專利名稱：巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系及其建立方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)，具體涉及巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系及其建立 和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
巫山淫羊藿(E. wushanense)，來源于小檗科(Berberdiaceae)淫羊藿屬 (Epimedium)的多年生宿根性草本植物。李時珍《本草綱目》中稱其有“益精氣，堅筋骨， 補腰膝，強心力，，之功效?，F(xiàn)代藥理實驗研究表明，淫羊藿能增加心腦血管血流量，促進造 血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤，補腎陽，強筋骨，祛風(fēng)濕等功效，臨床應(yīng)用 十分廣闊《國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部KS].北京化學(xué)工業(yè)出版社， 2000. 267.；李晶晶，于世鳳，李鐵軍，等.淫羊藿對口腔各礦化組織破骨細胞性骨吸收的體 外實驗研究[J].中國口腔醫(yī)學(xué)雜志，2002，37(5) :391，》。其有效成分為淫羊藿甙等黃酮類 化合物和多糖等次生代謝產(chǎn)物《郭寶林，肖培根.淫羊藿屬植物中的黃酮類成分及其分類 學(xué)意義.植物分類學(xué)報，1999，37 (3) :228.》。隨著現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)化的進程，現(xiàn)代科學(xué)對淫 羊藿的深入研究，新的療效的不斷發(fā)現(xiàn)，以淫羊藿為主要原料的中成藥、民族藥產(chǎn)品不斷問 世，市場對淫羊藿需求量愈來愈大，使其野生資源漸有不能滿足需求之虞。國內(nèi)外淫羊藿細 胞懸浮培養(yǎng)及其黃酮含量的研究鮮見報道。而植物細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物具有提高產(chǎn)率、縮短周期、調(diào)控其生產(chǎn)過 程、提高產(chǎn)品質(zhì)量等顯著特點。因此，了解巫山淫羊藿懸浮細胞的生長特征，對其懸浮細胞 產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在提供一種巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系及其建立方法和應(yīng)用。通 過研究巫山淫羊藿懸浮培養(yǎng)條件及其對愈傷組織中黃酮含量的影響，建立巫山淫羊藿細胞 懸浮培養(yǎng)的技術(shù)體系，以期為巫山淫羊藿野生資源保護及建立高效的淫羊藿黃酮離體生產(chǎn) 體系提供技術(shù)基礎(chǔ)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用正交試驗和單因素試驗，研究接種量、激素配比、糖 濃度、培養(yǎng)基種類對細胞生長及黃酮含量的影響，而建立了一種巫山淫羊藿懸浮細胞培 養(yǎng)體系，該體系是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1. Omg · ^2,4-0,0. 2mg · L^1BA,蔗糖 30-50mg ·Ι^，調(diào)節(jié)pH值在5. 8，于121°C高壓滅菌15-20分鐘配制成的生長培養(yǎng)基；其中以 蔗糖40mg · L-1最佳。利用巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系對巫山淫羊藿愈傷組織細胞懸浮培養(yǎng)的方法 步驟為1)、從淫羊藿幼嫩葉片誘導(dǎo)得到的愈傷組織，經(jīng)過繼代培養(yǎng)反復(fù)篩選后選取生長 均一，質(zhì)地疏松，分散性好的愈傷組織作接種材料；2)、在愈傷組織接種繼代16天后，接種在培養(yǎng)液中進行振蕩培養(yǎng)，在120rpm，24士2°C，光照12h · Cf1培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用同繼代愈傷組織的培養(yǎng)基相同的激素和蔗糖濃度 配比，LS 培養(yǎng)基 +2，4-D2. Omg · L-1+?！?5mg · L^6-BA+ 蔗糖(Sugar) 30g · L-1，只是不加瓊脂， 培養(yǎng)瓶采用IOOmL的三角瓶；3)、每瓶中加培養(yǎng)液30mL，初始接種量在l_2g范圍內(nèi)，懸浮培養(yǎng)初期IOd天后用 120目的不銹鋼篩對培養(yǎng)物進行過濾，以除去大細胞團，保留分散程度好的小細胞團及單細 胞；4)、初期每半個月?lián)Q培養(yǎng)液1次，每次換培養(yǎng)液時先將培養(yǎng)物靜置，倒去上層2/3 培養(yǎng)液，保留1/3原液，加入2/3新液，從懸浮培養(yǎng)初期半個月繼代1次，逐步縮短為一周繼 代1次，這樣通過3-4次繼代培養(yǎng)，即可得到只含單細胞或小細胞團的培養(yǎng)物，將這些細胞 混勻，得到懸浮培養(yǎng)細胞；5)、將得到的懸浮培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物在培養(yǎng)6d天后，用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾收 集細胞，然后稱量一定數(shù)量的細胞接種到分裝有30mL液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中到進行 培養(yǎng)，的所述液體培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1. Omg. ^2,4-0,0. 2mg -T1BA, 蔗糖30-50mg · ΙΛ調(diào)節(jié)ρΗ值在5. 8，于121°C高壓滅菌15-20分鐘配制成的生長培養(yǎng)基， 每瓶接種繼代培養(yǎng)6d后的經(jīng)400目無菌不銹鋼篩網(wǎng)過濾的2g淫羊藿鮮細胞，在120rpm， 24士2°C，每天光照12h培養(yǎng)；其中以蔗糖40mg · L—1最佳；6)、培養(yǎng)后，每3d取5瓶細胞培養(yǎng)物測定其PCV，再用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，洗 滌，稱量其鮮重，再60°C烘干至恒重稱量得干重。利用本發(fā)明的巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系，接種量為鮮重2g每30mL，該懸浮細 胞培養(yǎng)體系能獲得高產(chǎn)黃酮。


圖1巫山淫羊藿懸浮培養(yǎng)細胞生長曲線圖2巫山淫羊藿懸浮培養(yǎng)細胞黃酮含量變化曲線圖3懸浮培養(yǎng)細胞PCV變化曲線圖4懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中殘?zhí)呛孔兓€圖5懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中N03_和NH4+含量變化曲線圖6懸浮培養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中PO33+含量變化曲線
具體實施例方式實施例1建立巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系本發(fā)明采用正交試驗和單因素試驗，研究接種量、激素配比、糖濃度、培養(yǎng)基種類 對細胞生長及黃酮含量的影響而建立巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系。1、材料與方法1. 1材料培養(yǎng)從淫羊藿幼嫩葉片誘導(dǎo)得到的愈傷組織，經(jīng)過繼代培養(yǎng)反復(fù)篩選后 選取生長均一，質(zhì)地疏松，分散性好的淡黃色的愈傷組織作接種材料。在愈傷組織接種繼代 16天后，接種在培養(yǎng)液中進行振蕩培養(yǎng)(120rpm)，光照12h · cT1。培養(yǎng)液采用同繼代愈傷 組織的培養(yǎng)基相同的激素和蔗糖濃度配比，LS培養(yǎng)基+2，4-D2. Omg -L^+O. 5mg -r^-BA+SugarfOg·!/1，只是不加瓊脂。培養(yǎng)瓶采用IOOmL的三角瓶。每瓶中加培養(yǎng)液30mL。懸浮培養(yǎng) 初期IOd天后用120目的不銹鋼篩對培養(yǎng)物進行過濾，以除去大細胞團，保留分散程度好的 小細胞團及單細胞。在懸浮培養(yǎng)初期，培養(yǎng)物生長很慢，對環(huán)境適應(yīng)能力很差。初期每半個 月?lián)Q液1次，每次換液時先將培養(yǎng)物靜置，倒去上層2/3培養(yǎng)液，保留1/3原液，加入2/3新 液。從懸浮培養(yǎng)初期半個月繼代1次，逐步縮短為一周繼代1次。這樣通過3-4次繼代培 養(yǎng)，即可得到只含單細胞或小細胞團的培養(yǎng)物。將這些細胞混勻，得到懸浮培養(yǎng)細胞。1. 2培養(yǎng)方法將得到的懸浮培養(yǎng)細胞的懸浮培養(yǎng)物在培養(yǎng)6d天后，用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾收 集細胞。然后在超凈工作臺上用電子天平稱量一定數(shù)量的細胞接種到分裝有30mL液體培 養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中到進行培養(yǎng)。1. 3懸浮培養(yǎng)細胞生長實驗參數(shù)的測定以懸浮培養(yǎng)細胞的鮮重和總黃酮含量為生長指標，所得試樣為4-5個平行試樣的 平均值。細胞鮮重測定20d天懸浮培養(yǎng)結(jié)束，用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集細胞，用蒸餾 水洗去細胞表面的培養(yǎng)液，再用濾紙吸取多余水分，最后稱量得到細胞鮮重。細胞干重測定把收獲的細胞測其鮮重以后，置于60°C的烘箱中過夜烘干至恒
重，稱量得細胞干重。細胞增長率=(收獲細胞濕重-接種細胞濕重)/接種細胞濕重X 100%。培養(yǎng)物中總黃酮含量的測定總黃酮含量采用分光光度法。將懸浮培養(yǎng)細胞收集， 洗滌，60°C烘干至恒重，研細，取0. 05g粉末至三角瓶中，加入體積濃度85%乙醇IOmL浸泡， 室溫振蕩48h。過濾得到總黃酮提取液。取濾液0. 5mL于試管中，再加入IOmL體積濃度85% 乙醇搖勻得到樣品液，在269. 56nm處測吸光度。根據(jù)標準曲線計算相應(yīng)的樣品中總黃酮的 含量。用淫羊藿甙標準品以同樣方法測得標準曲線為C = 25. 349A-0. 2225,R2 = 0. 9990， 其中C為總黃酮含量(ug .mL-1)。2、結(jié)果2. 1初始接種密度對淫羊藿懸浮培養(yǎng)細胞生長和總黃酮的影響在超凈工作臺上用電子天平稱量lg、2g、3g懸浮培養(yǎng)細胞接種到添加了 2. Omg · L、，4-D、0. 5mg · I^BA、蔗糖30mg · L-1的30mL的LS培養(yǎng)液中。20d培養(yǎng)結(jié)束后收 集細胞，測量細胞增長率和總黃酮含量。培養(yǎng)結(jié)果如表1所示，接種量對細胞收獲后的總 黃酮含量影響不大，最后均能達到5.0%左右。但對黃酮產(chǎn)量有一定的影響。懸浮培養(yǎng)中， 初始接種量的多少對細胞的生長有很大的影響。由表1可以看出，初始接種量在l_2g(每 30mL培養(yǎng)液)范圍內(nèi)，細胞增長率隨接種量的增加而增加，在2g時達到最大值，而此時的懸 浮細胞培養(yǎng)體系中顆粒均勻，顏色鮮艷，分散性好；如繼續(xù)增加接種量，細胞鮮重和干重的 增殖倍數(shù)呈下降趨勢，懸浮培養(yǎng)液也變的混濁，鏡檢時發(fā)現(xiàn)許多細胞內(nèi)含物較少，空細胞很 多，且瓶壁上聚集了很多的衰敗細胞，所以懸浮細胞系在繼代培養(yǎng)過程中，初始接種量以每 30mL的液體培養(yǎng)基加入2g左右的培養(yǎng)物為宜。表1接種量對淫羊藿懸浮培養(yǎng)細胞生長和黃酮合成的影響
權(quán)利要求
一種巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系，其特征是，該體系是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1.0mg·L 12，4 D，0.2mg·L 1BA，蔗糖30 50mg·L 1，調(diào)節(jié)pH值在5.8，于121℃高壓滅菌15 20分鐘配制成的生長培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系，其特征在于該體系是以B5培 養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1. Omg · L、，4-D，0. 2mg · L^1BA,蔗糖40mg · Λ調(diào)節(jié)ρΗ值在5. 8， 于121°C高壓滅菌15-20分鐘配制成的生長培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立方法、其特征在 于，該懸浮細胞培養(yǎng)體系采用正交試驗和單因素試驗，研究接種量、激素配比、糖濃度、培養(yǎng) 基種類對細胞生長及黃酮含量的影響基礎(chǔ)上而建立。
4.一種巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系懸浮培養(yǎng)巫山淫羊藿愈傷組織細胞的方法，其特 征在于，方法步驟為1)、從淫羊藿幼嫩葉片誘導(dǎo)得到的愈傷組織，經(jīng)過繼代培養(yǎng)反復(fù)篩選后選取生長均一， 質(zhì)地疏松，分散性好的愈傷組織作接種材料；2)、在愈傷組織接種繼代16天后，接種在培養(yǎng)液中進行振蕩培養(yǎng)，在120rpm，24士2°C， 光照12h · Cf1培養(yǎng)，培養(yǎng)液采用同繼代愈傷組織的培養(yǎng)基相同的激素和蔗糖濃度配比，LS 培養(yǎng)基+2，4-D2. Omg · L^+O. 5mg · Ll-BA+蔗糖30g · L—1，只是不加瓊脂，培養(yǎng)瓶采用IOOmL 的三角瓶；3)、每瓶中加培養(yǎng)液30mL，初始接種量在l_2g范圍內(nèi)，懸浮培養(yǎng)初期IOd天后用120目 的不銹鋼篩對培養(yǎng)物進行過濾，以除去大細胞團，保留分散程度好的小細胞團及單細胞；4)、初期每半個月?lián)Q培養(yǎng)液1次，每次換培養(yǎng)液時先將培養(yǎng)物靜置，倒去上層2/3培養(yǎng) 液，保留1/3原液，加入2/3新液，從懸浮培養(yǎng)初期半個月繼代1次，逐步縮短為一周繼代1 次，這樣通過3-4次繼代培養(yǎng)，即得到只含單細胞或小細胞團的培養(yǎng)物，將這些細胞混勻， 得到懸浮培養(yǎng)細胞；5)、將得到的懸浮培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物在培養(yǎng)6d天后，用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾收集細 胞，然后稱量一定數(shù)量的細胞接種到分裝有30mL液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中進行培養(yǎng)， 所述的液體培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加1. Omg · ^2,4-0,0. 2mg · I^1BA,蔗糖 30-50mg · L—1，調(diào)節(jié)ρΗ值在5. 8，于121°C高壓滅菌15-20分鐘配制成的生長培養(yǎng)基，每瓶接 種繼代培養(yǎng)6d后的經(jīng)400目無菌不銹鋼篩網(wǎng)過濾的2g淫羊藿鮮細胞，在120rpm，24士2°C， 每天光照12h培養(yǎng)；6)、培養(yǎng)后，每3d取5瓶細胞培養(yǎng)物測定其PCV，再用400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，洗滌，稱 量其鮮重，再60°C烘干至恒重稱量得干重。
5.如權(quán)利要求4所述的用巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系懸浮培養(yǎng)巫山淫羊藿愈傷組 織細胞的方法，其特征在于，步驟5)中所述的液體培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附 加 1. Omg 'U^A-0,0. 2mg ·I^1BA,蔗糖 40mg ·Ι^，調(diào)節(jié) ρΗ 值在 5. 8，于 121 °C高壓滅菌 15-20 分鐘配制成的生長培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系及其建立方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用正交試驗和單因素試驗，研究接種量、激素配比、糖濃度、培養(yǎng)基種類對細胞生長及黃酮含量的影響。利用松脆的胚性愈傷組織，可以很容易的建立起理想的巫山淫羊藿懸浮細胞培養(yǎng)體系。巫山淫羊藿愈傷組織細胞懸浮培養(yǎng)在B5基本培養(yǎng)基中并附加1.0mg·l-12，4-D和0.2mg·l-1BA，蔗糖濃度30-50g·l-1，接種量為鮮重2g每30ml，這樣建立起的懸浮細胞培養(yǎng)體系能獲得高產(chǎn)黃酮。
文檔編號C12N5/04GK101948797SQ201010505618
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者權(quán)秋梅, 韓素菊, 黎云祥 申請人:黎云祥