專利名稱：：一種高效裂解衣原體胞壁的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及微生物學領域，衣原體屬(G^7邁,Wa)，不同衣原體種的衣原體胞壁的裂解技術，特別提供了一種高效裂解衣原體胞壁，充分釋放胞內物質，并保持其完整生物學活性。提高了分子生物檢測方法檢測衣原體感染的靈敏度和準確性。
背景技術：
：衣原體易感人類、哺乳動物和禽類，引起肺炎、結膜炎、鼻炎和腹瀉等，在家畜以流產和肺炎為特征，是一類十分重要的自然疫源性人獸共患疾病的病原體，嚴重地危害人畜禽類的健康，同時對我國公共衛(wèi)生事業(yè)造成極大的影響。衣原體在生物學分類上屬于衣原體屬(^W頂7^'a)，是一類在真核細胞內專營寄生生活的微生物。多呈球形或卵圓形大小不同的顆粒，直徑0.21.5"m。衣原體內含有DNA和RNA兩種類型的核酸；具有獨特的發(fā)育周期，具有獨立的酶系統(tǒng)，能分解葡萄糖釋放C02，有些還能合成葉酸鹽，但缺乏產生代謝能量的作用，必須依靠宿主細胞的代謝中間產物，因而表現(xiàn)嚴格的細胞內寄生。衣原體具有粘肽組成的胞壁，常規(guī)采用裂解衣原體胞壁的方法是置衣原體樣品在-20-40。C冷凍，取出于室溫融解，再冷凍，如此反復凍融三次，其目的是導致衣原體胞壁破裂，釋放胞內具生物學活性物質于介質中；或采用石炭酸、木瓜蛋白酶或加溫6(TC所破壞，此類方法會導致核蛋白質變性，喪失其生物學活性。衣原體都可在68日齡雞胚卵黃囊中繁殖，或采用HeLa細胞、猴腎細胞、人羊膜細胞培養(yǎng)增殖。當前，人、畜和禽類感染衣原體的診斷方法多采用設計不同的特異性引物，應用多聚酶鏈式反應(PCR)可特異性地診斷沙眼衣原體，肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體感染，PCR檢測方法具有敏感性高，特異性強的特點，現(xiàn)被廣泛應用。但提供PCR檢測衣原體的樣品需將衣原體胞壁進行裂解，使胞內核酸釋放于介質中作為檢測樣品。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種高效裂解衣原體胞壁的方法，采用本方法會使核蛋白質保持較高的生物學活性。本發(fā)明提供了一種高效裂解衣原體胞壁的方法，其特征在于將衣原體樣品放置-80°C，1012h;取出后放入預冷-5(TC左右的真空杯中，維持負壓5.5Xl(Tmbar，2_3h。本發(fā)明高效裂解衣原體胞壁的方法中，所述衣原體樣品最好來源于雞胚卵黃囊膜或細胞培養(yǎng)物。采用本發(fā)明方法針對不同種的衣原體樣品進行處理后，采用多聚酶鏈式反應(PCR)實驗結果顯示，本方法可高效裂解衣原體胞壁，充分釋放胞內核酸，提高核酸檢測靈敏度和準確性，從而提高人、畜、禽類感染衣原體感染的診斷率。具體實施例方式具體操作步驟雞胚卵黃囊膜或細胞培養(yǎng)衣原體樣品0.51毫升放置-80°C，1012h(或過夜)，取出后放入預冷-5(TC左右的真空杯中，維持負壓5.5X10—imbar，2-3h后，使樣品中衣原體胞壁高效裂解，胞內核酸物質充分釋放于介質中，并保持其較高的生物學活性。實施例l采用本發(fā)明方法裂解衣原體樣品:采集湖北省某縣24戶農戶伺養(yǎng)豬63份糞便樣品(份/個體)，樣品經(jīng)無菌處理后，在無菌條件下接種68d齡雞胚卵黃囊腔，37t:培養(yǎng)7天，收集36天死亡雞胚的卵黃囊膜，用組織勻漿器制成卵黃囊膜勻漿。分別設計沙眼衣原體，肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體的特異性引物，進行多聚酶鏈式反應(PCR)檢測實驗，結果如下種/衣原體樣品(n)陽性(+)陰性(-)檢出百分率(％)肺炎衣原體63115217.46沙眼衣原體63194430.15鸚鵡熱衣原體6375611.11合計3758.7比較例63份樣品同上，采用常規(guī)采用裂解衣原體胞壁的方法是置衣原體樣品在-20-40。C冷凍，取出再室溫溶解，再冷凍，如此反復凍融三次。PCR檢測方法同上，結果如下種/衣原體樣品(n)陽性(+)陰性(-)檢出百分率(％)肺炎衣原體633604.76沙眼衣原體6385512.60鸚鵡熱衣原體630630合計1117.46比較例1-263份樣品同上，采用常規(guī)采用裂解衣原體胞壁的方法是加溫6(TC后，如上述方法作PCR檢測，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2采用本發(fā)明方法裂解衣原體樣品采集湖北省某縣3農戶伺養(yǎng)觀賞鸚鵡鳥110份糞便樣品(份/個體)，樣品經(jīng)無菌處理后，在無菌條件下接種68d齡雞胚卵黃囊腔，37'C培養(yǎng)7天，收集36天死亡雞胚的卵黃囊膜，用組織勻漿器制成卵黃囊膜勻漿。分別設計沙眼衣原體，肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體的特異性引物，進行多聚酶鏈式反應(PCR)檢測實驗，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>比較例2-1:110份樣品同上，采用常規(guī)采用裂解衣原體胞壁的方法是置衣原體樣品在-20-4(TC冷凍，取出再室溫溶解，再冷凍，如此反復凍融三次。PCR檢測方法同上，結果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>比較例2-2110份樣品同上，采用常規(guī)采用裂解衣原體胞壁的方法是在樣品中0.25%木瓜蛋白酶，置37匸，20分鐘后，如上述方法作PCR檢測，結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種高效裂解衣原體胞壁的方法，其特征在于將衣原體樣品放置-80℃，10～12h；取出后放入預冷-50℃左右的真空杯中，維持負壓5.5×10-1mbar，2-3h。2、按照權利要求1所述高效裂解衣原體胞壁的方法，其特征在于所述衣原體樣品來源于雞胚卵黃囊膜或細胞培養(yǎng)物。全文摘要一種高效裂解衣原體胞壁的方法，其特征在于將衣原體樣品放置-80℃，10～12h；取出后放入預冷-50℃左右的真空杯中，維持負壓5.5×10^-1mbar，2-3h。本發(fā)明方法充分釋放胞內物質，并保持其完整生物學活性。提高了分子生物檢測方法檢測衣原體感染的靈敏度和準確性。文檔編號C12N1/06GK101285037SQ20071001093公開日2008年10月15日申請日期2007年4月12日優(yōu)先權日2007年4月12日發(fā)明者吳勇敢,霜唐,忠張,李天憲,李永東,范兆軍,陳繩亮申請人:中國科學院武漢病毒研究所