專利名稱：細(xì)胞測試體系及構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及細(xì)胞測試體系及構(gòu)建方法和用途。
背景技術(shù)：
在這2種細(xì)胞模型中，我們應(yīng)用了一種名為d2EGFP的報告基因。GFP(greenfluorescent protein)綠色熒光蛋白是來自水母的的基因報告分子，可用于活體、原位、即時的檢測基因表達(dá)及蛋白定位，不需要附加蛋白或底物，GFP在藍(lán)光激發(fā)下會發(fā)出明亮的綠色熒光。GFP熒光穩(wěn)定，不依賴于物種，對活細(xì)胞沒有損害。對GFP改進(jìn)得到EGFP(enhanced green fluorescent protein)激發(fā)出的熒光比野生型GFP強(qiáng)約35倍，選用人類偏愛的密碼子使表達(dá)量提高。d2EGFP是在EGFP的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行了改造，由EGFP融合了小鼠鳥氨酸脫羧酶(MODC)的422-461氨基酸殘基而來，MODC的422-461區(qū)域含有PEST功能域，能夠促使蛋白降解，在不降低表達(dá)強(qiáng)度的前提下減小了半衰期。哺乳動物中EGFP的表達(dá)非常穩(wěn)定，超過24小時。而d2EGFP的半衰期僅為2個小時。d2EGFP蛋白可以用于精確測定啟動子調(diào)節(jié)的mRNA轉(zhuǎn)錄，基因表達(dá)。
我們所用的2種細(xì)胞系分別是CHO-K1細(xì)胞系和HEK-293細(xì)胞系。CHO-K1細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢細(xì)胞系，HEK-293是人胚胎腎細(xì)胞系。二者均為貼壁生長的細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞測試體系及構(gòu)建方法和用途。
細(xì)胞測試體系是CHO-K1/d2EGFP和HEK-293/d2EGFP細(xì)胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV-TK的DNA序列所構(gòu)建的4xCRE-d2EGFP質(zhì)粒。
細(xì)胞測試體系構(gòu)建方法的步驟如下1)設(shè)計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸；2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物；3)將上述的PCR產(chǎn)物克隆到d2EGFP載體上；4)測序鑒定連接產(chǎn)物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質(zhì)粒，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為4xCRE-d2EGFP；
5)將4x CRE-d2EGFP轉(zhuǎn)入CHO-K1和HEK-293細(xì)胞中；6)用G418抗生素篩選轉(zhuǎn)染的CHO-K1和HEK-293細(xì)胞，直至出現(xiàn)抗性克??；7)挑選出抗性細(xì)胞克隆；8)對篩選的細(xì)胞克隆進(jìn)行功能上的測試。
細(xì)胞測試體系的用途是用于篩選與cAMP信號傳導(dǎo)途徑相互作用的化合物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測方便，經(jīng)濟(jì)，易于觀察，可應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選，縮短藥物研發(fā)周期，減少研發(fā)費(fèi)用。


附圖是構(gòu)建細(xì)胞模型的原理圖。
具體實施例方式
我們首先構(gòu)建4xCRE-d2EGFP質(zhì)粒(4x即重復(fù)4次)，將4xCRE連同HSV-tk啟動子克隆入報告基因d2EGFP上，HSV-tk(Herpes simplex virus thymidinekinase)是單純皰疹病毒胸苷激酶。構(gòu)建出的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO-K1與HEK-293細(xì)胞系，用G418篩選，挑選出克隆鑒定，陽性克隆加入foscolin刺激后(foscolin是一種植物提取物，具有使細(xì)胞中cAMP濃度升高的作用)，5個小時后熒光顯微鏡下觀察可見有綠色熒光。
我們成功的構(gòu)建了可供藥物篩選及研究的報告基因細(xì)胞測試體系。這2種測試體系可以用來檢測細(xì)胞中cAMP濃度的變化，所有基于cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的GPCR(G protein coupled receptor)(G蛋白偶聯(lián)受體)都可用此模型來篩選激動劑以及拮抗劑。從篩選出化合物中，有望找出有價值的藥物。此模型靈敏度高，特異性強(qiáng)。檢測方便，經(jīng)濟(jì)，易于觀察。
構(gòu)建報告基因細(xì)胞測試體系的方法為1)設(shè)計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸。
2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。
3)將上述的PCR產(chǎn)物克隆到d2EGFP載體上。
4)測序鑒定連接產(chǎn)物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質(zhì)粒，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為4xCRE-d2EGFP。
5)將4x CRE-d2EGFP轉(zhuǎn)入CHO-K1和HEK-293細(xì)胞中。
6)用G418抗生素篩選轉(zhuǎn)染的CHO-K1和HEK-293細(xì)胞，直至出現(xiàn)抗性克隆。
7)挑選出抗性細(xì)胞克隆。
8)對篩選的細(xì)胞克隆進(jìn)行功能上的測試。
首先，本發(fā)明設(shè)計一段DNA序列，此序列含有4xCRE序列和HSV-TK序列，CRE(cAMP response element)是與磷酸化的CREB蛋白結(jié)合的DNA序列，4x即重復(fù)4次。HSV-TK是單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶啟動子，可用于啟動基因在哺乳動物中表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度為中等。對這部分DNA序列的設(shè)計是本發(fā)明的關(guān)鍵之處，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，引物設(shè)計的時候在5’端加上了BamH I酶切位點(diǎn)序列以方便連接到其它的載體上。以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。
在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明將上述的PCR產(chǎn)物克隆到d2EGFP載體上。d2EGFP載體含有編碼d2EGFP的DNA序列，在d2EGFP基因的上游沒有啟動子，方便因不同的需要而插入各種啟動子。該載體上有編碼新霉素(neomycin)的基因可用于真核細(xì)胞篩選標(biāo)記，同時也可以作為原核細(xì)胞的篩選標(biāo)記，可以用卡那霉素來篩選。連接的過程首先要BamH I內(nèi)切酶將d2EGFP載體上切成線性，并用同樣的內(nèi)切酶作用PCR產(chǎn)物，然后將酶切后的產(chǎn)物以適當(dāng)比例混合，在T4連接酶的作用下完成連接。
將上述的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布到含有卡那霉素的平板上。隨機(jī)挑選菌落，小量擴(kuò)增培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，測序鑒定插入有4xCRE-HSV-TK序列的陽性質(zhì)粒。克隆成功的質(zhì)粒應(yīng)含有4xCRE-HSV-TK序列，位于d2EGFP基因的上游并與設(shè)計的序列完全一致，將其命名為4x CRE-d2EGFP。該質(zhì)粒包含本發(fā)明的4xCRE序列，以及HSV-tk啟動子和d2EGFP報告基因。
本發(fā)明進(jìn)一步地將4xCRE-d2EGFP轉(zhuǎn)入CHO-K1細(xì)胞中和HEK-293細(xì)胞中，二者均為貼壁生長的細(xì)胞系。CHO-K1細(xì)胞應(yīng)用F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液。HEK-293細(xì)胞應(yīng)用DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清培養(yǎng)，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)液。二者均用0.25％胰蛋白酶消化傳代。轉(zhuǎn)染的方式可以用脂質(zhì)體方法，磷酸鈣方法，電轉(zhuǎn)化等轉(zhuǎn)染方式。在本發(fā)明中，我們應(yīng)用的是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法。
轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以用G418抗生素篩選出抗性克隆。G418是一種類新霉素的氨基糖苷，可以抑制原核和真核細(xì)胞蛋白合成，4xCRE-d2EGFP載體上含有neomycin抗性基因，因此G418可以用來篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4xCRE-d2EGFP質(zhì)粒的細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后2天在CHO-K1細(xì)胞中和HEK-293細(xì)胞中加入G418(600ug/ml)，每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，直至出現(xiàn)抗性克隆。挑取若干個抗性克隆到96孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)目后進(jìn)行功能上的測試，具體方法是加入foskolin(10uM)，foscolin是一種植物提取物，具有使細(xì)胞中cAMP濃度升高的作用。5個小時后在熒光顯微鏡下觀察，比較加入foskolin前后熒光強(qiáng)度的改變。可以觀察到未加入foskolin時細(xì)胞沒有綠色熒光即沒有d2EGFP的表達(dá)，而加入后有很強(qiáng)的綠色熒光，d2EGFP的表達(dá)很強(qiáng)。化合物篩選方法的步驟如下1)將待測化合物加入細(xì)胞測試體系；2)采用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光變化來檢測細(xì)胞中cAMP濃度的改變；3)所有能使測試細(xì)胞發(fā)生綠色熒光變化的化合物即為與cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑相互作用的化合物。
序列表1.SEQ ID NO.1 4xCRE-HSV-TK序列(1)序列特征a.長度210堿基b.類型DNAc.鏈型單鏈d.幾何結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述ggctggcgta gggcctgcgt cagctgcagc ccgccggagc tcgacgtcac agtatgacgg 60ccatgggagc tcaaattgac gtcatggtaa aaattgacgt catggtaaga attcgaacac120gcagatgcag tcggggcggc gcggtccgag gtccacttcg ccatattaag gtgacgcgtg180tggcctcgaa caccgagcga ccctgcacgt 210
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞測試體系，其特征在于它是CHO-K1/d2EGFP和HEK-293/d2EGFP細(xì)胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV-TK的DNA序列所構(gòu)建的4xCRE-d2EGFP質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞測試體系，其特征在于所說的4xCRE和HSV-TK的DNA序列為SEQ ID NO.1
3.一種細(xì)胞測試體系構(gòu)建方法，其特征在于它的步驟如下1)設(shè)計4xCRE-HSV-TK序列，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸；2)以合成的4xCRE-HSV-TK寡核苷酸為模板，設(shè)計引物擴(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物；3)將上述的PCR產(chǎn)物克隆到d2EGFP載體上；4)測序鑒定連接產(chǎn)物，挑選出正確插入有4xCRE-HSV-TK序列的重組質(zhì)粒，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為4xCRE-d2EGFP；5)將4x CRE-d2EGFP轉(zhuǎn)入CHO-K1和HEK-293細(xì)胞中；6)用G418抗生素篩選轉(zhuǎn)染的CHO-K1和HEK-293細(xì)胞，直至出現(xiàn)抗性克隆；7)挑選出抗性細(xì)胞克隆；8)對篩選的細(xì)胞克隆進(jìn)行功能上的測試。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種細(xì)胞測試體系，其特征在于所說的4xCRE和HSV-TK的DNA序列為SEQ ID NO.1
5.一種細(xì)胞測試體系的用途，其特征在于它用于篩選與cAMP信號傳導(dǎo)途徑相互作用的化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種細(xì)胞測試體系的用途，其特征在于所說的化合物篩選方法的步驟如下1)將待測化合物加入細(xì)胞測試體系；2)采用熒光顯微鏡觀察是否有綠色熒光變化來檢測細(xì)胞中cAMP濃度的改變；3)所有能使測試細(xì)胞發(fā)生綠色熒光變化的化合物即為與cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑相互作用的化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞測試體系及構(gòu)建方法和用途。細(xì)胞測試體系是CHO－K1/d2EGFP和HEK－293/d2EGFP細(xì)胞系，并且其中包含由4xCRE和HSV－TK的DNA序列所構(gòu)建的4xCRE－d2EGFP質(zhì)粒。細(xì)胞測試體系構(gòu)建方法是設(shè)計4xCRE－HSV－TK序列，人工合成相應(yīng)的寡核苷酸；以該寡核苷酸為模板，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并克隆到d2EGFP載體上；測序鑒定連接產(chǎn)物，挑選出正確的重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入CHO－K1和HEK－293細(xì)胞中；用G418抗生素篩選抗性克隆并進(jìn)行功能測試。細(xì)胞測試體系的用途是用于篩選與cAMP信號傳導(dǎo)途徑相互作用的化合物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測方便，經(jīng)濟(jì)，易于觀察，可應(yīng)用于大規(guī)模藥物篩選，縮短藥物研發(fā)周期，減少研發(fā)費(fèi)用。
文檔編號C12Q1/68GK1414108SQ02136218
公開日2003年4月30日 申請日期2002年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月24日
發(fā)明者閻東升, 董偉, 談學(xué)海, 胡詠武, 汪建 申請人:杭州華大基因研發(fā)中心