專利名稱：利用GST表達(dá)體系制備的Fertilin Beta胞外段高效價抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程中的DNA重組技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用GST原核表達(dá)體系制備GST-Fertilin Beta融合蛋白的多克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
受精素β (Fertilin Beta)是一種精子表面特異性跨膜糖蛋白，定位在人類8號染色體上，其特異性的表達(dá)在人類睪丸組織和精子中，在精子發(fā)生、精子成熟、精子獲能及精卵結(jié)合和融合中發(fā)揮重要作用。Fertilin Beta蛋白功能及作用機(jī)制應(yīng)深入的研究和探索:受精素在精卵結(jié)合和融合中怎樣發(fā)揮作用；受精素在精子成熟過程中的促進(jìn)作用等等。而研究一種新的蛋白質(zhì)的功能，抗體是最有力的工具之一，在蛋白質(zhì)的檢測和功能研究中廣泛應(yīng)用的免疫組織化學(xué)、免疫印跡和免疫沉淀等一系列技術(shù)，都是基于抗原-抗體相互作用發(fā)展起來的。因此我們制備的FertilinBeta蛋白高效價抗體對于系統(tǒng)研究Fertilin Beta在精子發(fā)生、精子成熟、精子獲能及精卵結(jié)合和融合中的作用機(jī)制意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立一種能夠用于Fertilin Beta蛋白的檢測的模型，為從蛋白水平深入研究Fertilin Beta蛋白功能及相關(guān)疾病提供必要的實(shí)驗(yàn)工具。利用基因工程技術(shù)，將Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸對應(yīng)DNA片段克隆到原核表達(dá)載體PGEX-4T-1中。經(jīng)酶切和序列分析后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，并經(jīng)異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清，并應(yīng)用ProteinA/G將其純化，獲得多克隆抗體?？贵w的效價及特異性采用ELISA和Western blot檢測，并應(yīng)用免疫熒光檢測了 Fertilin Beta蛋白特異性定位于精子頭后部。 本發(fā)明的GST-Fertilin Beta融合蛋白是將利用特殊序列(Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸對應(yīng)DNA片段)構(gòu)建GST-Ferti I in Beta融合蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21得到的高效表達(dá)特異性的GST-Fertilin Beta融合蛋白，這段341-373位氨基酸序列為:Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys SerI611Phe Glu Asp Phe Ala His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gin Cys16 21 26Leu His Asn31其對應(yīng)核苷酸序列為:
gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca60cattttattt caaagcagaa gtcccagtgt cttcacaat99這種GST-Fertilin Beta融合蛋白及其多克隆抗體制備包括以下步驟:第一步，克隆載體的構(gòu)建從人Fertilin Beta基因全長上應(yīng)用PCR技術(shù)以基因組為模板，擴(kuò)增得到的目的片段與PMD18-T載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟得到重組質(zhì)粒后，酶切鑒定并測序。第二步，原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的構(gòu)建將克隆質(zhì)粒和質(zhì)粒pGEX-4T-l雙酶切后，利用回收試劑盒獲得Fertilin Beta基因該區(qū)片段和載體連接。經(jīng) 轉(zhuǎn)化、提取等步驟獲得重組的表達(dá)載體。酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定。第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組質(zhì)粒PGEX-4T_1/Fertilin Beta轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)，GST-Fertilin Beta融合蛋白的表達(dá)。以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。用超聲裂解細(xì)菌，所獲蛋白用Glutathione-Sepharose4B柱純化，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物。第四步,兔抗Fertilin Beta抗血清的制備及純化以純化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔,初次免疫用500 μ g融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2wk后進(jìn)行第I次加強(qiáng)免疫,500 μ g純化的GST-Fertilin Beta融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強(qiáng)免疫I次。于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到1: 100000時,頸動脈放血，收集血清。用ProteinA/G純化抗Fertilin Beta血清，準(zhǔn)備蛋白A sepharose CL-4B親和柱,親和層析使抗體結(jié)合在柱子上,經(jīng)2次洗漆后,將抗體洗脫，達(dá)到純化目的，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物，獲得該發(fā)明的多克隆抗體。應(yīng)用多種免疫學(xué)方法檢測其效價及特異性，結(jié)果顯示該抗體可特異性的與Fertilin Beta蛋白結(jié)合。利用Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸基因序列成功構(gòu)建GST-Fertilin Beta融合蛋白原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21后可高效表達(dá)特異性的GST-Fertilin Beta融合蛋白。以該融合蛋白免疫兔子獲得抗GST-Fertilin Beta融合蛋白的高效價抗體經(jīng)多種免疫學(xué)方法檢測抗體效價及特異性，結(jié)果表明抗體效價高達(dá)I: 1000000且特異性良好。抗體可應(yīng)用于精子中Fertilin Beta蛋白的檢測，對于系統(tǒng)研究Ferti I in Beta蛋白在精子發(fā)生、精子成熟、精子獲能及精卵結(jié)合和融合過程中的作用機(jī)制意義重大。另外，F(xiàn)ertilin Beta蛋白為精子表面特異性蛋白，我們制備的FertilinBeta抗體為精子分離研究奠定了基礎(chǔ)。


:圖1:PCR擴(kuò)增出的Fertilin Beta基因341-373氨基酸片段DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2:雙酶切質(zhì)粒pGEX-4T-l ；圖3:pGEX-4T-l/Fertilin Beta 重組體酶切鑒定結(jié)果；
圖 4:純化后的 GST 及 GST-Fertilin Beta 融合蛋白 SDS-PAGE 圖；圖5:ProteinA/G純化后的Fertilin Beta抗體和純化前的抗Fertilin Beta血清 SDS-PAGE 圖； 圖6:間接ELISA法測定抗體的效價；圖7:Fertilin Beta 抗體特異性的 Western blot 分析；圖8:免疫熒光分析Fertilin Beta蛋白在精子細(xì)胞上的定位；
具體實(shí)施方式
:實(shí)施例1:抗GST-Fertilin Beta血清的在制備1.PCR-PMD18-T/Fertilin Beta 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fertilin Beta 基因全長從 Genebank 得到，基因序列號為 GenBank:AAC51110.1。以基因組為模板，上游引物為5’ -GAA TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT (含EcoRI酶切位點(diǎn));下游:5,-CTC GAG ATT GTG AAG ACA CTG GGA (含 XhoI 酶切位點(diǎn))。應(yīng)用 PCR 成功擴(kuò)增出了 Fertilin Beta基因胞外段314-373位氨基酸對應(yīng)DNA序列長度99bp圖1。擴(kuò)增得到的片段與PMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以EcoRI和SalI單酶切鑒定。2.原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的構(gòu)建將含有Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段的pMD18_T質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后(片段約0.1kbp)，利用回收試劑盒獲得Fertilin Beta基因該區(qū)片段，同時用相同的酶處理質(zhì)粒PGEX-4T-`1 (約5kbp)圖2。然后將回收的Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段和經(jīng)酶切的載體PGEX-4T-1在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜。酶切鑒定重組體，結(jié)果顯示該Fertilin Beta基因胞外段341-373位氨基酸片段正確圖3。3.GST-Fertilin Beta融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組質(zhì)粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Amp+培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按1: 50的比例轉(zhuǎn)接于含Amp+的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。在培養(yǎng)液的A600為0.5 0.6時，加入IPTG至終濃度為0.08mmol/L,不加入IPTG者為陰性對照，置25°C繼續(xù)培養(yǎng)4 5h。離心收集菌體，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。以5000r/min于4°C離心5min，收集菌體，用60mL冰預(yù)冷的NETN懸浮IL菌液的沉淀。用超聲裂解細(xì)菌，再以9600rpm,于4°C離心15min,取上清，過Glutathione_Sepharose4B柱，先以等體積洗脫緩沖液I (含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl,pH = 8.0)洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2 (含IOOmM谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物圖4。4.兔抗Fertilin Beta抗血清的制備以純化的GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔，初次免疫用500 yg融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射。免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照。2wk后進(jìn)行第I次加強(qiáng)免疫，500 μ g純化的GST-Fertilin Beta融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射。之后每隔2wk加強(qiáng)免疫I次。于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到1: 1000000時，頸動脈放血，收集血清。5.ProteinA/G 純化抗 Fertilin Beta 血清將ProteinA/G sepharose CL-4B填料緩慢裝柱,平衡柱子后加入經(jīng)過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結(jié)合，即親和層析使抗體結(jié)合在柱子上，經(jīng)2次洗滌后，加pH2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定。染色結(jié)果顯示純化效果明顯，純化后的樣品有清晰的輕、重鏈帶圖5。實(shí)施例2:GST-Fertilin Beta抗體的分析及應(yīng)用1.GST-Fertilin Beta 抗體效價的測定用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照，將純化后的GST-Fertilin Beta抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后，用間接ELISA測定抗體的效價。結(jié)果顯示，免疫前的兔血清未測出抗融合蛋白GST-Fertilin Beta的抗體,GST-Fertilin Beta抗體的滴度高達(dá)1: 1000000以上圖6。2.GST-Fertilin Beta抗體應(yīng)用于組織中Fertilin Beta蛋白的檢測收集小鼠睪丸組織和培養(yǎng)的特異性不表達(dá)Fertilin Beta蛋白的細(xì)胞，裂解超聲后用BCA蛋白定量試劑盒對其進(jìn)行蛋白定量，之后將樣品等蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE，再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。以5%脫脂奶粉封閉lh，依次滴加兔抗Fertilin Beta抗體(室溫2h、PBS洗3次)及山羊抗兔IgG2HRP (室溫反應(yīng)lh、PBS洗滌3次)，最后加底物DAB顯色，并拍照。結(jié)果顯示 圖7，我們制備的Fertilin Beta抗體與小鼠睪丸組織所表達(dá)的Fertilin Beta蛋白發(fā)生了抗原-抗體反應(yīng)而,在Marker指示的82KD處出現(xiàn)了一條特異的蛋白帶，而特異性不表達(dá)Fertil inBeta蛋白的細(xì)胞沒有出現(xiàn),證明Fertilin Beta抗體特異性好。3.精子表面膜蛋白定位分析將人精子(約IO5個精子/孔)均勻涂于十二孔板中后置于孵箱干燥，4%多聚甲醛固定(室溫2h、PBS洗3次)，此次滴加PBS (對照組)或兔抗抗Fertilin Beta抗體(室溫2h、PBS洗3次)，及避光處理異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔IgG (室溫反應(yīng)lh、PBS洗滌3次)和DAPI(室溫ImiruPBS洗3次)，熒光顯微鏡觀察，并拍照。結(jié)果顯示圖8，F(xiàn)ertilin Beta蛋白特異性表達(dá)于精子頭后部,與報道相符,證明Fertilin Beta抗體具有良好的特異性。〈110〉東北師范大學(xué)<120>利用GST表達(dá)體系制備的Fertilin Beta胞外段高效價抗體及應(yīng)用<160>2〈210〉I<211>99<212>DNA〈213〉人(Homo sapiens)〈400〉Igaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60
權(quán)利要求
1.利用GST表達(dá)體系制備的FertilinBeta蛋白胞外段高效價抗體,其特征在于利用GST表達(dá)體系以Fertilin Beta蛋白胞外段341-373位氨基酸對應(yīng)DNA片段作為特異序列制備的GST-Fertilin Beta融合蛋白作為抗原免疫動物產(chǎn)生抗血清而獲得，該抗血清中抗GST-FertilinBeta 抗體的滴度高達(dá)1: 1000000,并經(jīng)過 Western blot 鑒定該 FertilinBeta抗體具有較好的特異性，其中，341-373位氨基酸序列為:Glu Ala He His Phe Ser Gly Val Lys He Phe Ser Asn Cys SerI611Phe Glu Asp Phe Ala His Phe He Ser Lys Gln Lys Ser Gln Cys16 21 26Leu His Asn31 其對應(yīng)核苷酸序列為:gaagcaattc atttcagtgg tgtgaagatc tttagtaact gcagcttcga agactttgca 60cattttattt caaagcagaa gtcccagtgtcttcacaat 99。
2.如權(quán)利要求1所述的原核表達(dá)GST-FertilinBeta融合蛋白的多克隆抗體的制備方法，其特征在于利用GST表達(dá)系統(tǒng)獲得GST-Fertilin Beta融合蛋白，再經(jīng)免疫兔獲得抗GST-FertilinBeta抗血清,具體包括四步: 第一步，PCR-PMD18-T/Fertilin Beta重組質(zhì)粒的構(gòu)建 Fertilin Beta基因全長從Genebank得到，基因序列號為AAC51110.1，以基因組為模板,上游引物為 5’-GM TTC GAA GCA ATT CAT TTC AGT (含EcoRI 酶切位點(diǎn));下游:5，_CTCGAG ATT GTG AAG ACA C TG GGA (含XhoI酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增得到的片段與pMD18_T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，在含Amp+瓊脂平板上挑選克隆，以堿裂解法小提重組質(zhì)粒后，以EcoRI和SalI單酶切鑒定； 第二步，原核表達(dá)載體PGEX-4T-1的構(gòu)建 將含有Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段的pMD18_T質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切后，利用回收試劑盒獲得Fertilin Beta基因該區(qū)片段，同時用相同的酶處理質(zhì)粒PGEX-4T-1，然后將回收的Fertilin Beta基因胞外段341-373氨基酸片段和經(jīng)酶切的載體PGEX-4T-1在T4DNA連接酶作用下于16°C連接過夜，酶切鑒定重組體，并且測序進(jìn)一步確定； 第三步，GST-Fertilin Beta融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化 重組質(zhì)粒PGEX-4T-1/Fertilin Beta轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取單菌落接入LB/Amp+培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)物按1: 50的比例轉(zhuǎn)接于含Amp+的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期。在培養(yǎng)液的A600為0.5 0.6時，加入IPTG至終濃度為0.08mmol/L，不加入IPTG者為陰性對照，置25°C繼續(xù)培養(yǎng)4 5h。離心收集菌體，以SDS-PAGE進(jìn)行鑒定GST-Fertilin Beta融合蛋白的表達(dá)，并優(yōu)化表達(dá)條件，進(jìn)行大量擴(kuò)增誘導(dǎo)。以5000r/min于4°C離心5min，收集菌體，用60mL冰預(yù)冷的NETN懸浮IL菌液的沉淀。用超聲裂解細(xì)菌，再以9600rpm,于4°C離心15min,取上清，過Glutathione_Sepharose4B柱，先以等體積洗脫緩沖液I (含20mM谷胱甘肽、50mM Tris-Cl,pH = 8.0)洗脫，收集洗脫液，再以等體積洗脫緩沖液2 (含IOOmM谷胱甘肽)洗兩遍，收集洗脫液，SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物； 第四步，兔抗Fertilin Beta抗血清的制備及純化 以純化的Fertilin Beta融合蛋白免疫雄性新西蘭大白兔,初次免疫用500 μ g融合蛋白，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后背部皮下多點(diǎn)注射，免疫前取耳靜脈血分離血清，作為免疫前的血清對照，2wk后進(jìn)行第I次加強(qiáng)免疫，500 μ g純化的Ferti I in Beta融合蛋白與不完全弗氏佐劑等體積混勻，前后四腳掌肌肉注射，之后每隔2wk加強(qiáng)免疫I次，于末次免疫后Iwk取耳血，用ELISA法測定抗體的效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到1: 1000000時，頸動脈放血，收集血清，將ProteinA/G sepharose CL-4B填料緩慢裝柱,平衡柱子后加入經(jīng)過稀釋的抗血清，控制流速保證抗血清與填料的結(jié)合，即親和層析使抗體結(jié)合在柱子上，經(jīng)2次洗滌后,加pH2.7洗脫緩沖溶液將抗體洗脫，收集洗脫液并測定各收集管的280nm光密度，將含抗體的收集管混合，純化后的抗體與純化前的抗血清用SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定； 第五步，F(xiàn)ertilin Beta抗體的免疫學(xué)檢測 用GST-Fertilin Beta融合蛋白免疫前的新西蘭大白兔血清作為對照，將純化后的GST-Fertilin Beta抗體先稀釋10倍再倍比稀釋后采用間接ELISA方法測定抗體的效價，并采用Western blot方法分析Fertilin Beta抗體特異性，將純化的融合蛋白GST-FertilinBeta樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后再電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉封閉Ih，依次滴加兔抗Fertilin Beta抗體，室溫2h、PBS洗3次，山羊抗兔IgG2HRP，室溫反應(yīng)Ih、PBS洗滌 3次，最后加底物DAB顯色，并拍照。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用GST表達(dá)體系制備的Fertilin Beta胞外段高效價抗體及應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)，將Fertilin Beta基因胞外段克隆到原核表達(dá)載體中，經(jīng)酶切鑒定后，用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生GST-Fertilin Beta融合蛋白。以純化的融合蛋白免疫新西蘭兔制備抗血清并用ProteinA/G純化?？贵w的效價及特異性采用ELISA和Western blot檢測，并應(yīng)用免疫熒光檢測了Fertilin Beta蛋白特異性定位于精子頭后部。該抗Fertilin Beta多克隆抗體效價與特異性良好，可以應(yīng)用于細(xì)胞中Fertilin Beta蛋白的檢測并能有效檢出Fertilin Beta蛋白特異性定位于精子頭后部，對于系統(tǒng)研究Fertilin Beta蛋白功能意義重大。
文檔編號C12N15/70GK103073643SQ20121037846
公開日2013年5月1日 申請日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者李曉萌, 楊百全, 趙兵, 伍賢軍, 繆璇, 汪小莞, 許瑩, 李江 申請人:東北師范大學(xué)