專利名稱：從血液中分離免疫細(xì)胞的方法及其在治療疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從血液中分離免疫細(xì)胞的方法及其在治療疾病中的應(yīng)用，具體涉及從健康人體的血液中分離免疫細(xì)胞并凍存，以及在出現(xiàn)免疫低下或發(fā)生疾病癥狀時(shí)，將免疫細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增并施用于患者進(jìn)行免疫細(xì)胞治療的方法。
背景技術(shù)：
免疫細(xì)胞(immune cell)是白細(xì)胞的俗稱，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞，也特指能識(shí)別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分，在體內(nèi)分布很廣泛。研究發(fā)現(xiàn)血液中蘊(yùn)含豐富的淋巴細(xì)胞，由于這類細(xì)胞具有免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，所以一直受到人們的關(guān)注。淋巴細(xì)胞具有自然殺傷和自我保護(hù)的特性，針對病毒、細(xì)菌、真菌感染的治療均起到關(guān)鍵的作用，在癌癥的治療中具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
免疫細(xì)胞在健康人體的血液中蘊(yùn)含豐富，但由于年齡老化、亞健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫細(xì)胞數(shù)目會(huì)顯著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫細(xì)胞移植給患者則可能引起免疫排斥反應(yīng)；提取免疫細(xì)胞過程對患者的損傷性和在采集時(shí)遇到的其他問題，都直接影響了免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用，使得尋找一種穩(wěn)定可靠的免疫細(xì)胞獲取來源成為一個(gè)重要的問題。研究顯示，健康人的新鮮血液中含有大量有效的免疫細(xì)胞并且能有效分離，這種組織來源的免疫細(xì)胞不僅保持了免疫細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答的生物學(xué)特性，而且分離出來的免疫細(xì)胞具有原始的、強(qiáng)勁的增殖能力，同時(shí)還易于冷凍保存和復(fù)蘇。由于免疫細(xì)胞起源于自身，大大減低了觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡單，對健康的被采集者無任何危害及損傷。以上原因足以令從血液中分離免疫細(xì)胞成為獲得免疫細(xì)胞的有效途徑。但是，目前關(guān)于血液免疫細(xì)胞的分離和擴(kuò)增方法不一，且大多步驟復(fù)雜，獲得較多數(shù)量血液免疫細(xì)胞也存在一定困難，同時(shí)患者在罹患疾病時(shí)采集血液存在一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，本領(lǐng)域需要有從血液中分離、保存和擴(kuò)增免疫細(xì)胞的簡單、有效的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)提取、凍存、復(fù)蘇血液免疫細(xì)胞方法的缺陷，提供一種簡單有效的血液免疫細(xì)胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復(fù)蘇的方法，以及復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用特定操作步驟的提取、凍存、復(fù)蘇以及擴(kuò)增，可以有效地獲得免疫細(xì)胞。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。因此，本發(fā)明第一方面提供了從健康哺乳動(dòng)物的新鮮血液中獲取免疫細(xì)胞的方法，該方法包括以下分離步驟(a)全血樣本預(yù)處理將血樣本充分混勻，轉(zhuǎn)移至離心容器中，稀釋血液；(b) FicolI法分離取離心容器，加入Ficoll細(xì)胞分離液，然后將稀釋后的血液樣本加入Ficoll細(xì)胞分離液的上層，將離心容器置于離心裝置中，離心處理；(C)單個(gè)核細(xì)胞(在本文中可用縮寫MNC表示)收集和洗滌離心處理結(jié)束后，將上層血漿轉(zhuǎn)移至離心容器，吸取白膜層于離心容器內(nèi)，補(bǔ)充生理鹽水，混勻后再次離心處理，待細(xì)胞沉淀后洗滌兩次，得到免疫細(xì)胞；以及任選的下列步驟(d)針對步驟(C)所得免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的步驟(e)單個(gè)核細(xì)胞凍存向步驟(C)提取的免疫細(xì)胞中加入凍存液，重懸免疫細(xì)胞，將免疫細(xì)胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲(chǔ)存； 以及任選的下列步驟(f)建立包含步驟以上信息的免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(e)的凍存免疫細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的步驟(g)細(xì)胞復(fù)蘇將步驟(e)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中，重懸，混勻，補(bǔ)加培養(yǎng)基，離心洗滌；以及任選的下列步驟(h)針對步驟(g)所得復(fù)蘇的免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率及復(fù)蘇率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟(i)細(xì)胞擴(kuò)增用含有培養(yǎng)基和血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心容器，反復(fù)吹洗貼壁細(xì)胞，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將離心容器中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，針對iDC細(xì)胞和CIK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再分別針對iDC細(xì)胞及CIK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，將血樣本充分混勻是將血袋上下顛倒2-8次實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選4-5次。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述離心容器是離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)的離心容器是50ml的離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)移至離心容器中的血液是按照150ml血量計(jì)算，每個(gè)離心容器裝有25ml血液，共裝6管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)移至離心容器中的血液留取5ml血樣于15ml離心容器中，用于血型檢測。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)的稀釋血液是通過于離心容器中加入生理鹽水稀釋實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選生理鹽水的加入量按照與離心管內(nèi)血液體積比5 :1-1 5的比例加入稀釋，優(yōu)選2 :1-1 2的比例加入稀釋，優(yōu)選按照等體積I :1的比例加入稀釋，優(yōu)選加入生理鹽水25ml進(jìn)行等體積I :1稀釋。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，稀釋血液后用吸液管充分混勻，優(yōu)選25ml移液管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，離心容器為50ml的離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，按照150ml血量計(jì)算，取12支50ml 離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，每個(gè)離心容器中加入Ficoll細(xì)胞分離液 5_25ml,優(yōu)選 10-20ml,優(yōu)選 15ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的稀釋后的血液樣本加入Ficoll細(xì)胞分離液的上層是通過移液管吸取血樣本沿傾斜的離心容器壁緩緩加入來實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選移液管為25ml移液管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)所述稀釋后的血液樣本的加入量為10-35ml，優(yōu)選 15-30ml，優(yōu)選 25ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，加入的Ficoll細(xì)胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為I :10-10 :1，優(yōu)選2 :7-7 :2，優(yōu)選3 :5-5 :3，例如3 :5。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為3 5是特別優(yōu)選的，比之于按照該比例變化20%以上的比例加樣，能在加樣過程中有效避免沖散界面。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的離心處理是通過水平離心機(jī)實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的離心處理是將加樣后的離心容器置于水平離心機(jī)內(nèi)離心。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)所述的離心處理是設(shè)置水平離心機(jī)升速為1，降速為0，轉(zhuǎn)速為1000-4000rpm，離心時(shí)間為10_40min，離心溫度為15_30°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1500-3000rpm,優(yōu)選轉(zhuǎn)速為2000rpm,優(yōu)選離心時(shí)間為15_30min,優(yōu)選離心時(shí)間為20min，優(yōu)選離心溫度為20°C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(C)所述離心容器為50ml的離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(C)中，每個(gè)離心容器內(nèi)吸取約10_50ml的白膜層，優(yōu)選約25-30ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(C)中，補(bǔ)充生理鹽水至總體積為30_50ml，優(yōu)選45ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(C)中，所述混勻是通過旋緊離心容器的蓋子，將離心容器上下顛倒3-8次實(shí)現(xiàn)的，優(yōu)選顛倒4-5次。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的離心處理是設(shè)置水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1000-4000rpm，離心時(shí)間為5_20min，離心溫度為15_30°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1500-3000rpm，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為2000rpm，優(yōu)選離心時(shí)間為lOmin，優(yōu)選離心溫度為20°C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的洗滌第一次是觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積30-50ml，優(yōu)選40ml，用25ml移液管混勻，旋緊離心容器的蓋子，設(shè)置水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1000-3000rpm，離心時(shí)間為5_15min，離心溫度為15_30°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1200_2000rpm，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1500rpm，優(yōu)選離心時(shí)間為lOmin，優(yōu)選離心溫度為20°C，離心處理。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(C)所述的洗滌第二次是觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積30-50ml，優(yōu)選40ml，用25ml移液管混勻，旋緊離心容器的蓋子，設(shè)置水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1000-2000rpm,離心時(shí)間為5_15min,離心溫度為15-30°C,優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1200rpm,優(yōu)選離心時(shí)間為lOmin，優(yōu)選離心溫度為20°C，離心處理。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)所述的檢測單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)和單個(gè)核細(xì)胞活率是向步驟(c)收集的細(xì)胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優(yōu)選20ml，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而·成的，優(yōu)選X-VIVO無血清培養(yǎng)基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優(yōu)選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份，優(yōu)選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存液中含有約50重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有約50重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液是特別優(yōu)選的，比之于使該凍存液的任一成分含量變化10%以上的配方在提高冷凍效果、保護(hù)冷凍細(xì)胞等效果方面具有顯著優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液配置10_20ml，優(yōu)選15ml，放置于0-7 °C冰箱中備存，優(yōu)選4 °C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的重懸免疫細(xì)胞是將步驟(C)獲得的細(xì)胞沉淀按照2X 105-2X 109/ml的密度用凍存液充分混勻，優(yōu)選2 X 10Vml的密度。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的凍存容器為凍存管，優(yōu)選2ml的凍存管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的將免疫細(xì)胞加入凍存容器后，將凍存容器用封口膜封口，并標(biāo)示免疫細(xì)胞的相關(guān)信息，優(yōu)選標(biāo)示免疫細(xì)胞來源的標(biāo)簽。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的程序降溫是將凍存容器放入程序降溫裝置(優(yōu)選程序降溫盒)中，放入0-7°C (優(yōu)選4°C)冰箱中備用，轉(zhuǎn)移至-100°C至_40°C (優(yōu)選_80°C )的冰箱中儲(chǔ)存20-36小時(shí)(優(yōu)選24小時(shí))，再將凍存容器從程序降溫裝置中取出。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存容器取出后，程序降溫裝置放入4°C冰箱以備下一次使用。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述凍存容器置于液氮罐中長期儲(chǔ)存，同時(shí)記錄樣本儲(chǔ)存的位置。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述水浴是將從液氮中取出的凍存容器迅速放入水浴裝置(優(yōu)選水浴鍋)中實(shí)施的。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述水浴裝置的溫度在體溫附近，優(yōu)選37°C。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述凍存容器在水浴裝置中反復(fù)震蕩5-15次，優(yōu)選8-10次，震蕩時(shí)間控制在5min以內(nèi)，優(yōu)選控制在2min以內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，直至看到凍存容器中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴裝置中取出凍存容器。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述清洗凍存容器表面是用蘸有75%酒精的無塵布將凍存容器表面水滴擦拭。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中、重懸和混勻的步驟是用Iml移液槍將凍存容器中復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞迅速吸出轉(zhuǎn)移至裝有2-10ml (優(yōu)選5ml) X-VIVO無血清培養(yǎng)基的10_20ml (優(yōu)選15ml)離心容器中重懸，并用槍頭反復(fù)吹洗混勻2-8次(優(yōu)選3-5次)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述補(bǔ)加培養(yǎng)基是補(bǔ)加X-VIVO無血清培養(yǎng)基至5_15ml (優(yōu)選IOml)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述離心洗滌是設(shè)置水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1000-3000rpm，離心時(shí)間為5_20min，離心溫度為15_30°C，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1500-2500rpm,優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1800rpm,優(yōu)選離心時(shí)間為IOmin,優(yōu)選離心溫度為20°C。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(h)所述的檢測單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)和單個(gè)核 細(xì)胞活率及復(fù)蘇率是向步驟(g)收集的細(xì)胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優(yōu)選20ml，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率，記錄結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%的自體人血清。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟⑴所述重懸培養(yǎng)是將細(xì)胞密度為4X 104-4X IO8 (優(yōu)選4 X IO6)的免疫細(xì)胞置于體溫條件下(優(yōu)選37°C )，在2-10% (優(yōu)選5%)的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)(2小時(shí))。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述轉(zhuǎn)移至離心容器為50ml離心管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述貼壁細(xì)胞吹洗1-5遍，優(yōu)選2-3遍。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)通過施加l_5ml的X-VIVO無血清培養(yǎng)基重懸，優(yōu)選2_3ml。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)細(xì)胞計(jì)數(shù)為吸取20 μ I細(xì)胞,加入180 μ I臺(tái)盼蘭染液,充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和活率。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)細(xì)胞計(jì)數(shù)為單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)減去細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)總數(shù)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)的培養(yǎng)為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、粒細(xì)胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細(xì)胞介素4 (IL_4) 500U/ml ;第4天，半量換液；第5天，加入抗原負(fù)載；第6天，加入人腫瘤壞死因子a (TNF-a) 1000U/ml過夜；第7天，DC第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第9天，DC第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶llc、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第11天，DC第三次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第13天，DC第四次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的培養(yǎng)為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子INF-Y 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子CD3單抗375ng/ml、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIV0無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ；第8天，補(bǔ)加一倍含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8 等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量 ’第14 天，CIK 第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD 19+、CD4/CD8等細(xì)胞表面抗 原的表達(dá)量。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟(a)全血樣本預(yù)處理上下顛倒血袋4-5次，將血樣本充分混勻,血液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，轉(zhuǎn)移至離心容器中的血液按照150ml血量計(jì)算，每個(gè)離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進(jìn)行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進(jìn)行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻；(b)Ficoll法分離按照150ml血量計(jì)算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細(xì)胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細(xì)胞分離液上層，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機(jī)內(nèi)離心，水平離心機(jī)升速為1，降速為O,轉(zhuǎn)速為2000rpm,離心時(shí)間為20min，離心溫度為20°C ；(c)單個(gè)核細(xì)胞收集和洗滌離心結(jié)束后，將上層血漿轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內(nèi)，通常每管約25-30ml，補(bǔ)充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1500rpm,離心時(shí)間為IOmin,離心溫度為200C ;第二次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1200rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ；(d)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果。進(jìn)一步地，可以包括以下對提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的步驟(e)單個(gè)核細(xì)胞凍存按照50%X_VIV0無血清培養(yǎng)基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細(xì)胞沉淀按照2X107/ml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標(biāo)簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲(chǔ)存一個(gè)小時(shí)，轉(zhuǎn)移至_80°C冰箱儲(chǔ)存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)進(jìn)行儲(chǔ)存，同時(shí)程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲(chǔ)存；
(f)記錄步驟(e)的凍存樣本儲(chǔ)存的位置，建立免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫。進(jìn)一步地，可以包括以下對凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的步驟(g)細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出單個(gè)核細(xì)胞凍存管，迅速放入預(yù)先準(zhǔn)備的37°C的水浴鍋中，反復(fù)振蕩8-10次，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，直至看到凍存管中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞迅速吸出轉(zhuǎn)移至一裝有5mlX-VIVO無血清培養(yǎng)基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復(fù)吹洗混勻3_5次，補(bǔ)加X-VIVO無血清培養(yǎng)基至IOml,離心洗漆,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1800rpm,離心時(shí)間為lOmin,尚心溫度為20 C ；(h)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加 入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率；進(jìn)一步地，可以包括以下對復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟(i)細(xì)胞擴(kuò)增用含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%的自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，細(xì)胞密度為4X IO6個(gè)細(xì)胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，2小時(shí)后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細(xì)胞用生理鹽水反復(fù)吹洗2-3遍，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，此時(shí)的細(xì)胞為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將上述轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，吸取20 μ I細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)細(xì)胞總數(shù)和活率，單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)減去細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)總數(shù)為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后分別針對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)和未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；優(yōu)選未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)的培養(yǎng)步驟如下第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、粒細(xì)胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細(xì)胞介素4 (IL_4) 500U/ml ；第4天，半量換液；第5天，加入抗原負(fù)載；第6天,加入人腫瘤壞死因子a (TNF- a ) 1000U/ml過夜；第7天，DC第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第9天，DC第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第11天，DC第三次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第13天，0(第四次收獲，計(jì)數(shù)，測定0)80、0)86、0)83、0)11(3、!11^-01 等細(xì)胞表面
抗原的表達(dá)量；優(yōu)選細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的培養(yǎng)步驟如下第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子 INF-y 1000U/ml ；第2天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子 CD3 單抗 375ng/ml、白細(xì)胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第8天，補(bǔ)加一倍含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素 2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素 la (IL-1 a ) 500U/ml ；第12 天，CIK 第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；
第14天，CIK第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+、⑶3+⑶56+、⑶3-⑶19+、⑶4/⑶8等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量。此外，在本發(fā)明的第一方面，提供了對血液免疫細(xì)胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復(fù)蘇的方法，以及復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法。因此，本發(fā)明第二方面提供了一種免疫細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第二方面的免疫細(xì)胞，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案所述方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的免疫細(xì)胞，其細(xì)胞純度大于90%，例如大于95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫細(xì)胞經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞純度大于90%，例如大于95%。此外，在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫細(xì)胞。因此，本發(fā)明第三方面提供了一種免疫細(xì)胞用于治療疾病的用途，同時(shí)提供了一種免疫細(xì)胞制備用于治療疾病的藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明第三方面的用途，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案所述方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明第三方面的用途，其疾病選自腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑色素瘤、間皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，優(yōu)選腫瘤。此外，在本發(fā)明的第二方面，提供了一種免疫細(xì)胞。因此，本發(fā)明第四方面提供了一種免疫細(xì)胞用于非治療目的保健中的應(yīng)用，同時(shí)提供了一種免疫細(xì)胞制備保健品中的用途。根據(jù)本發(fā)明第四方面的用途，其非治療目的保健是在出現(xiàn)免疫低下時(shí)提高免疫力。在本發(fā)明中，如未特別另外地說明，％表示重量/重量的百分?jǐn)?shù)。下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所引用的文獻(xiàn)，以及該文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過弓I用并入本文。在本發(fā)明中，本發(fā)明任一方面的任一技術(shù)方案中，其任一技術(shù)特征同樣適用于本發(fā)明的任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)引起矛盾，并且這種相互適用在必要時(shí)可以作適當(dāng)?shù)男薷摹?br>

圖I為細(xì)胞凍存過程的流程圖的示意圖。圖2為細(xì)胞凍存步驟的流程圖的示意圖。圖3為細(xì)胞復(fù)蘇擴(kuò)增步驟的流程圖。圖4為張三細(xì)胞培養(yǎng)測試圖。圖5為李四細(xì)胞培養(yǎng)測試圖。
具體實(shí)施例方式通過下面的實(shí)施例可以對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)的描述。實(shí)施例I、免疫細(xì)胞提取和凍存的方法免疫細(xì)胞提取方法包括以下步驟(I)全血樣本預(yù)處理上下顛倒血袋4-5次,將血樣本充分混勻,血液轉(zhuǎn)移至50ml 離心管中，轉(zhuǎn)移至離心容器中的血液按照150ml血量計(jì)算，每個(gè)離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進(jìn)行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進(jìn)行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻；(2)Ficoll法分離按照150ml血量計(jì)算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細(xì)胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細(xì)胞分離液上層，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機(jī)內(nèi)離心，水平離心機(jī)升速為1，降速為O,轉(zhuǎn)速為2000rpm,離心時(shí)間為20min，離心溫度為20°C ；(3)單個(gè)核細(xì)胞收集和洗滌離心結(jié)束后，將上層血漿轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內(nèi)，通常每管約25-30ml，補(bǔ)充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1500rpm,離心時(shí)間為IOmin,離心溫度為200C ;第二次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1200rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ；(4)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果。與提取方法配套使用的凍存方法包括以下步驟(5)單個(gè)核細(xì)胞凍存按照50%X_VIV0無血清培養(yǎng)基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細(xì)胞沉淀按照IXlOVml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標(biāo)簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲(chǔ)存一個(gè)小時(shí)，轉(zhuǎn)移至_80°C冰箱儲(chǔ)存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)進(jìn)行儲(chǔ)存，同時(shí)程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲(chǔ)存；(6)記錄步驟(5)的凍存樣本儲(chǔ)存的位置，建立免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫。志愿者張三(化名)，年齡42歲，性別男，采血量150ml。步驟(4)計(jì)算得到單個(gè)核細(xì)胞收集總量3. 20 X IO8個(gè)細(xì)胞，折合成IOOml血量計(jì)算為2. 13 X IO8個(gè)細(xì)胞。步驟(5)凍存管數(shù)為18管，其中至少有9管是按照IXlOVml的密度凍存。實(shí)施例2、免疫細(xì)胞提取和凍存的方法參考實(shí)施例I的方法進(jìn)行。志愿者李四(化名)，年齡41歲，性別女，采血量115ml。步驟(4)計(jì)算得到單個(gè)核細(xì)胞收集總量I. 40 X IO8個(gè)細(xì)胞，折合成IOOml血量計(jì)算
為I. 22 X IO8個(gè)細(xì)胞。步驟(5)凍存管數(shù)為12管，其中至少有7管是按照lX107/ml的密度凍存。實(shí)施例3、免疫細(xì)胞提取和凍存的方法參考實(shí)施例I的方法進(jìn)行。志愿者王五(化名)，年齡33歲，性別男，采血量120ml。步驟(4)計(jì)算得到單個(gè)核細(xì)胞收集總量I. 69 X IO8個(gè)細(xì)胞，折合成IOOml血量計(jì)算為I. 41 X IO8個(gè)細(xì)胞。步驟(5)凍存管數(shù)為14管，其中至少有2管是按照5 X 106/ml的密度凍存，至少有3管是按照I X IOVml的密度凍存，其中至少有2管是按照2 X 10Vml的密度凍存。實(shí)施例4、免疫細(xì)胞提取和凍存的方法參考實(shí)施例I的方法進(jìn)行。志愿者孫六(化名)，年齡63歲，性別女，采血量135ml。步驟(4)計(jì)算得到單個(gè)核細(xì)胞收集總量2. 44X IO8個(gè)細(xì)胞，折合成IOOml血量計(jì)算為I. 81 X IO8個(gè)細(xì)胞。步驟(5)凍存管數(shù)為16管。根據(jù)實(shí)施例1-4可以得出以下結(jié)論I.年齡在30-60歲之間的健康人群，IOOml的采血量都可以獲取MNC在I X IO8個(gè)細(xì)胞以上，符合要求；2.健康人群的MNC在性別選擇上沒有顯著性差異。實(shí)施例5、免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法凍存后免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法包括以下步驟(7)細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出單個(gè)核細(xì)胞凍存管，迅速放入預(yù)先準(zhǔn)備的37°C的水浴鍋中，反復(fù)振蕩8-10次，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，直至看到凍存管中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞迅速吸出轉(zhuǎn)移至一裝有5mlX-VIVO無血清培養(yǎng)基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復(fù)吹洗混勻3_5次，補(bǔ)加X-VIVO無血清培養(yǎng)基至IOml,離心洗漆,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1800rpm,離心時(shí)間為lOmin,尚心溫度為20 C ；(8)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率；志愿者張三(化名)，凍存密度為IXlOVml的凍存免疫細(xì)胞復(fù)蘇9管，細(xì)胞數(shù)量為1.6X108，復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量為7.4X107，復(fù)蘇率為66%。實(shí)施例6、免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法參考實(shí)施例5的方法進(jìn)行。志愿者李四(化名)，凍存密度為I X IOVml的凍存免疫細(xì)胞復(fù)蘇7管，細(xì)胞數(shù)量為7. 9 X IO7,復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量為5. 5 X IO7,復(fù)蘇率為70%。實(shí)施例7、免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法參考實(shí)施例5的方法進(jìn)行。志愿者王五(化名)，凍存密度為5 X 106/ml的凍存免疫細(xì)胞復(fù)蘇2管，細(xì)胞數(shù)量為I. 52 X IO7,復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量為9. 52 X IO6,復(fù)蘇率為62%。實(shí)施例8、免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法參考實(shí)施例5的方法進(jìn)行。志愿者王五(化名)，凍存密度為I X 107/ml的凍存免疫細(xì)胞復(fù)蘇3管，細(xì)胞數(shù)量為4. 57 X IO7,復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量為3. 42 X IO7,復(fù)蘇率為75%?！?shí)施例9、免疫細(xì)胞復(fù)蘇的方法參考實(shí)施例5的方法進(jìn)行。志愿者王五(化名)，凍存密度為2X IOVml的凍存免疫細(xì)胞復(fù)蘇2管，細(xì)胞數(shù)量為6. I X IO7,復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量為5. 16 X IO7,復(fù)蘇率為85%。根據(jù)實(shí)施例5-9可以得出結(jié)論以2X IO7凍存密度保存的免疫細(xì)胞復(fù)蘇率是最高的。實(shí)施例10、復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法包括以下步驟(9)細(xì)胞擴(kuò)增用含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%的自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，細(xì)胞密度為4X IO6個(gè)細(xì)胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)；2小時(shí)后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細(xì)胞用生理鹽水反復(fù)吹洗2-3遍，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，此時(shí)的細(xì)胞為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)；將上述轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)；吸取20 μ I細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)細(xì)胞總數(shù)和活率，單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)減去細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)總數(shù)為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)細(xì)胞計(jì)數(shù)；未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)的培養(yǎng)為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、粒細(xì)胞集落刺激生物因子(GM-CSF) 1000U/ml和白細(xì)胞介素4 (IL-4) 500U/ml ;第4天，半量換液；第5天，加入抗原負(fù)載；第6天，加入人腫瘤壞死因子a (TNF- a ) 1000U/ml 過夜；第 7 天，DC 第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定 CD80、CD86、CD83、CDllc,HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第9天，DC第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶I lc、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第11天，DC第三次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；第13天，DC第四次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶80、⑶86、⑶83、⑶11c、HLA-DR等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的培養(yǎng)為第I天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子INF-Y 1000U/ml ;第2天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及細(xì)胞因子CD3單抗375ng/ml、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第4天，半量換液；第6天，加入含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素I a (IL-1 a ) 500U/ml ;第8天，補(bǔ)加一倍含有X-VIV0無血清培養(yǎng)基及10%自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液、白細(xì)胞介素2(IL-2) 1000U/ml、白細(xì)胞介素la (IL-1 a ) 500U/ml ;第12天，CIK 第一次收獲，計(jì)數(shù)，測定 CD3+、 CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量 ’第14天，CIK第二次收獲，計(jì)數(shù)，測定⑶3+、⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+、CD3+CD56+、CD3-CD19+、CD4/CD8等細(xì)胞表面抗原的表達(dá)量。擴(kuò)增結(jié)果在100X顯微鏡下拍攝圖片，見圖4。志愿者張三(化名)的免疫細(xì)胞擴(kuò)增，在第8天細(xì)胞開始增殖，克隆球明顯，視野中仍有少許血小板(見圖4a)，故在此換液，吹散克隆球，繼續(xù)培養(yǎng)；在第10天細(xì)胞克隆明顯增大，細(xì)胞已經(jīng)有活化現(xiàn)象，視野清亮，血小板較少(見圖4b)，此后繼續(xù)加液即可。實(shí)施例U、復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法參考實(shí)施例10的方法進(jìn)行。擴(kuò)增結(jié)果在100X顯微鏡下拍攝圖片，見圖5。志愿者李四(化名)的免疫細(xì)胞擴(kuò)增，在第8天細(xì)胞開始增殖，克隆球明顯，視野中仍有少許血小板(見圖5a)，故在此換液，吹散克隆球，繼續(xù)培養(yǎng)；在第10天細(xì)胞克隆明顯增大，細(xì)胞已經(jīng)有活化現(xiàn)象，視野清亮，血小板較少(見圖5b)，此后繼續(xù)加液即可。實(shí)施例12、復(fù)蘇后免疫細(xì)胞的藥效實(shí)驗(yàn)生物分布通過生物分布分析來評(píng)價(jià)體內(nèi)靶向性能。通過在10至12周齡的Balb/c雌性裸鼠體內(nèi)皮下注射IO7個(gè)MDA-MB-231人乳癌細(xì)胞來獲得荷瘤小鼠(Charles RiverLabor atories)。當(dāng)可明顯觸及腫瘤時(shí)將小鼠分組(n ^ 5)并在生物分布8天、24h或2h之前，將復(fù)蘇擴(kuò)增的免疫細(xì)胞進(jìn)行放射性碘化并注射到所有小鼠的側(cè)向尾靜脈中。在注射后24小時(shí)處死小鼠(12. 5 μ g，3. 3 μ Ci/小鼠)。對器官進(jìn)行稱重并用Packard Cobra伽瑪計(jì)數(shù)器讀出其放射性。代表性器官的放射性含量被表示為每克組織注射劑量的百分比ID/g)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，凍存、復(fù)蘇和擴(kuò)增不會(huì)削弱免疫細(xì)胞的腫瘤靶向作用。治療過在10至12周齡的Balb/c雌性裸鼠體內(nèi)皮下注射2X IO7個(gè)MDA-MB-231人乳癌細(xì)胞來獲得荷瘤小鼠(Charles River Laboratories)。在腫瘤細(xì)胞植入9天后，當(dāng)可明顯觸及腫瘤時(shí)將小鼠分組(η = 5)并在側(cè)向尾靜脈通過靜脈注射鹽水和復(fù)蘇擴(kuò)增后的免疫細(xì)胞。每天監(jiān)測小鼠并且每周用測徑器測量三次腫瘤生長，利用以下公式計(jì)算體積體積=長度X寬度2X0. 5。當(dāng)腫瘤達(dá)到體積> 2000mm3或當(dāng)腫瘤壞死時(shí)，將動(dòng)物處死。腫瘤的尺寸由平均值土 SE表不。在植入到裸鼠體內(nèi)的MDA-MB231人乳癌模型中觀察到復(fù)蘇擴(kuò)增后的免疫細(xì)胞具有抑制腫瘤的活性。
權(quán)利要求
1.從血液中提取免疫細(xì)胞的方法，該方法包括以下分離步驟 (1)全血樣本預(yù)處理將血樣本充分混勻，轉(zhuǎn)移至離心容器中，稀釋血液； (2)FicolI法分離取離心容器，加入FicolI細(xì)胞分離液，然后將稀釋后的血液樣本加AFicoll細(xì)胞分離液的上層，將離心容器置于離心裝置中，離心處理； (3)單個(gè)核細(xì)胞收集和洗滌離心處理結(jié)束后，將上層血漿轉(zhuǎn)移至離心容器，吸取白膜層于離心容器內(nèi)，補(bǔ)充生理鹽水，混勻后再次離心處理，待細(xì)胞沉淀后洗滌兩次； 以及任選的下列步驟 (4)針對步驟(3)所得免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟(2)加入的Ficoll細(xì)胞分離液與稀釋后血液樣本的體積比為I :10-10 :1，優(yōu)選2 :7-7 :2，優(yōu)選3 :5_5 :3。
3.針對權(quán)利要求I提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的方法，該方法包括以下步驟 (5)單個(gè)核細(xì)胞凍存向步驟(3)提取的免疫細(xì)胞中加入凍存液，重懸免疫細(xì)胞，將免疫細(xì)胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲(chǔ)存； 以及任選的下列步驟 (6)建立包含步驟以上信息的免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(5)的凍存免疫細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中步驟(5)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，優(yōu)選X-VIVO無血清培養(yǎng)基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優(yōu)選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份,優(yōu)選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。
5.針對權(quán)利要求3凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的方法，該方法包括以下步驟 (7)細(xì)胞復(fù)蘇將步驟(5)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中，重懸，混勻，補(bǔ)加培養(yǎng)基，離心洗滌； 以及任選的下列步驟 (8)針對步驟(7)所得復(fù)蘇的免疫細(xì)胞，檢測以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率及復(fù)蘇率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。
6.針對權(quán)利要求5復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的方法，該方法包括以下步驟 (9)用含有培養(yǎng)基和血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心容器，反復(fù)吹洗貼壁細(xì)胞，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將離心容器中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，針對iDC細(xì)胞和CIK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再分別針對iDC細(xì)胞及CIK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，該方法包括以下步驟 (I)全血樣本預(yù)處理上下顛倒血袋4-5次,將血樣本充分混勻,血液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，轉(zhuǎn)移至離心容器中的血液按照150ml血量計(jì)算，每個(gè)離心容器裝有25ml血液，共裝6管，留取5ml血樣于15ml離心管中，進(jìn)行血型檢測，于50ml離心管中加入生理鹽水25ml進(jìn)行等體積I :1稀釋，用25ml移液管輕輕充分混勻； (2)Ficoll法分離按照150ml血量計(jì)算，取12支50ml離心管，每管加入Ficoll細(xì)胞分離液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀釋的血樣本沿傾斜的管壁緩緩加入于Ficoll細(xì)胞分離液上層，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液與血樣本比例為3 :5，加樣過程中避免沖散界面，將加樣后的離心管置于水平離心機(jī)內(nèi)離心，水平離心機(jī)升速為1，降速為0，轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心時(shí)間為20min，離心溫度為20°C ； (3)單個(gè)核細(xì)胞收集和洗滌離心結(jié)束后，將上層血漿轉(zhuǎn)移至50ml離心管內(nèi)，輕輕吸取白膜層于50ml離心管內(nèi)，通常每管約25-30ml，補(bǔ)充生理鹽水至總體積為45ml，旋緊管蓋將離心管上下顛倒混勻4-5次，水平離心，水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為2000rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ;第一次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml，25ml移液管混勻，旋緊管蓋，水平離心，水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1500rpm，離心時(shí)間為lOmin，離心溫度為20°C ’第二次洗滌，觀察細(xì)胞沉淀后，傾去上清液，回流液體，輕輕懸浮細(xì)胞沉淀，補(bǔ)充生理鹽水至總體積40ml, 25ml移液管混勻,旋緊管蓋,水平離心,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1200rpm,離心時(shí)間為IOmin,離心溫度為20°C ； (4)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果； 進(jìn)一步地，可以包括以下對提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的步驟 (5)單個(gè)核細(xì)胞凍存按照50%X-VIV0無血清培養(yǎng)基+40%人血白蛋白+10%DMS0的配方配制凍存液15ml，放置4°C冰箱中備用，將上述獲得的細(xì)胞沉淀按照2X IOVml的密度用凍存液充分混勻重懸，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2ml凍存管中，用封口膜封口并貼上客戶標(biāo)簽，將凍存管放入程序降溫盒中，放入4°C冰箱儲(chǔ)存一個(gè)小時(shí)，轉(zhuǎn)移至_80°C冰箱儲(chǔ)存過夜，次日，從程序降溫盒中取出凍存管，轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi)進(jìn)行儲(chǔ)存，同時(shí)程序降溫盒放入4°C冰箱以備下一次使用，凍存管在液氮罐中長期儲(chǔ)存； (6)記錄步驟(5)的凍存樣本儲(chǔ)存的位置，建立免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫； 進(jìn)一步地，可以包括以下對凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的步驟 (7)細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出單個(gè)核細(xì)胞凍存管，迅速放入預(yù)先準(zhǔn)備的37°C的水浴鍋中，反復(fù)振蕩8-10次，時(shí)間控制在2min以內(nèi)，直至看到凍存管中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴鍋中取出凍存管，用蘸有75%酒精的無塵布將凍存管表面水滴擦拭后，迅速轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，用Iml移液槍將凍存管中復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞迅速吸出轉(zhuǎn)移至一裝有5ml X-VIVO無血清培養(yǎng)基的15ml離心管中重懸，并用槍頭反復(fù)吹洗混勻3-5次，補(bǔ)加X-VIVO無血清培養(yǎng)基至IOml,離心洗漆,水平離心機(jī)升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1800rpm,離心時(shí)間為IOmin,離心溫度為20°C ； (8)單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)重懸，于細(xì)胞沉淀中加入20ml生理鹽水，用IOml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻；細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取20 μ I細(xì)胞，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率； 進(jìn)一步地，可以包括以下對復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟 (9)細(xì)胞擴(kuò)增用含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及10%的自體人血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，細(xì)胞密度為4X IO6個(gè)細(xì)胞，置于37°C溫度條件下，5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，2小時(shí)后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，剩下瓶中的貼壁細(xì)胞用生理鹽水反復(fù)吹洗2-3遍，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來，此時(shí)的細(xì)胞為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加2-3ml的X-VIVO無血清培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將上述轉(zhuǎn)移至50ml的離心管中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，吸取20 μ I細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，加入180 μ I臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)細(xì)胞總數(shù)和活率，單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)減去細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)總數(shù)為未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后分別針對細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)和未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
8.一種免疫細(xì)胞，其是根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法獲得的。
9.權(quán)利要求8所述免疫細(xì)胞在治療疾病中的應(yīng)用，所述疾病選自腫瘤、肉瘤、淋巴瘤、霍奇金病、黑色素瘤、間皮瘤、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、白血病和骨髓癌，優(yōu)選腫瘤。
10.權(quán)利要求8所述免疫細(xì)胞在用于非治療目的保健中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡單有效的血液免疫細(xì)胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復(fù)蘇的方法，以及復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法，其包括如下步驟全血樣本預(yù)處理、Ficoll法分離、MNC收集和洗滌、MNC計(jì)數(shù)、MNC凍存、細(xì)胞復(fù)蘇、MNC計(jì)數(shù)和細(xì)胞擴(kuò)增。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用特定操作步驟的提取、凍存、復(fù)蘇以及擴(kuò)增，可以有效地獲得免疫細(xì)胞，該免疫細(xì)胞可用于治療腫瘤。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102876631SQ20121037943
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月9日
發(fā)明者姚靜, 楊傳慶, 張輝, 鄭愛玲, 張星星, 朱曉青 申請人:博雅干細(xì)胞科技有限公司