bp序列的慶大霉素基因XC1075_accCl和XC2659_accCl，PCR擴增所用引物序列為accCl-1075-F :5，-GATGCGGCAACGCCGTTCAGatgttacgcagcagcaacgatgt-3，；accCl-1075-R :5，-GTAGCCCTTGGTCTTGCTGCttaggtggcggtacttgggt_3，；accCl-2659-F :5，-GCAGGTGTGGTCAATCGCCCatgttacgcagcagcaacgatgt-3，；accCl-2659-R :5，-GTGGCGATGCCGGTGGTGCAttaggtggcggtacttgggt-3，。之后，分別以三個片段XC1075-U500/D500/accCl 和 XC2659_U500/D500/accCl 為模板，利用引物對 XC1075-U-F/XC1075-D-R 和 XC2659-U-F/XC2659-D-R 進行重疊 PCR 擴增，獲得融合片段。最后，分別將兩個融合片段與質粒pK18mobSacB進行EcoR I/Hind III雙酶切，回收酶切片段后用T4DNA連接酶進行連接，獲得質粒pK18mObsaCB-XC1075和質粒pK18mobsacB_Xc2659。我們按照最優(yōu)的電轉化條件進行質粒pK18mobsacB_Xcl075和pK18mobsacB-Xc2659的電轉化，即:IOOOng質粒DNA，細胞OD600為O. 6 I. 0，電擊強度為14 18KV/cm，電擊后培養(yǎng)兩小時。在抗性平板上篩選后可獲得約150個克隆/μ g DNA(參見表2)，遠高于傳統(tǒng)的接合方法中的約30個克隆/μ gDNA的轉化效率。與可復制質粒的轉化相比，不可復制的質粒的有效轉化需要至少500ng的DNA才能實現(xiàn),質粒濃度的增加也可明顯提高轉化的效率。由于不可復制質粒不能在黃單胞菌中進行復制，因此轉化后的抗性篩選獲得的克隆均為質粒整合或重組后的結果。因此，該方法可有效地實現(xiàn)不可復制質粒的轉化、整合與染色體基因的敲除。表I可復制質粒轉化Xcc8004感受態(tài)細胞的效率
權利要求
1.一種快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟 a、將黃單胞菌8004菌種在LB固體平板上劃線培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)48小時； b、挑取單克隆接種于IOmlLB液體培養(yǎng)基中，置于28°C搖床上220rpm/min過夜培養(yǎng)； C、等分過夜培養(yǎng)物到四個5ml離心管中，室溫下以8000rpm/min離心5min,收集細胞； d、用Iml的250mM鹿糖溶液重懸菌體,室溫下以12000rpm/min離心2mmin,重復上述重懸-離心步驟三次，收集細胞； e、每管細胞中加入25μI的250mM蔗糖溶液，重懸并合并四管細胞后，分裝50μ I/管，_80°C凍存，得到細胞終濃度為109-101(I°C FU/ml的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞。
2.根據(jù)權利要求I所述的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其特征在于，包括以下步驟 A、取50μ I黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞，加入相應量的質粒DNA，混勻后轉入預冷的電轉化杯電擊； B、電擊后，迅速在電轉化杯中加入ImlLB液體培養(yǎng)基并轉移至試管中，28°C搖培I 3小時； C、將孵育后的培養(yǎng)液涂布于抗性平板上，28°C培養(yǎng)48 72個小時后觀察克隆生長情況與計算克隆數(shù)目。
3.根據(jù)權利要求2所述的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其特征在于所述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的細胞濃度OD_為O. 4-1. 2，所述相應量的質粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時的電擊強度為10-20KV/cm。
4.根據(jù)權利要求2所述的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其特征在于；所述黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的細胞濃度OD_為O. 6-1. 0，所述相應量的質粒DNA的量為50ng I μ g，所述電擊時的電擊強度為14-18KV/cm，所述28°C搖培時間為2小時。
5.根據(jù)權利要求2所述的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其特征在于；所述的質粒包括可復制質粒和不可復制質粒，可復制質粒包括PUFR027、pDN19和PRKaraRed ;不可復制質粒包括 pK18mobsacB-xcl075 和 pK18mobsacB_Xc2659 ;可復制質粒DNA的量為50ng I μ g，不可復制質粒DNA的量為500ng I μ g。
6.根據(jù)權利要求2所述的黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的高效電轉化方法，其特征在于所述的抗性平板含四環(huán)素 ο μ g/ml或卡那霉素10 μ g/ml。
7.根據(jù)權利要求I所述的快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法的應用，其特征在于用于可復制質粒與不可復制質粒的高效轉化；可復制質粒包括PUFR027、pDN19或PRKaraRed ;不可復制質粒包括 pK18mobsacB_Xcl075 或 pK18mobsacB_Xc2659。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速制備黃單胞菌電轉化感受態(tài)細胞的方法及其應用。本發(fā)明利用蔗糖溶液在室溫下經重懸-離心方法處理過夜培養(yǎng)細胞，來制備黃單胞菌高效電轉化感受態(tài)細胞，全程僅需十五分鐘。該方法克服了傳統(tǒng)電轉化方法的耗時較長，效率偏低，操作復雜等缺點。與現(xiàn)有轉化方法相比，本發(fā)明方法的轉化效率提高了約100倍。本方法可用于可復制質粒與不可復制質粒的高效快速轉化。在最佳條件下，可復制質粒的轉化效率可達109CFU/μg DNA，不可復制質粒的轉化效率達150CFU/μg DNA。因此，本方法簡化了黃單胞菌電轉化操作，推進了基因敲除的進程。
文檔編號C12N15/63GK102876610SQ20121037973
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月8日 優(yōu)先權日2012年10月8日
發(fā)明者梁如冰, 馬辰, 劉建華 申請人:上海交通大學