專利名稱：復(fù)合菌劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種復(fù)合菌劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為困擾世界各國(guó)的普遍性環(huán)境問(wèn)題。浮游藻類的大量繁殖導(dǎo)致水華的頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重影響了人類的生活、生產(chǎn)和身體健康，造成了世界范圍內(nèi)的生態(tài)災(zāi)害，因此，探索控制水華發(fā)生的有效途徑已迫在眉睫。目前，治理水體富營(yíng)養(yǎng)化主要是采用物理和化學(xué)方法，但這兩種方法不僅會(huì)消耗大量的財(cái)力和物力，而且會(huì)在一定程度上破壞生態(tài)環(huán)境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到 國(guó)內(nèi)外環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注。國(guó)外對(duì)溶藻菌的研究已有數(shù)十年的歷史，自Geitler報(bào)道一種寄生在剛毛藻上的粘細(xì)菌以來(lái)，陸續(xù)有溶藻菌的相關(guān)報(bào)道，研究重點(diǎn)也逐漸從單一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過(guò)渡到菌一藻種群生態(tài)學(xué)及分子調(diào)控機(jī)理等方面。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)溶藻細(xì)菌的研究還處于初始階段，因此，尋找高效溶藻菌對(duì)溶藻菌的深入研究及應(yīng)用具有重要意義。水華魚(yú)腥藻是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要藻種之一，其分布廣，能夠產(chǎn)生藻毒素，直接和間接危害人類，然截止目前，利用微生物方式控制水華魚(yú)腥藻的研究甚是罕見(jiàn)，利用不同溶藻方式的溶藻菌復(fù)合而成的溶藻菌劑更是具有高效溶藻效果的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，就是為了提供一種復(fù)合菌劑，該復(fù)合菌劑可以影響水華魚(yú)腥藻的生長(zhǎng)效應(yīng)和光合色素，從而起到溶藻作用。本發(fā)明中的芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8分別從黃化的水華魚(yú)腥藻液中分離篩選獲得，芽孢桿菌SSAL-6的分類命名為芽孢桿菌，拉丁文學(xué)名為Bacillussp.;已于2012年6月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 6195。不動(dòng)桿菌SSAL-8的分類命名為不動(dòng)桿菌，拉丁文學(xué)名為Acinetobactersp.,已于2012年6月6日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 6196。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種復(fù)合菌劑，由芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8復(fù)合而成，芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為I 2 2 I。上述復(fù)合菌劑，其中，所述芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為
I Io上述復(fù)合菌劑的制備方法是，將芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8分別置于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在250rpm、37°C下振蕩培養(yǎng)12h，至菌懸液OD值為O. 8 1.0，菌體濃度為IO8 109cells/mL時(shí)，將芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8復(fù)合。上述復(fù)合菌劑的制備方法，其中，所述LB液體培養(yǎng)基的組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0-7. 2。上述復(fù)合菌劑的應(yīng)用，用于降解水華魚(yú)腥藻。上述復(fù)合菌劑的應(yīng)用，其中，當(dāng)芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為1:1時(shí)，復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的降解效果隨復(fù)合菌劑濃度的增大而增加，當(dāng)復(fù)合菌劑的濃度為15%時(shí)，對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a的抑制率達(dá)96%。


圖1為復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的影響電子透射顯微鏡圖；圖2為復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻細(xì)胞數(shù)的影響示意圖；圖3為復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻干重的影響示意圖； 圖4為復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻色素吸收光譜的影響示意圖；圖5為復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a的影響示意圖。
具體實(shí)施例方式以下舉例說(shuō)明本發(fā)明，但是并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻生長(zhǎng)效應(yīng)的影響將芽抱桿菌(Bacillussp.) SSAL-6 和不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp. ) SSAL-8 分別置于200mL LB液體培養(yǎng)基中，250rpm，37°C下振蕩培養(yǎng)12h，至菌懸液OD值為O. 8 1.0(菌體濃度為IO8 109cells/mL)時(shí)，將芽孢桿菌(Bacillussp.) SSAL-6和不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.) SSAL-8 復(fù)合。水華魚(yú)腥藻培養(yǎng)參照藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法(國(guó)家環(huán)保部)，采用水生111號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)液培養(yǎng)，pH為7. 5。培養(yǎng)溫度30±2°C，連續(xù)24h光照，光照強(qiáng)度3000±2001x，
靜置培養(yǎng)，每天定期搖動(dòng)3次。其中，上述的LB液體培養(yǎng)基組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl,IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養(yǎng)基的pH值為7. 0-7. 2。上述的水華魚(yú)腥藻液體培養(yǎng)基組分及配比為磷酸氫二鉀(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸鈣(CaCO3)，
O.1OOg ;檸檬酸鐵(I %水溶液)，O. 5mL ;梓檬酸(I %水溶液)，O. 5mL ;鑰酸(I %水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，1. 5mL ;蒸懼水，1000mL。在水華魚(yú)腥藻濃度為5X IO4 IX IO5個(gè)/mL時(shí)，向IOOmL藻液中加入復(fù)合菌劑(菌體濃度約為 2X IO9 個(gè) /mL,其中 Bacillussp. SSAL-6 和 Acinetobactersp. SSAL-8 菌體濃度均為 IO8-1O9個(gè)/mL)，處理濃度(v/v)梯度為2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%和 15%，每組樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。制備與實(shí)驗(yàn)組相同的一系列不同配比的培養(yǎng)液(LB培養(yǎng)液水生111號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)液)，分別用于培養(yǎng)水華魚(yú)腥藻形成對(duì)照組。以細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定藻體細(xì)胞數(shù)量、并測(cè)定水華魚(yú)腥藻干重。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法從接種計(jì)時(shí)起，每隔24h取樣，用計(jì)數(shù)框進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用移液器取經(jīng)過(guò)超聲波破碎儀打碎過(guò)的藻液0.1mL于計(jì)數(shù)框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數(shù)40X10，隨機(jī)取五個(gè)視野，數(shù)出所看到的細(xì)胞數(shù)，取其平均值。N= 10XaXSi+/Sft ；a表示每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞平均值；Si+R表計(jì)數(shù)框面積；Sft代表視野面積；N代表每mL中細(xì)胞個(gè)數(shù)。水華魚(yú)腥藻干重測(cè)定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的細(xì)胞數(shù)的影響的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明水華魚(yú)腥藻細(xì)胞的去除效果與復(fù)合菌劑的濃度呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，即隨著復(fù)合菌劑濃度的增長(zhǎng)，對(duì)水華魚(yú)腥藻細(xì)胞的去除作用越強(qiáng)。當(dāng)復(fù)合菌劑濃度為2. 5%,5%,7. 5%,10%U2. 5%和15%時(shí)，培養(yǎng)24h對(duì)水華魚(yú)腥藻細(xì)胞的去除率分別為5%、13%、24%、33%、37%和46%，培養(yǎng)168h后分別變?yōu)?0%,35%,54%, 58%、63%和70%，與對(duì)照相比，呈現(xiàn)顯著差異(P < O. 05)。不同濃度的復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的干重的影響的測(cè)定結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明純LB液體培養(yǎng)基的投入對(duì)水華魚(yú)腥藻干重亦會(huì)產(chǎn)生影響，當(dāng)LB液體培養(yǎng)基濃度依次為
2.5%,5%,7. 5%A0%A2. 5%和15%時(shí)，培養(yǎng)168h后的水華魚(yú)腥藻干重相應(yīng)增加，分別為 15. 89,16. 40,16. 77,17. 74,18. 30、和 19. 38mg/mL，而投加不同濃度(2. 5%~ 15% )的復(fù)合菌劑后，分別為14. 55、11· 11、8· 03、6· 66、6· 90和7. llmg/mL。通過(guò)排除LB液體培養(yǎng)基本身對(duì)水華魚(yú)腥藻生長(zhǎng)的影響因素，可見(jiàn)，隨著復(fù)合菌劑濃度從2. 5%依次升至15%，復(fù)合 菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻干重的抑制率依次為8 %、32 %、52 %、63 %、62 %、和63 %。實(shí)施例2復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續(xù)掃描400 750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)色素吸收光譜，并對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a含量進(jìn)行測(cè)定。葉綠素a的提取測(cè)定取水華魚(yú)腥藻藻液IOmL過(guò)O. 45 μ m的復(fù)合纖維素膜，將帶藻細(xì)胞的膜冷凍過(guò)夜，取出后迅速用SmL熱乙醇于熱水浴中萃取2min,將萃取液超聲破碎5 20min后，于暗處?kù)o置2 6h,離心(5000r/min,4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測(cè)吸光值，計(jì)算酸化前的光密度值(E665b = Abs665b-Abs750b),然后滴加200 μ L的lmol/L鹽酸酸化,5min后于波長(zhǎng)665nm和750nm處再測(cè)吸光值，計(jì)算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75J。采用熱乙醇為萃取溶劑，A = 11. 5，K = 2. 43，比色皿光程為1cm。
27.9 X ( Ewsa - Ee65a) X V 葉綠素 a (μ§/ ) =y其中，V表示提取液體積(mL)，V表示樣品的體積(L)。不同濃度的復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻色素吸收光譜的影響的測(cè)定結(jié)果如圖4所示(A、B、C、D、E、F、G 分別代表溶藻菌濃度為 0%、2· 5%、5%、7· 5%、10%、12· 5%、15% )，結(jié)果表明不同濃度的復(fù)合菌劑作用于水華魚(yú)腥藻時(shí)，其色素光譜吸收曲線變化差異較大。中高濃度(> 7. 5% )處理下光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明復(fù)合菌劑已大大地抑制了藻體色素的種類和含量。中低濃度(2. 5 7. 5% )處理下，隨著復(fù)合菌劑濃度的增加，各色素光譜吸收峰值均有降低，這與復(fù)合菌劑對(duì)藻體細(xì)胞數(shù)以及干重的影響相一致，譜圖充分體現(xiàn)復(fù)合菌劑的濃度相關(guān)性。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內(nèi)光傳導(dǎo)者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強(qiáng)弱。不同濃度的復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a的影響的測(cè)定結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明復(fù)合菌劑對(duì)葉綠素a的抑制作用隨著復(fù)合菌劑濃度的增加而增強(qiáng)。復(fù)合菌劑濃度為2. 5%,5%,7. 5%、10%、12. 5%和15%，24h對(duì)葉綠素a的抑制率分別為9%、15%、23%、30%、38%和 44%，168h 后依次升至 76%、81 %、91 %、95%、96%和96%。本發(fā)明的復(fù)合菌劑能夠有效地降解水華魚(yú)腥藻，對(duì)水體富營(yíng)養(yǎng)化的控制提供了科學(xué)依據(jù)，為微生物治理水華的研究提供了重要基礎(chǔ)。在一定條件下，復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的降解效果隨菌劑濃度的增大而增加，當(dāng)復(fù)合菌劑的濃度為15%時(shí)，對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素 a的抑制率可高達(dá)96%。
權(quán)利要求
1.一株芽孢桿菌，從黃化的水華魚(yú)腥藻液中分離篩選獲得，命名為SSAL-6，保藏號(hào)為 CGMCC No. 6195。
2.一株不動(dòng)桿菌，從黃化的水華魚(yú)腥藻液中分離篩選獲得，命名為SSAL-8，保藏號(hào)為 CGMCC No. 6196。
3.一種復(fù)合菌劑，其特征在于，由芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8復(fù)合而成，芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為I 2 2 I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合菌劑，其特征在于，所述芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌 SSAL-8的菌體量之比為1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于，將芽孢桿菌SSAL-6 和不動(dòng)桿菌SSAL-8分別置于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在250rpm、37°C下振蕩培養(yǎng)12h，至菌懸液OD值為O. 8 1. O,菌體濃度為IO8 109cells/mL時(shí)，將芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8復(fù)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于，所述LB液體培養(yǎng)基的組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；LB液體培養(yǎng)基的 pH 值為 7. 0-7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的復(fù)合菌劑的應(yīng)用，用于降解水華魚(yú)腥藻。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的復(fù)合菌劑的應(yīng)用，其特征在于當(dāng)芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為1:1時(shí)，復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的降解效果隨復(fù)合菌劑濃度的增大而增加，當(dāng)復(fù)合菌劑的濃度為15%時(shí)，對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a的抑制率達(dá)96%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種復(fù)合菌劑及其應(yīng)用。該復(fù)合菌劑由芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8復(fù)合而成，其中芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為1～2∶2～1，最好為1∶1。本發(fā)明的復(fù)合菌劑能有效地降解水華魚(yú)腥藻。當(dāng)芽孢桿菌SSAL-6和不動(dòng)桿菌SSAL-8的菌體量之比為1∶1時(shí)，復(fù)合菌劑對(duì)水華魚(yú)腥藻的降解效果隨復(fù)合菌劑濃度的增大而增加，當(dāng)復(fù)合菌劑的濃度為15％時(shí)，對(duì)水華魚(yú)腥藻葉綠素a的抑制率可高達(dá)96％。
文檔編號(hào)C12R1/01GK103013851SQ20121037880
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者沈健英, 孫秀敏 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)