專利名稱：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbA1的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥領(lǐng)域，涉及一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbAl的純化方法。
背景技術(shù)：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)局部感染經(jīng)久不愈，全身感染死亡率高達(dá)20%。自1961年被首次發(fā)現(xiàn)，目前已成為全球ICU病房、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的病原菌之一。MRSA因其傳播途徑廣泛，易暴發(fā)流行，又由于其致病性強(qiáng)，呈多重耐藥而成為臨床上治療的難點(diǎn)及重要的生物戰(zhàn)劑，被稱為“超級細(xì)菌”，當(dāng)前MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。萬古霉素被認(rèn)為是治療MRSA的最后一道防線，但2002年以來耐萬古霉素的MRSA相繼被分離出來，使MRSA即將面臨無抗生素可治的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前，在我國各大醫(yī)院，由于抗生素的濫用，MRSA的分離檢出率逐年上升，已由1978年的5%發(fā)展到2009年的79%，且菌群的毒力基因改變明顯，并且耐萬古霉素的金葡菌也呈蔓延趨勢?；谶@種嚴(yán)峻形勢，我國已將MRSA列為21世紀(jì)可能對國人衛(wèi)生健康有重大影響的12種病原微生物之一。2010年“中國MRSA院內(nèi)感染診治策略新進(jìn)展”會議資料顯示，我國內(nèi)地醫(yī)院院內(nèi)感染發(fā)生率約為8%，全國每年因醫(yī)院感染造成的直接損失超過150億元。因此，加強(qiáng)對MRSA感染的防治研究已迫在眉睫，研制安全、有效的新型MRSA疫苗將對有效控制MRSA耐藥性蔓延和臨床MRSA廣泛感染具有重大應(yīng)用價值。美國研發(fā)的MRSA疫苗已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)、高效、安全、經(jīng)濟(jì)的MRSA疫苗對有效控制MRSA耐藥性蔓延和臨床MRSA廣泛感染，提升我國的國際競爭力具有重要意義。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抗原組分復(fù)雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護(hù)性抗原的難度較大，方法繁瑣，不利于疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備。利用基因工程技術(shù)將菌體有效的保護(hù)性抗原進(jìn)行克隆表達(dá)使MRSA疫苗研制的可行性大大提高。金黃色葡萄球菌表面的粘附素是一類能夠介導(dǎo)細(xì)菌粘附于寄主細(xì)胞表面進(jìn)而引發(fā)疾病的膜蛋白，其中纖連蛋白結(jié)合蛋白A(FnbA)是重要的粘附素之一，編碼基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候選抗原。它能夠介導(dǎo)金黃色葡萄球菌結(jié)合于細(xì)胞表面的纖連蛋白，使細(xì)菌黏附于寄主細(xì)胞表面，促進(jìn)細(xì)菌對寄主組織的入侵，目前分離到的大多數(shù)金黃色葡萄球菌都能夠與細(xì)胞外基質(zhì)上的纖連蛋白特異性的結(jié)合。申請人:采用生物信息學(xué)的方法從FnbA中預(yù)測出了一段活性片段FnbAl，通過克隆表達(dá)并純化后，動物試驗(yàn)證明可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用。FnbAl具有序列表I所述的核苷酸序列和序列表2所述的氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌重組蛋白抗原(FnbAl)制備中的抗原蛋白純化，，提供一種工藝簡捷、所獲得目標(biāo)蛋白純度高、回收率較好的純化工藝和方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案。一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌疫苗重組蛋白抗原的純化方法，包含步驟收集發(fā)酵的表達(dá)FnbAl的工程菌后，按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶切，離子交換層析、凝膠過濾層析技術(shù)的順序組合對制備的抗原進(jìn)行純化。步驟具體為I)高壓破菌將收集的抗原的菌體以pH為7. 0-7. 5的10_20mM PBS緩沖液混勻 懸浮，預(yù)冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清，上清中繼續(xù)緩慢加入終濃度為40%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集沉淀；3)沉淀復(fù)溶稱量沉淀濕重，按重量體積比為1: 10比例加入pH為7. 0-7. 5的10-20mM的PBS緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000_15000g高速離心20分鐘以上，收集上清；4) GST親和純化選擇GST親和層析填料進(jìn)行初步純化，使用roSpH7. 0-7. 5的條件下對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，Prescission Protease酶進(jìn)行酶切洗脫；5)離子交換層析純化步驟4)收集的樣品，pH調(diào)至9.0，使用pH為9. 0、10 50Tris、0 O.1MNaCl的Tris緩沖液平衡層析系統(tǒng)及離子交換層析柱，然后采用pH為9. O、
10 50Tris0. 5 IMNaCl 的 buffer 梯度洗脫；6)疏水層析純化將步驟5)純化獲得的樣品，按1:1的比例與pH為7. 5的20mMPB，3M (NH4)2SO4混合，采用緩沖液pH為7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4)2SO4平衡層析系統(tǒng)和疏水層析柱后上樣，采用pH為7. 5的IOmM PB梯度洗脫，去除痕量非目標(biāo)蛋白等雜質(zhì)，分離純化目標(biāo)蛋白。7)脫鹽采用PBS平衡脫鹽柱，將步驟6)純化獲得的樣品通過脫鹽柱置換緩沖液。優(yōu)選地，步驟I)采用生產(chǎn)或中試純化中的60_80MPa高壓勻漿破菌技術(shù)，高速離心
獲取破菌上清。優(yōu)選地,步驟2)和步驟3)硫酸銨分步沉淀再復(fù)溶。優(yōu)選地，步驟4)所述的GST親和純化所使用的填料為GST-Sepharose4B、GST-Sepharose 6B> GST-Sepharose FastFlow、GST-Sepharose HP 之一。優(yōu)選地,步驟4)所使用的Prescission Protease酶帶有GST標(biāo)簽，以利于去除Prescission Protease 酶。優(yōu)選地，步驟5)所使用的離子交換層析填料為Q HP,RESOURCE Q、Q FF、Adhere之
ο優(yōu)選地,步驟6)所述的凝膠層析柱為Superdex75、Superdex 200、Superdex HR10/30 之一。本發(fā)明所述抗原是通過以下步驟制備的I)設(shè)計(jì)正向引物和反向引物通過PCR擴(kuò)增或全基因合成以獲得編碼FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；
2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，然后將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌；3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)重組蛋白。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明采用的此純化方法，從表達(dá)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)重組基因工程疫苗候選抗原(本申請中命名為FnbAl)的大腸桿菌工程菌中可以獲得純度大于98%的FnbAl，得率50%以上，整個純化過程無需額外置換緩沖液。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌疫苗重組蛋白抗原FnbAl為采用生物信息學(xué)方法，從MRSA的纖連蛋白結(jié)合蛋白A中預(yù)測出的的活性片段，經(jīng)大腸桿菌基因工程菌表達(dá)獲得。通過上述工藝處理不同批次的FnbAl作12% SDS-PAGE，呈現(xiàn)出單一目標(biāo)蛋白條
帶，分子量約為72KD，純度在98%以上。蛋白等電點(diǎn)在pH4. 5左右。不同F(xiàn)nbAl肽指紋圖譜各峰峰數(shù)均保持一致，各峰的保留時間均在± IOSec內(nèi)波動，說明肽圖譜重現(xiàn)性好。純化后的FnbAl與氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁佐劑共同注射免疫BalB/C小鼠，發(fā)現(xiàn)FnbAl加免疫佐劑組血清中的IgG水平顯著高于陰性對照組(PBS組)(P < O. 01)，證明使用本發(fā)明純化方法獲得的FnbAl可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的免疫應(yīng)答。使用MRSA標(biāo)準(zhǔn)株252 (購自ATCC)感染，發(fā)現(xiàn)FnbAl加免疫佐劑組感染率為80%作用，且具有良好的重復(fù)性，表明該蛋白片段具有良好的免疫原性和免疫保護(hù)性，可用作耐甲氧西林葡萄球菌重組基因工程疫苗的候選抗原。


圖1為FnbAl發(fā)酵菌體破菌樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道1_2為FnbAl破菌上清。圖2為硫酸銨沉淀及GST親和層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道I為40%硫酸銨沉淀后復(fù)溶樣本，泳道2為PP酶酶切后第一次洗脫樣本，泳道3為PP酶酶切后第二次洗脫樣本，泳道4為PP酶(Prescission Protease酶)酶切后第三次洗脫樣本。圖3為離子交換層析圖。圖中分別列出了 280nm處的紫外吸收值和電導(dǎo)值的變化。圖4為離子交換層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道1_5為峰I樣品，泳道6為峰2樣品，泳道7為峰3樣品，泳道8為峰4樣品。圖5為兩次疏水層析的層析圖。圖中分別列出了 280nm處的紫外吸收值和電導(dǎo)值的變化。 圖6為疏水層析樣品SDS-PAGE。在圖中，泳道M為蛋白分子量marker，泳道I為離子交換層析樣本，泳道2_3為第二次疏水層析樣本，泳道4-7為第一次疏水層析樣本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。實(shí)施例一抗原FnBAl的制備
本實(shí)施例所使用的菌株與各種試劑如下1.菌株金黃色葡萄球菌MRSA-252國際標(biāo)準(zhǔn)株由美國ATCC提供；2.試劑質(zhì)粒pGEX-6p_2、大腸桿菌菌株XL-lblue為申請人教研室保存，primeSTAR HS DNA Polymerase>DNA Marker、限制性內(nèi)切酶 BamHI 和 Not1、蛋白Marker為大連TakaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒為美國Omega公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、超薄回收試劑盒以及顯色液為天根公司產(chǎn)品；T4DNA Ligase 為 Fermentas 公司產(chǎn)品；谷胱甘妝-瓊脂糖凝膠Glutathione Sepharose 4B為美國GE Healthcare公司
女口
廣叩ο本實(shí)施例的具體步驟如下(一 )耐甲氧西林金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白A活性片段FnBAl活性片段的克隆1.首先根據(jù)MRSA_252FnBA蛋白全長基因序列，應(yīng)用生物信息軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，確定需要擴(kuò)增的FnBAl目的基因片段。所述FnBAl目的基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO :1所不,其蛋白的的氣基酸序列如SEQ ID N0:2所不。2.根據(jù)分析結(jié)果，采用PCR方法自MRSA-252基因組擴(kuò)增FnBAl目的基因片段，擴(kuò)增步驟如下I)設(shè)計(jì)PCR引物如下，分別為SEQ ID NO :3_4 (下劃線示酶切位點(diǎn)堿基序列)FnBAl-F SEQ ID NO 35, -CGCGGATCCATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCA-3'BamH IFnBAl-R SEQ ID NO 45' -TTTTCCTTTTGCGGCCGCCTATCCATTATCCCATGTTAATGTAT-3'Not I2)-80°C冷凍庫中取出保存的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA-252菌株涂布于MRSA-252專用固體培養(yǎng)基上，于37 °C培養(yǎng)過夜，再挑取單菌落接種于MRSA-252專液體體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8個小時，參照細(xì)菌基因組抽提試劑盒抽提MRSA基因組。3)以MRSA-252全基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增FnBAl基因片段PCR 體系
權(quán)利要求
1.一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbAl的純化方法，其特征在于，包含步驟收集制備的所述抗原；按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶酶切，離子交換層析、疏水層析和脫鹽的順序組合對制備的抗原進(jìn)行純化。
2.如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于1)高壓破菌將收集的菌體以PH為7.0-7. 5的10-20mM PBS緩沖液混勻懸浮，預(yù)冷后采用高壓勻漿破菌，高速離心，收集上清；2)硫酸銨分步沉淀4°C攪拌條件下，上清中緩慢加入終濃度為30%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清，上清中繼續(xù)緩慢加入終濃度為 40%的硫酸銨，攪拌半小時以上，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集沉淀；3)沉淀復(fù)溶稱量沉淀濕重，按重量體積比為1: 3-10比例加入pH為7. 0-7. 5的 10-20mM的PBS緩沖液，攪拌混勻10-15分鐘，10000-15000g高速離心20分鐘以上，收集上清；4)GST親和純化選擇GST親和層析填料進(jìn)行初步純化，使用PBSpH7. 0-7. 5的條件對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化，Prescission Protease酶進(jìn)行酶切洗脫；5)離子交換層析純化步驟4)收集的樣品，pH調(diào)至9.0，使用pH為9.0，10 50Tris， O O.1M NaCl的Tris緩沖液平衡層析系統(tǒng)及離子交換層析柱，然后采用pH為9. 0,10 50Tris，0. 5 IM NaCl 的 buffer 梯度洗脫；6)疏水層析純化將步驟5)純化獲得的樣品，按1:1的比例與pH為7. 5的20mM PB， 3M (NH4) 2S04混合，采用緩沖液pH為7. 5的lOmMPB，1. 5M (NH4) 2S04平衡層析系統(tǒng)和疏水層析柱后上樣,采用pH為7. 5的IOmM PB梯度洗脫，去除痕量非目標(biāo)蛋白等雜質(zhì)，分離純化目標(biāo)蛋白。7)脫鹽采用PBS平衡脫鹽柱，將步驟6)純化獲得的樣品通過脫鹽柱置換緩沖液。
3.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟I)采用生產(chǎn)或中試純化中的 60-80MPa高壓勻漿破菌技術(shù)，高速離心獲取破菌上清。
4.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟2)和步驟3)硫酸銨分步沉淀再復(fù)溶。
5.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟4)所述的GST親和純化所使用的填料為 GST-Sepharose 4B、GST-Sepharose 6B、GST-Sepharose FastFlow> GST-Sepharose HP 之一。
6.如權(quán)利要求5所述的純化方法，其特征在于，步驟4)所使用的Prescission Protease酶帶有GST標(biāo)簽，以利于去除Prescission Protease酶。
7.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟5)所使用的離子交換層析填料為 Q HP、RESOURCE Q、Q FF、Adhere 之一。
8.如權(quán)利要求2所述的純化方法，其特征在于，步驟6)所述的疏水層析柱為phenyl或 butyl ο
9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，所述抗原是通過以下步驟制備的I)設(shè)計(jì)正向引物和反向引物通過PCR擴(kuò)增或全基因合成以獲得編碼FnBAl蛋白活性片段的核酸序列；2)將步驟I)所獲得的核酸序列克隆至表達(dá)載體構(gòu)建重組載體，然后將該重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌；3)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的宿主菌表達(dá)重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)疫苗重組蛋白抗原FnbA1的純化方法。FnbA1為采用生物信息學(xué)方法，從MRSA的纖連蛋白結(jié)合蛋白A中預(yù)測出的活性片段，經(jīng)大腸桿菌基因工程菌表達(dá)獲得。其純化步驟為對高密度發(fā)酵的FnbA1重組表達(dá)菌按照高壓破菌、離心，硫酸銨分步沉淀，GST親和層析、PP酶酶切，離子交換層析、疏水層析和脫鹽的順序組合進(jìn)行純化。本發(fā)明提供的純化方法簡捷、容易放大、重復(fù)性好，所獲目標(biāo)蛋白純度高，動物試驗(yàn)證明純化的抗原可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用。
文檔編號C12N15/31GK102993278SQ20121037884
公開日2013年3月27日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者章金勇, 鄒全明, 郭鷹, 馮強(qiáng), 樊紹文, 盧陸, 董衍東, 敬海明, 顧江 申請人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)