專利名稱：編碼細(xì)胞壁降解酶的核酸序列和在設(shè)計(jì)對鐮孢和其他病原體的抗性中的應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及來源于真菌基因的、編碼具有細(xì)胞壁降解活性的多肽的核酸序列，以及分離的具有細(xì)胞壁降解活性的多肽。本發(fā)明也涉及含有該核酸序列的重組核酸分子、載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法，包括在植物細(xì)胞中表達(dá)以賦予或提高植物對鐮孢(Fusarium)和其他病原體的抗性。
2.本領(lǐng)域的描述綜述對本國市場和出口市場來說，小麥都是最重要的糧食作物之一。美國每年大約生產(chǎn)24億蒲式耳小麥，價(jià)值超過70億美元。鐮孢性穗枯萎(Fusarium head blight)或瘡痂病(scab)是小麥、大麥、燕麥、黑麥和冰草的一個(gè)真菌性疾病，它影響谷粒的產(chǎn)量和質(zhì)量。它在世界各處都可發(fā)生，特別是在抽穗期，當(dāng)溫度和濕度適合致病因子——禾谷鐮孢(Fusarium graminearum)增殖的時(shí)候。在近十年內(nèi)，穗枯萎病使美國和加拿大的種植者和加工者遭受了數(shù)十億美元的損失。在明尼蘇達(dá)州、北達(dá)科他州和南達(dá)科他州，由于鐮孢性穗枯萎病所造成的小麥產(chǎn)量和谷物質(zhì)量方面的損失在1993年接近10億美元，其后幾年又損失了2-4億美元。在俄亥俄州、密西根州、印地安那州和伊利諾斯州，該病所造成損失在1995和1996年超過3億美元。谷物的質(zhì)量也大打折扣，因?yàn)槭芨腥镜墓任锿ǔ徽婢a(chǎn)生的、對人和牲畜有害的真菌毒素、嘔吐毒素或脫氧瓜蔞鐮菌醇(DON)所污染。除此之外，該病害在上述中西部地區(qū)威脅大麥的生產(chǎn)，因?yàn)槠【粕a(chǎn)者根本不能容忍在谷物中存在嘔吐毒素。
穗枯萎病谷類作物，包括小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥，對許多類型的真菌和多種致病性鐮孢屬真菌是易感的。禾谷鐮孢(Schwabe)和大刀鐮孢(Fusarium culmorum)是小麥、大麥、燕麥和黑麥的被稱作鐮孢性穗枯萎病、穗枯萎病或瘡痂病的主要致病因素(見Bai和Shaner 1994；Parry等1995的綜述)。病原體的生命周期在兩個(gè)宿主——小麥和玉米之間交替。禾谷鐮孢的冬孢子體(teliomorph)(有性階段)被稱作玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)，可引起玉米的莖、穗腐爛和幼苗的穗枯萎。穗枯萎病是小麥和大麥的一個(gè)世界性問題，而且自1991以后在美國以流行比例發(fā)病。至今，在小麥、大麥或它們的有性兼容性親緣植物中還沒有鑒別出鐮孢性穗枯萎病的有效的抗性基因。由于缺乏對該病害的抗性，加上免耕農(nóng)業(yè)和不利的氣候模式，結(jié)果造成12個(gè)州的小麥和大麥工業(yè)遭受了26億美元的直接損失。由免耕農(nóng)業(yè)導(dǎo)致的玉米和小麥留茬的不斷積累有助于孢子和分生孢子在田間的增殖。而且，開花(花粉脫落)時(shí)降雨期和溫暖的溫度都有利于病原體的發(fā)芽和生長。禾谷鐮孢引起含發(fā)育中的谷粒的花器官(小花)的死亡，使穗呈現(xiàn)漂白狀或“痂狀” 外觀，并造成谷物從中等程度到嚴(yán)重程度的減產(chǎn)。除此之外，禾谷鐮孢和其他種類的鐮孢可產(chǎn)生單端孢菌素真菌毒素，例如脫氧瓜蔞鐮菌醇(DON)，它會使疾病惡化，并對攝取了被污染的谷類產(chǎn)品的人和牲畜造成健康威脅。
早在1891年，小麥穗對鐮孢的顯著易感性就被Arthur注意到了(Parry等，1995)。Puge及其合作者(1933)報(bào)告說用培養(yǎng)的玫瑰色鐮孢(F.roseum)(大刀鐮孢)分生孢子接種過的小麥穗在從開花到蠟熟初期的20天期間是最易感的，這取決于品種。裂開的花藥和其他正在退化的組織似乎成為供菌絲增殖蔓延進(jìn)韌皮部并遍及穗的其他部分的疫源地。在組織學(xué)研究中，Puge注意到菌絲通常在細(xì)胞間侵入，但是能穿透小花的內(nèi)部薄壁。雖然禾谷鐮孢能在花的不同部分上移植生長，但在實(shí)驗(yàn)室和田間研究都證明感染的迅速傳播與突出的花藥的存在有關(guān)(Andersen 1948，McKay和Loughnane，1945)。花藥的水樣提取物被發(fā)現(xiàn)可以在體外刺激菌絲的生長(Strange和Smith 1971)，然而大分生孢子的萌發(fā)似乎不受影響(Strange和Smith，1978)。菌絲的生長刺激作用幾乎可以完全歸功于兩個(gè)季銨化合物甜菜堿和它的前體膽堿(Strange等，1974)。這些化合物存在于小花的其他器官，但是在花粉中最為豐富(Pearce等，1976)。甜菜堿——一種滲透性殺蟲劑，在干燥期間累積，越過了花粉發(fā)育的整個(gè)正常過程(見McCue和Hanson的綜述，1990)。它同膽堿一起被假定為禾谷鐮孢和其他的真菌病原體的碳和氮的一個(gè)偶然的來源?，F(xiàn)在還不清楚是否真菌菌絲可以很容易地接近花粉表面的這些化合物，或者一定要侵入花粉細(xì)胞質(zhì)才能接近它們。
如果要在明尼蘇達(dá)州，北達(dá)科他州和其他州繼續(xù)生產(chǎn)小麥和大麥，那么就必須鑒定出抗鐮孢性穗枯萎病的基因。那怕只把鐮孢感染降低10％，那么給糧食的生產(chǎn)者、加工者、以及最終給消費(fèi)者節(jié)約下來的經(jīng)濟(jì)效益預(yù)計(jì)可達(dá)到數(shù)百萬美元。研究人員已經(jīng)在小麥和其他的谷類作物的種質(zhì)中鑒別出抗瘡痂病的多基因座，但是目前，通過傳統(tǒng)育種方式在合適的作物品種中獲得的對病害的耐受程度是不足以控制病原體的。既然免耕農(nóng)業(yè)對水土保持有明顯的好處，而鐮孢在小麥產(chǎn)區(qū)又如此廣泛地存在，故而宿主抗性需要可替代的來源。
對這種病害沒有有效的控制措施。鐮孢性穗枯萎病的抗性基因還沒有從小麥、大麥或其他的有性兼容性植物品種中鑒別出來，這就限制了小麥育種專家發(fā)展抗性作物品種的努力。人們所需要是獲得抗鐮孢性穗枯萎病的作物品種的方法。真菌的葡聚糖酶和殼多糖酶的作用在包括鐮孢在內(nèi)的許多真菌中，葡聚糖和殼多糖是細(xì)胞壁的基本成分。鐮孢的外壁層是由β-1，3和β-1，6鍵連接的葡萄糖的聚合物(1，3/1，6-β-D-葡聚糖)組成的。最內(nèi)基底層主要是由殼多糖微絲——β-1，4-N-乙酰氨基葡萄糖的線性聚合物組成的，它占了菌絲壁質(zhì)量的三分之一(Barbosa和Kemmelmeier 1993)。鐮孢細(xì)胞壁似乎更能抵御水解酶的活性，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和殼多糖的含量很高(Sivan和Chet，1989a)，以及乙?；被咸烟菤埢木奂?Fukamizo等，1992)。
殼多糖酶和葡聚糖酶是由自然存在的細(xì)菌、真菌和植物制造出來的。在真菌中，這些蛋白質(zhì)分別在細(xì)胞壁的殼多糖和葡聚糖的自身水解中，以及其他微生物的細(xì)胞壁成分的水解中起作用(Srivastava等，1985；Sivan和Chet，1989b；Chérif和Benhamou，1990；V zquez-Garcidue as等，1998)。后者的特征被應(yīng)用到發(fā)現(xiàn)抗微生物的生物防治劑方面。殼多糖也在昆蟲的角皮和線蟲類的卵殼中被發(fā)現(xiàn)。對于能利用殼多糖作為碳源的真菌，殼多糖酶可能在真菌的新陳代謝中起作用(Flach等，1992)。內(nèi)切殼多糖酶在殼多糖聚合物里面隨機(jī)裂解C1和C4之間的化學(xué)鍵(Flach等，1992；Graham和Sticklen，1994)，而外切殼多糖酶連續(xù)地裂解每個(gè)化學(xué)鍵，從殼多糖聚合物的末端釋放出殼二糖。N-乙酰氨基葡萄糖糖苷酶也在末端裂解，釋放N-乙酰葡糖胺(Flach等，1992)。同樣，內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)地在葡聚糖聚合物里面裂解β-鍵，產(chǎn)生短寡糖，而外切葡聚糖酶從聚合物的非還原端裂解單個(gè)葡萄糖殘基(Vazquez-Garciduenas等1998)。真菌細(xì)胞壁葡聚糖層的水解應(yīng)歸功于內(nèi)外切葡聚糖酶的聯(lián)合作用。作為抗真菌蛋白質(zhì)的葡聚糖酶和殼多糖酶。
真菌細(xì)胞壁與眾不同的葡聚糖和殼多糖組成使得殼多糖酶和葡聚糖酶被廣泛用作抗真菌蛋白。植物產(chǎn)生的殼多糖酶和葡聚糖酶已經(jīng)被廣泛表征成與防御病原體和有害昆蟲有關(guān)的病理相關(guān)(Pr)蛋白質(zhì)。植物中的病理相關(guān)蛋白質(zhì)基因通過接觸微生物病原體和有害昆蟲而被誘生。人們根據(jù)細(xì)胞壁降解蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)特性將其分類。內(nèi)切和外切殼多糖酶似乎都在真菌細(xì)胞壁殼多糖的水解中起作用。I類殼多糖酶對細(xì)菌細(xì)胞壁有殼多糖裂解活性，并且已經(jīng)知道它是直接結(jié)合到殼多糖上的。相反地，II類殼多糖酶不對細(xì)菌細(xì)胞壁發(fā)生作用，也缺乏殼多糖結(jié)合活性；他們被假定在產(chǎn)生觸發(fā)宿主防御反應(yīng)的真菌誘生因子(elicitors)中起作用(Graham和Sticklen，1994；Fritig等，1998)。堿性殼多糖酶和葡聚糖酶(I類)通常蓄集在細(xì)胞內(nèi)的液泡中，而酸性同工型(II類)則位于細(xì)胞外，當(dāng)然也有一些例外(例如Wu等，1994；Graham和Sticklen，1994)。Cornelissen和同事(Sela-Buurlage等，1993)以及其他人(Graham和Sticklen，1994)觀察到I類殼多糖酶和葡聚糖酶比活性高于II類酶的比活性。I類殼多糖酶在大多數(shù)植物和真菌中是由小基因家族所編碼。各種不同的殼多糖酶的基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被綜述過了(Graham和Sticklen，1994)。
五類主要的β-葡聚糖酶中，只有β-1，3-葡聚糖酶顯示出抗真菌活性(Simmons，1994)。β-1，3-葡聚糖酶在植物中是小的多基因家族的成員(Payne等，1990；Xu等，1992；Beffa和Meins，1996；Simmons，1994)，但是在擬分枝孢鐮孢(Fusaium sporotrichioides)中是單拷貝基因(圖27)。I類葡聚糖酶蓄積在液泡中，而II類和III類葡聚糖酶是酸性的并位于細(xì)胞外(見Beffa和Meins，1996)。I類葡聚糖酶在下列植物的病原體防御和應(yīng)激反應(yīng)中已經(jīng)被廣泛地研究過了，這些植物有煙草(Linthorst等，1990；Linthorst，1991；Payne等，1990)、大麥(Jutidamrongphan等，1991；Xu等，1992；Malehorn等，1993)、小麥(Jutidamrongphan等，1991；Cruz-Ortega等，1997)和其他種類(Krishnaveni等，1999a；見Simmons的綜述，1994)。殼多糖酶和葡聚糖酶更偏愛作用在正在生長的真菌菌絲的尖端(例如，Broekaert等，1988；Collinge等1993)。殼多糖酶和β-1，3-葡聚糖酶都在植物發(fā)育期間(Lotan等，1989)以及應(yīng)對病原體攻擊時(shí)差異表達(dá)。葡聚糖酶似乎在植物的細(xì)胞分裂和花發(fā)育(Beffa和Meins，1996)以及應(yīng)激反應(yīng)(Simmons，1994)中起作用。殼多糖酶在植物發(fā)育中的作用還沒有被很好地描繪出來；然而它們都與胚胎發(fā)育和細(xì)胞分裂有關(guān)(參見Collinge等的綜述，1993)。
一些由自然發(fā)生的細(xì)菌和真菌所產(chǎn)生的殼多糖酶和β-1，3葡聚糖酶具有抗鐮孢特性(Mitchell和Alexander，1961；Michael和Nelson，1972；Cherif和Benhamou，1990)。植物來源的葡聚糖酶和殼多糖酶能降解分離的腐皮鐮孢(Fusarium solani)的細(xì)胞壁(Mauch等，1988)。來自煙草的殼多糖酶對尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)(Yun等，1996)和腐皮鐮孢(Sela-Buurlage等，1993)在培養(yǎng)中的生長有抑制作用。Krishnaveni等(1999b)描述了來自高粱種子的三種殼多糖酶抑制串珠鐮孢(F.moniliforme)的生長。殼多糖酶和葡聚糖酶在對抗真菌病原體中的協(xié)同作用已經(jīng)被廣泛地報(bào)導(dǎo)(參見Graham和Sticklen，1994以及Van Loon，1997的綜述)。例如，Mauch等(1988)觀察到來自豌豆的一種殼多糖酶和一種β-1，3-葡聚糖酶對真菌的抗菌譜很廣。Melchers等(1994)報(bào)告均來自煙草的一種V類內(nèi)切殼多糖酶加上一種I類β-1，3-葡聚糖酶可協(xié)同抑制腐皮鐮孢的生長。一種煙草酸性殼多糖酶和一種煙草β-1，3-葡聚糖酶在蕃茄中的表達(dá)賦予它對尖孢鐮孢的抗性，然而單獨(dú)表達(dá)時(shí)，每種蛋白質(zhì)的效果就要差很多(Jongedijk等.1995)。同樣地，當(dāng)一種稻堿性殼多糖酶和一種紫花苜蓿酸性β-1，3-葡聚糖酶在煙草中共同表達(dá)時(shí)，煙草尾孢(Cercospora nicotiana)真菌病原體就受到限制(Zhu等，1994)。一種大麥II類殼多糖酶和一種大麥II類β-1，3-葡聚糖酶的協(xié)同作用使煙草具有了對立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)的抗性(Jach等，1995)。這種殼多糖酶與一種大麥核糖體失活蛋白質(zhì)合并使用也可以抑制腐皮絲核菌感染。葡聚糖酶和殼多糖酶的顯著特異性雖然真菌和許多種(如果不是全部)植物表達(dá)葡聚糖酶和殼多糖酶，不是所有的酶對所有類型的微生物都具有相等的作用(Graham和Sticklen，1994；以及該文所列參考文獻(xiàn))。舉例來說，Broekaert和同事(1988)觀察到來自曼陀羅、煙草和小麥的殼多糖酶具有抗Trichoderma harzianum和布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanue)的抗真菌活性，但是沒有抗灰葡萄孢(Botrytis cinerea)活性。Mauch等(1988)報(bào)告了來自豌豆的一種殼多糖酶和一種葡聚糖酶對綠色木霉(T.viride)和腐皮鐮孢的作用是有差別的。聯(lián)合使用時(shí)，這兩種酶對其他真菌的抗菌譜很廣。有抗鐮孢和木霉活性的一種煙草殼多糖酶沒有抗黃曲霉(Aspergillus flavus)、Phytophthoraparasitica和其他病原體的活性(Yun等，1996)。殼多糖酶的差異活性可歸因于酶的內(nèi)在特性(Sela-Buurlage等，1993；Brunner等，1998)、真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不同(Sivan和Chet，1989a；Van Loon，1997)、或其他因素。其他的抗鐮孢蛋白質(zhì)在體外或在植物中有抗鐮孢活性的其他蛋白質(zhì)類型已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。Boyapati等(1994)報(bào)告了來自珍珠粟的一個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑抑制了在培養(yǎng)條件下串珠鐮孢的生長。來自鳳仙花(Impatiensbalsamina)種子的一個(gè)富半胱氨酸的多肽具有抗大刀鐮孢的活性(Tailor等，1997)。來自惜古比天蠶蛾的多肽殺菌肽A，是串珠鐮孢和尖孢鐮孢的有效抑制劑(deLucca等，1997；Cavallarin等，1998)。來自高粱種子的抗真菌蛋白質(zhì)具有抗串珠鐮孢的活性(Seetharaman等，1997)，病理相關(guān)蛋白質(zhì)PR4家族的兩種小麥種子蛋白質(zhì)可以抑制大刀鐮孢和禾谷鐮孢菌絲的生長(Caruso等，1996)。Hu和Reddy(1997)從鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)中分離出一個(gè)具有抗尖孢鐮孢活性的奇異果甜蛋白樣蛋白質(zhì)。來自大麥和玉米葉的非特異性脂類轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)對腐皮鐮孢具有抑制作用(Molina等，1993)。小麥嘌呤硫素與來自蘿卜或菜籽油菜的一個(gè)2S白蛋白聯(lián)合作用可以在體外有效抑制大刀鐮孢的生長(Terras等，1993)。作為植物中抗真菌轉(zhuǎn)基因的微生物基因大多數(shù)在體外和在植物中研究過的抗真菌基因都是植物來源的。就我們所知道的而言，有兩例來自真菌的基因表現(xiàn)出抗真菌活性。來自寄生菌類Trichoderma harzianum的內(nèi)切殼多糖酶賦予轉(zhuǎn)基因煙草抗鏈格孢(Alternaria alternata)和灰葡萄孢的活性，賦予轉(zhuǎn)基因馬鈴薯抗A.solani和立枯絲核菌的活性(Lorito等，1998)。通過轉(zhuǎn)入一個(gè)來自Rhizopus oligosporus的殼多糖酶基因，Terakawa等(1997)觀察到了轉(zhuǎn)基因煙草對核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)和灰葡萄孢的防護(hù)作用。當(dāng)來自粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的一個(gè)殼多糖酶在煙草中表達(dá)時(shí)，顯示出它具有抗真菌活性(Suslow等，1988)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及來自鐮孢真菌基因的編碼具有細(xì)胞壁降解活性的多肽的核酸序列，以及具有細(xì)胞壁降解活性的分離的多肽。本發(fā)明也涉及含有該核酸序列的重組核酸分子、載體和宿主細(xì)胞，以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法，包括在植物細(xì)胞中表達(dá)以賦予或提高植物對鐮孢和其他病原體的抗性。
更具體的是，本發(fā)明提供編碼具有細(xì)胞壁降解活性(包含葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶活性)的多肽的分離的核酸分子。編碼葡聚糖酶和外切殼多糖酶的基因組序列和編碼葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶的cDNA序列明確地示例于此。包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的有編碼具有在下文示例的葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶多肽序列的多肽的核酸序列、以及編碼具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的核酸分子。
包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)的核酸序列還有那些能與一種酶編碼序列或它的互補(bǔ)體在中度或高度嚴(yán)格條件下進(jìn)行特異性雜交、并編碼具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列。
與下列詳細(xì)描述的示例葡聚糖酶序列有至少70％序列同一性、并編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。編碼與下列詳細(xì)描述的示例葡聚糖酶多肽序列有至少80％序列同一性的多肽、并編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
與下列詳細(xì)描述的示例內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶序列有至少75％序列同一性、并編碼具有內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。編碼與下列詳細(xì)描述的示例內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶多肽序列有至少85％序列同一性的多肽、并編碼具有內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明也涉及具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的分離的多肽。本發(fā)明包括具有與下列詳細(xì)描述的示例葡聚糖酶多肽序列有至少80％序列同一性的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明也包括具有與下列詳細(xì)描述的示例內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶多肽序列有至少85％序列同一性的氨基酸序列的多肽。由在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列詳細(xì)描述的示例核酸序列進(jìn)行雜交的核酸序列所編碼的多肽也包含在本發(fā)明中。該多肽的變體以及具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的片段也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)和使用本發(fā)明的多肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面是提供含有編碼具真菌細(xì)胞壁降解活性(包含葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性)的多肽的序列的重組核酸分子。這些分子，舉例來說包括重組載體例如包含編碼葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶DNA序列的克隆、表達(dá)或轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供被上述的載體或DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)具體用途是提供被一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明更具體的一種用途是提供被一個(gè)或多個(gè)編碼具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶編碼活性的多肽的核酸序列轉(zhuǎn)化的植物、植物種子或植物細(xì)胞，以提供具有對植物病原體，包括真菌，特別是鐮孢屬種的抗性的植物，或提供對植物病原體的抗性增強(qiáng)的植物。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面是提供能夠在鐮孢屬真菌中檢測葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶基因或其功能性等價(jià)物的寡核苷酸探針，以及該探針在分離編碼葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶基因或其功能性等價(jià)物的核酸序列中的用途。能夠與該探針進(jìn)行特異性雜交并編碼功能性葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
使用本發(fā)明的核酸序列將使得從真菌中分離同源基因，以獲得能夠保護(hù)包括真菌、細(xì)菌和植物在內(nèi)的宿主細(xì)胞的基因以對抗相關(guān)的真菌病原體變得更加容易。
本發(fā)明也包括互相聯(lián)合的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的應(yīng)用，也就是說，葡聚糖酶和內(nèi)切殼多糖酶；葡聚糖酶和外切殼多糖酶；內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶；以及葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶的聯(lián)合應(yīng)用。攜帶了任何組合的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因單子葉或雙子葉植物系、植物細(xì)胞、以及通過有性或無性繁殖獲得的后代都包含在本發(fā)明中。
根據(jù)這個(gè)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼從葡聚糖酶、外切殼多糖酶和內(nèi)切殼多糖酶中選擇的真菌細(xì)胞壁降解酶的核酸序列；具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的分離的多肽；包括編碼具有細(xì)胞壁降解活性的多肽的表達(dá)載體在內(nèi)的重組核酸分子；以及攜帶重組核酸分子或表達(dá)載體的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有降解細(xì)胞壁的重組分子的轉(zhuǎn)化載體，而這種載體是可以有效地將重組分子穩(wěn)定導(dǎo)入植物體內(nèi)的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供生產(chǎn)和使用具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供具有細(xì)菌或真菌抗性的轉(zhuǎn)基因植物，其中抗性是本發(fā)明的重組核酸分子表達(dá)的結(jié)果。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)目的是提供產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶的真菌基因，這些細(xì)胞壁降解酶包括能夠降解F.venenatum和其他鐮孢屬種(包括美國的穗枯萎病(瘡痂病)的主要致病因子禾谷鐮孢和大刀鐮孢)細(xì)胞壁的葡聚糖和殼多糖成分的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是在轉(zhuǎn)基因單子葉植物，包括小麥、大麥或燕麥中表達(dá)細(xì)胞壁降解酶，賦予小麥和其他的谷類作物對鐮孢屬種和/或其他真菌病原體的部份或者全部抗性。這樣的轉(zhuǎn)基因系將會是產(chǎn)生改良的農(nóng)作物的有用的遺傳原種。
本發(fā)明的更進(jìn)一步的目的是提供表達(dá)被設(shè)計(jì)好了的基因的新小麥種質(zhì)，該基因的設(shè)計(jì)目地是限制致病性鐮孢類真菌的傳播，并間接地減少脫氧瓜蔞鐮菌醇在受感染的穗上的蓄積。
本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將會在隨后的描述中展示出來。
附圖簡述


圖1是由F.venenatum cDNA(上)和擬分枝孢鐮孢(F.sporotrichiorides)基因組DNA(下)編碼的葡聚糖酶之間的一個(gè)比較(分別是SEQ ID NOS5和4)。
圖2顯示的是F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶5’cDNA PCR產(chǎn)物和推導(dǎo)出的多肽序列(分別是SEQ ID NOS6和7)。粗體字顯示的是從5’PCR產(chǎn)物中獲得的新序列。非粗體字顯示的是與F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶部分cDNA序列匹配的F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶5’cDNA序列部分。
圖3顯示的是擬分枝孢鐮孢外切殼多糖酶5’基因組PCR產(chǎn)物和推導(dǎo)出的多肽序列的一部分(分別是SEQ ID NOS8和9)，下劃線區(qū)段表示內(nèi)含子。在ATG(第一個(gè)甲硫氨酸)之前的核苷酸區(qū)段是啟動子和5’非翻譯區(qū)。粗體字顯示的是從5’PCR產(chǎn)物獲得的新序列。非粗體字顯示的是與F.Venenatum外切殼多糖酶cDNA序列匹配的擬分枝孢鐮孢基因組序列部分。
圖4顯示的是由F.venenatum cDNA(上)和擬分枝孢鐮孢基因組DNA(下)編碼的外切殼多糖酶之間的比較(分別是SEQ ID NOS14和15)。
圖5舉例說明對遍在蛋白-1啟動子的修飾。
圖6顯示的是FvGluS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在有義方向上含有被修飾過的全長葡聚糖酶cDNA。
圖7顯示的是FvGluAS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在反義方向上含有被修飾過的全長葡聚糖酶cDNA。
圖8顯示的是FvEndoS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在有義方向上含有被修飾過的全長內(nèi)切殼多糖酶cDNA。
圖9顯示的是FvEndoAS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在反義方向上含有被修飾過的全長內(nèi)切殼多糖酶cDNA。
圖10顯示的是FvExoS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在有義方向上含有被修飾過的全長外切殼多糖酶cDNA。
圖11顯示的是FvExoAS質(zhì)粒圖；它是單子葉植物表達(dá)載體，在反義方向上含有被修飾過的全長外切殼多糖酶cDNA。
圖12顯示的是對轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行的穩(wěn)定整合轉(zhuǎn)基因DNA的PCR分析。UT表示未轉(zhuǎn)化的植物；T1-T3表示被轉(zhuǎn)化了的植物；C表示質(zhì)粒(結(jié)構(gòu))對照；mw表示100bp的序列梯。
圖13顯示的是在普通小麥(Triticum aestivum)品系A(chǔ)B8-108中的FvEndo mRNA的Northern印跡。
圖14顯示的是使用RT-PCR方法在普通小麥的胚乳和穎片中檢測葡聚糖酶轉(zhuǎn)錄本的5’部分。
圖15顯示的是使用RT-PCR方法在普通小麥的胚乳和穎片中檢測內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶轉(zhuǎn)錄體的5’和3’部分。
圖16顯示的是使用限制性核酸內(nèi)切酶鑒定內(nèi)切殼多糖酶5’RT-PCR產(chǎn)物。
圖17顯示的是使用限制性核酸內(nèi)切酶鑒定外切殼多糖酶5’RT-PCR產(chǎn)物。
圖18表明FvEndo的5’和3’RT-PCR產(chǎn)物是cNDA依賴的。
圖19表明FvExo的5’和3’RT-PCR產(chǎn)物是cDNA依賴的。
圖20顯示的是F.venenatum基因組DNA與FvGlu、FvEndo、FvExo cDNAs雜交的Southern印跡。序列簡述SEQ ID NO1是F.venenatum葡聚糖酶未經(jīng)修飾的全長cDNA序列。
SEQ ID NO2是被SEQ ID NO1編碼的葡聚糖酶。
SEQ ID NO3是含有擬分枝孢鐮孢葡聚糖酶基因的基因組DNA片段。
SEQ ID NO4是由SEQ ID NO3編碼的葡聚糖酶序列。
SEQ ID NO5是由F.venenatum cDNA序列編碼的葡聚糖酶。
SEQ ID NO6是F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶5’cDNA的PCR產(chǎn)物。
SEQ ID NO7是由SEQ ID NO6編碼的多肽。
SEQ ID NO8是擬分枝孢鐮孢外切殼多糖酶5’基因組PCR產(chǎn)物。
SEQ ID NO9是SEQ ID NOS8編碼的多肽序列的一個(gè)部分。
SEQ ID NO10是F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶未經(jīng)修飾的全長cDNA序列。
SEQ ID NO11是由SEQ ID NO10編碼的內(nèi)切殼多糖酶。
SEQ ID NO12是擬分枝孢鐮孢-F.venenatum嵌合序列。
SEQ ID NO13是由SEQ ID NO12編碼的外切殼多糖酶。
SEQ ID NO14含有由F.venenatum cDNA編碼的外切殼多糖酶的1到249位氨基酸。
SEQ ID NO15含有擬分枝孢鐮孢基因組DNA的1到249位氨基酸。
SEQ ID NO16是F.venenatum葡聚糖酶修飾過的全長cDNA序列。
SEQ ID NO17是由SEQ ID NO16編碼的葡聚糖酶。
SEQ ID NO18是F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶修飾過的全長cDNA序列。
SEQ ID NO19是由SEQ ID NO18編碼的內(nèi)切殼多糖酶。
SEQ ID NO20是F.venenatum外切殼多糖酶修飾過的全長cDNA序列。
SEQ ID NO21是由SEQ ID NO20編碼的外切殼多糖酶。
SEQ ID NO22-24是在圖5中顯示的(分別是上、中、下)、天然的遍在蛋白-1以及修飾過的遍在蛋白-1序列。
SEQ ID NO25是一個(gè)前導(dǎo)序列。
SEQ ID NO26是引物M13F。
SEQ ID NO27是引物M13R。
SEQ ID NOS28-74是在表2中顯示的引物。
SEQ ID NOS75-82是在表3中顯示的PCR引物。
定義除非另外下定義，否則在此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所普遍理解的意義。下列參考文獻(xiàn)給技術(shù)人員提供了在本發(fā)明中使用的許多術(shù)語的一般性定義Singleton等，微生物學(xué)及分子生物學(xué)辭典(Dictionary of Microbiology andMolecular Biology)(第二版，1994)；劍橋科技辭典(The CambridgeDictionary of Science and Technology)(Walker編輯，1988)；遺傳學(xué)詞匯(The Glossary of Genetics)，第五版，Rieger，R等(編輯)，Springer Verlag(1991)；和Hale & Marham，HARPER COLLINS生物學(xué)辭典(The Harper Collins Dictionary of Biology)(1991)。
為了使本發(fā)明更容易被理解，許多術(shù)語被定義如下“葡聚糖酶”指的是一種對葡聚糖，一種真菌細(xì)胞壁成分，具有水解活性的蛋白質(zhì)或多肽。葡聚糖酶特別指的是一種具有降解葡聚糖的β-1，3鍵的酶活性的多肽。
術(shù)語“葡聚糖酶活性”在此被定義為催化葡聚糖的β-1，3鍵降解的水解活性。根據(jù)已經(jīng)公開的方法，可以通過將一種合適的底物(例如葡聚糖，昆布多糖)加入細(xì)胞提取物如小麥胚乳組織、葉組織提取物中來測量葡聚糖酶活性。Keen和Yoshikawa(1983)以及Fontaine等(1997)的文章中描述了測定方法。
“殼多糖酶”指的是對殼多糖具有水解活性的蛋白質(zhì)或多肽。殼多糖是一種主要由N-乙酰-氨基葡萄糖所組成的高分子，并在真菌的菌絲和孢子的細(xì)胞壁中被發(fā)現(xiàn)。
“內(nèi)切殼多糖酶”指的是通過在殼多糖聚合物的C1和C4鍵之間隨機(jī)裂解而酶促降解殼多糖的蛋白質(zhì)或多肽。
術(shù)語“內(nèi)切殼多糖酶活性”在此被定義為通過在殼多糖聚合物的C1和C4鍵之間隨機(jī)裂解而降解殼多糖的能力。
“外切殼多糖酶”指的是通過從殼多糖聚合物的末端順序地裂解每個(gè)C1和C4鍵而酶促降解殼多糖的蛋白質(zhì)或多肽。
術(shù)語“外切殼多糖酶活性”在此被定義為通過從殼多糖聚合物的末端順序地裂解每個(gè)C1和C4鍵而降解殼多糖的能力。
根據(jù)已經(jīng)公開發(fā)表的方法，殼多糖酶(內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶)的活性可以通過將一種合適的底物加入到細(xì)胞提取物如小麥胚乳組織、葉組織提取物中而測量出來。測定方法在下列文獻(xiàn)中有描述Harman等(1993)、McCreath和Gooday(1992)、Tronsmo和Harman(1993)、Bolar等(2000)、以及美國專利5,378,821號。
用在細(xì)胞上的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”指的是包含了轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，或者是其基因組已經(jīng)被導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因所改變的細(xì)胞。用在組織或植物上的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”分別指的是包含了一個(gè)或多個(gè)含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞，或者一個(gè)或多個(gè)其基因組已經(jīng)被導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因所改變的細(xì)胞的組織或植物。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織和植物可以通過幾種方法產(chǎn)生出來，包括將含有核酸(通常是DNA)的“轉(zhuǎn)基因”導(dǎo)入靶細(xì)胞；或者通過人工干預(yù)方法——例如在此描述的方法，將“轉(zhuǎn)基因”整合進(jìn)靶細(xì)胞的染色體內(nèi)。
在此使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指的是經(jīng)由實(shí)驗(yàn)操作被導(dǎo)入細(xì)胞基因組中的任意核酸序列。轉(zhuǎn)基因可能是“天然DNA序列”或“異源DNA序列”(也就是“外源DNA”)。術(shù)語“天然DNA序列”指的是被導(dǎo)入的細(xì)胞中天然存在的核苷酸序列，只要它與天然產(chǎn)生的序列相比，不包含某些修飾(例如點(diǎn)突變、存在選擇性標(biāo)記基因，等等)。
術(shù)語“異源DNA序列”指的是連接到、或被操縱連接到其天然不與之相連的、或其天然在不同的位置與之相連的核酸序列上的核苷酸序列。異源DNA對于其導(dǎo)入的細(xì)胞而言，不是內(nèi)生的，而是從另外的細(xì)胞中獲得的。異源DNA也包括含有一些修飾作用的天然DNA序列。一般來說，對那些表達(dá)異源DNA的細(xì)胞而言，異源DNA編碼的RNA和蛋白質(zhì)是它正常不能制造的，雖然這不是必然的情況。異源DNA的實(shí)例包括報(bào)道基因、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、選擇性標(biāo)記蛋白(例如賦予藥物抗性的蛋白質(zhì))，等等。
在此處使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指的是將轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞中。細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以是穩(wěn)定的或瞬時(shí)的。
術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”指的是將一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因?qū)牒驼系郊?xì)胞的基因組中。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可以通過將細(xì)胞基因組DNA與能結(jié)合一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因的核酸序列進(jìn)行Southern印跡雜交而檢測出來。植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化也可以通過使用聚合酶鏈反應(yīng)從此植物后代的細(xì)胞的基因組DNA中擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因序列而檢測出來。術(shù)語“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體”指的是已經(jīng)將一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因整合進(jìn)基因組DNA中的細(xì)胞。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體與瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體是有區(qū)別的，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株的基因組DNA中含有一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)基因，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體的基因組DNA不包含轉(zhuǎn)基因。
當(dāng)術(shù)語“分離的”被關(guān)聯(lián)到核酸分子，比如在“分離的核酸序列”中使用的時(shí)候，它指的是從其天然來源中與之相關(guān)的至少一種核酸污染物中鑒別和分開出來的核酸序列。分離的核酸以一種與其天然存在的不同形式或定位而存在。分離的核酸序列可能以單鏈或雙鏈的形式存在。當(dāng)一種分離的核酸序列將被用于表達(dá)蛋白質(zhì)的時(shí)候，該核酸序列將會至少包括有義鏈或編碼鏈的至少一部分(也就是說該核酸序列可以是單鏈)。或者它也可以同時(shí)包含有義鏈和反義鏈(也就是說該核酸序列可以是雙鏈)。
用來分離和克隆編碼多肽的核酸序列的技術(shù)，包括從基因組DNA中分離、自cDNA中制備、或其組合的技術(shù)，在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知。從這樣的基因組DNA中克隆本發(fā)明的核酸序列可以這樣實(shí)施，舉例來說，通過使用廣為人知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫抗體篩選技術(shù)來檢測具有相同結(jié)構(gòu)特征的克隆化DNA片段。參見例如Innis等，1990，PCR方法和應(yīng)用指南(PCRA Guide to Methods andApplication)，學(xué)術(shù)出版社，紐約。也可以使用其他核酸擴(kuò)增程序，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和以核酸序列為基礎(chǔ)的擴(kuò)增反應(yīng)(NASBA)。核酸序列可以是從鐮孢屬菌株，或另外的生物體或相關(guān)的生物體中擴(kuò)增出來的，因此，舉例來說，它可以是該核酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因或種變異體。
在此使用的術(shù)語“純化的”指的是分子，核酸序列或氨基酸序列，是從其自然環(huán)境中被遷移、分離或分開的。因此，“分離的核酸序列”是純化的核酸序列?！按篌w上純化的”分子的純度至少約為20％，優(yōu)選純度至少約為40％，更優(yōu)選純度至少約為60％，甚至更優(yōu)選純度至少約為80％，最優(yōu)選純度至少約為90％或95％。純度可以由瓊脂糖電泳測定。舉例來說，分離的核酸序列可以通過在遺傳工程中使用的標(biāo)準(zhǔn)克隆程序而獲得，以將該核酸序列從它的自然位置重新定位到一個(gè)不同的位點(diǎn)，它將會在那里被復(fù)制?？寺〔襟E可能包括剪切和分離含有編碼多肽的核酸序列的所需要的核酸片段、將該片段插入載體分子中、和將該重組載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞，該核酸序列的多個(gè)拷貝或克隆將會在那里被復(fù)制。該核酸序列可能是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源的，或它們的任何組合。
正如在本領(lǐng)域已知的那樣，術(shù)語“同一性”是指在兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間存在的關(guān)聯(lián)，它是由序列之間的比較所確定的。在本領(lǐng)域，“同一性”也意味著多肽序列或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)度，它是由這些序列的字符串之間的匹配所決定的。“同一性”可以用已知的方法很容易地計(jì)算出來，這些方法包括但并不限于在下列文獻(xiàn)中描述過的方法生物計(jì)算信息學(xué)和基因組方案(BiocomputingInformatics and Genome Projects)，Smith，D.W.編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，編輯，Humana出版社，新澤西州，1994；以及分子生物學(xué)中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，學(xué)術(shù)出版社，1987。確定同一性的優(yōu)選方法是設(shè)計(jì)得出在被測試序列之間的最大匹配。確定同一性和相似性的方法已經(jīng)被編成可公開獲取的計(jì)算機(jī)程序。在兩序列之間確定同一性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括但并不限于GCG程序包(Devereux，J.等，核酸研究(Nucleic Acids Research)12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215403-410(1990)。BLAST X程序可公開獲取自NCBI和其他來源(BLAST手冊，Altschul，S.等，NCBI NLM NIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)和Altschul等，Gapped BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索程序。核酸研究(Nucleic Acid Res)253389-3402(1997))、ALIGN(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/seq-search/alignment.html)、和ClustalW(http//dot.imgen.bcm.edu9331/cgi-bin/multi-align/multi-align.pl)(Higgens，1989)“序列同一性的百分率”可以通過將兩種最佳比對的序列在比較窗口上進(jìn)行比較而確定，其中對兩種序列的最佳比對而言，與參考序列(不含添加或缺失)相比，多核苷酸序列或多肽序列部分在比較窗口上可能會含有添加或缺失(也就是裂隙)。百分率這樣計(jì)算出來的通過測定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，得出匹配位置的數(shù)目，將匹配位置數(shù)除以在比較窗口中的位置的總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，就得出了序列同一性的百分率。優(yōu)選比較窗口至少是編碼序列的50％，優(yōu)選60％，更優(yōu)選75％或85％，甚至更優(yōu)選95％到100％.
在此使用的術(shù)語“雜交”包括“核酸鏈通過堿基配對結(jié)合到互補(bǔ)鏈上的任何過程”[Coombs.J(1994)生物技術(shù)辭典(Dictionary ofBiotechnology)，Stockton出版社，紐約，紐約州]。雜交和雜交強(qiáng)度(也就是核酸之間結(jié)合的強(qiáng)度)是受這些因素影響的比如核酸之間的互補(bǔ)程度，所涉及的條件的嚴(yán)格程度，所形成的雜交體的Tm值，和核酸里面的G∶C比值。
術(shù)語“嚴(yán)格條件下的雜交”指的是從兩條單鏈核酸形成一條雙鏈體。雙鏈區(qū)可能包括一條或兩條單鏈核酸全長，或一條單鏈核酸的全長和另一條單鏈核酸的子序列，或雙鏈區(qū)可能包括每條單鏈核酸的子序列。
從不同的屬或種的株系識別和克隆編碼具有所需酶活性的多肽的DNA的核酸探針可以依照在本領(lǐng)域廣為人知的方法來制備。這樣的探針可以用于按標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序與感興趣的種或?qū)俚幕蚪M或cDNA進(jìn)行雜交，以識別和分離其中相應(yīng)的基因。DNA和RNA探針都可以使用。典型地探針被標(biāo)記以檢測相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S，生物素或抗生物素蛋白質(zhì)標(biāo)記)。
對于長度至少為100個(gè)核苷酸的長探針，要使用高度或中度嚴(yán)格條件。當(dāng)使用的探針長度為約100到大約1000個(gè)核苷酸時(shí)，所使用的與核酸雜交有關(guān)的高度嚴(yán)格條件包括與下列條件等同的條件在由5×SSPE，1％SDS，5×Denhard’s試劑，100μg/ml變性鮭精DNA組成的溶液中進(jìn)行結(jié)合或雜交，雜交溫度為68℃；繼而在含有0.1×SSPE、0.1％ SDS的溶液中洗滌，洗滌溫度為68℃，或者在前述條件中還含有50％甲酰胺時(shí)，可在42℃進(jìn)行雜交和洗滌。高度嚴(yán)格洗滌條件可以包括0.1×SSC到0.2XSSC，1％ SDS，65℃，15-20分鐘。這樣的核酸Southern印跡的嚴(yán)格洗滌條件的一個(gè)實(shí)例是0.2×SSC，65℃洗滌15分鐘(參見Sambrook等，分子克隆-實(shí)驗(yàn)室指南(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第二版)，1-3卷，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港出版社，紐約，1989，關(guān)于SSC緩沖液的描述)。其他示例性高度嚴(yán)格雜交條件包括例如，7％ SDS，0.25M磷酸鈉緩沖液，PH值7.0-7.2，0.25M氯化鈉，溫度65℃-68℃，或在前述的條件中還含有50％甲酰胺時(shí)，可在42℃進(jìn)行。示例性中度嚴(yán)格條件與上述高度嚴(yán)格條件基本一致，除了在42℃使用35％的甲酰胺，以及在55℃進(jìn)行洗滌。
對于長度是大約15個(gè)核苷酸到大約70個(gè)核苷酸的短探針，嚴(yán)格條件被定義為按標(biāo)準(zhǔn)Southern印跡程序，預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌在含有0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl，pH 7.6，6mM EDTA，0.5％ NP-40，1×Denhardt’s溶液，1mM焦磷酸鈉，1mM磷酸二氫鈉(Sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP，和每毫升0.2克酵母RNA的溶液中進(jìn)行，溫度比依照Bolton和McCarthy(1962，美國國家科學(xué)院研究進(jìn)展(Proceeding’s of the National Academy ofSciences USA)481390)的計(jì)算方法得出的Tm值低大約5℃到大約10℃。
對于長度是大約15個(gè)核苷酸到大約70個(gè)核苷酸的短探針，固定了DNA的實(shí)驗(yàn)材料要用6×SCC加0.1％ SDS的溶液洗滌一次，共15分鐘，用6×SSC洗滌兩次，每次15分鐘，洗滌溫度比計(jì)算出的Tm值低5℃到10℃。
從其他的生物體制備的基因組DNA或cDNA文庫可以被用來從中篩選能與上述的探針雜交的、編碼具有所需要的酶活性的多肽的DNA。來自這樣的其他生物體的基因組DNA或其他的DNA可以被瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他的分離技術(shù)所分離。來自文庫的DNA或被分離的DNA可以被轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他的合適材料上。為了識別與所選擇的序列或其子序列同源的克隆或DNA，固定了DNA的材料被用來作Southern印跡。就本發(fā)明而言，雜交是指核酸序列在中度到高度嚴(yán)格條件下與相應(yīng)于所選核酸序列、它的互補(bǔ)鏈、或其子序列的標(biāo)記核酸探針雜交。在這些條件下與核酸探針雜交的分子使用x光片檢測。
術(shù)語“核酸結(jié)構(gòu)”指的是單鏈或雙鏈核酸分子，它是從自然產(chǎn)生的基因中分離的，或者它已經(jīng)被修飾過而含有以自然界中并不存在的方式組合和并列的核酸區(qū)段。核酸結(jié)構(gòu)可包括例如本發(fā)明的編碼序列、調(diào)控序列例如啟動子序列，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。當(dāng)核酸結(jié)構(gòu)包含本發(fā)明編碼序列的表達(dá)所必需的所有調(diào)控序列的時(shí)候，術(shù)語核酸結(jié)構(gòu)與術(shù)語表達(dá)盒是同義的。示例的結(jié)構(gòu)包括質(zhì)粒和載體，包括克隆載體、重組表達(dá)載體?！拜d體”是一種核酸構(gòu)造，它能轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、或者感染細(xì)胞并通常在細(xì)胞中復(fù)制，借此使得該細(xì)胞表達(dá)載體所編碼的核酸和任選的蛋白質(zhì)，其對細(xì)胞來說是非天然的、或在表達(dá)方式上并非天然的。載體包含待由細(xì)胞表達(dá)的核酸(通常是RNA或DNA)。載體可以任選包括協(xié)助核酸進(jìn)入細(xì)胞的材料，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)包被物或類似物質(zhì)。載體含有在細(xì)菌或其他的非植物生物體中允許其增殖和選擇的核酸序列。關(guān)于載體和分子生物學(xué)技術(shù)的描述，參見分子生物學(xué)當(dāng)代方法(Current Protocolsof Molecular Biology)，Ausubel等，(編輯)，通用程序，Greene聯(lián)合出版公司與John Wiley & Sons公司聯(lián)合企業(yè)(包括1998年增刊的全部刊物)(Ausubel)。
術(shù)語“編碼序列”在此被定義為直接規(guī)定它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列的核酸序列，例如被轉(zhuǎn)錄成mRNA并且翻譯成多肽的一段序列。編碼序列的分界線通常是由ATG起始密碼子(真核生物)和翻譯終止子(終止密碼子)所決定。編碼序列可包括但并不限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
術(shù)語“有義方向”指的是與結(jié)構(gòu)中的啟動子有關(guān)的cDNA序列或編碼序列的方向，即cDNA序列或編碼序列的5’端是與啟動子毗連的。術(shù)語 “反義”(或反向)指的是與結(jié)構(gòu)中的啟動子有關(guān)的核酸序列例如cDNA或編碼序列的方向，即序列的3’端是與啟動子毗連的。
術(shù)語“調(diào)控序列”被定義為包括所有對多肽的表達(dá)是必需的或有利的成分。這樣的調(diào)控序列包括但并不限于前導(dǎo)序列，多肽序列，啟動子，信號肽序列或靶向序列，增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。調(diào)控序列最少包括啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子序列?；蚧蚝怂峤Y(jié)構(gòu)中包含5’前導(dǎo)序列的部分，因?yàn)樗苡绊懛g的效力，也可以被視為調(diào)控序列，其中5’前導(dǎo)序列通常是緊接著ATG起始密碼子上游的、長度為5到15個(gè)核苷酸的序列。調(diào)控序列可能提供有為了引進(jìn)特有的限制性酶切位點(diǎn)而設(shè)置的接頭，以便使調(diào)控序列與核酸序列編碼多肽的編碼序列的連接變得更加容易。術(shù)語“可操作地連接的”在此被定義為一種構(gòu)型，其中的調(diào)控序列被置于與核酸序列的編碼序列有關(guān)的位置，以便調(diào)控序列指導(dǎo)信使RNA和/或多肽的制造。
在此處使用的術(shù)語“啟動子”、“啟動子元件”或“啟動子序列”指的是DNA序列，當(dāng)它被連接到感興趣的核苷酸序列上的時(shí)候，它能夠調(diào)控感興趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA。啟動子典型地，雖然不是必然地，位于mRNA的轉(zhuǎn)錄受其調(diào)控的、感興趣的核苷酸序列的5’端(也就是上游)，并且為啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶和其他的轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合提供位點(diǎn)。當(dāng)結(jié)合了啟動子序列的RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后后者又翻譯為被編碼序列所編碼的蛋白質(zhì)的時(shí)候，這段DNA序列就與啟動子在細(xì)胞中“有效聯(lián)合”了。
調(diào)控序列也可能是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，它是被宿主細(xì)胞所識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列可操作地連接在編碼多肽的核酸序列的3’端。
調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，即mRNA上的一段非翻譯區(qū)，它對宿主細(xì)胞的翻譯有重要作用。前導(dǎo)序列可操作地連接在編碼多肽的核酸序列的5’端。
調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，即一段可操作地連接在核酸序列的3’端的序列，當(dāng)轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，它被宿主細(xì)胞識別為在轉(zhuǎn)錄出的mRNA上加聚腺苷酸殘基的信號。
調(diào)控序列也可以是編碼連接到多肽的氨基末端的氨基酸序列、并指導(dǎo)被編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑的信號肽編碼區(qū)。核酸序列的編碼序列的5’端可能天然地包含在翻譯讀碼框架中與編碼分泌性多肽的編碼區(qū)天然地連接的信號肽編碼區(qū)?；蛘呔幋a序列的5’端可能包含對編碼序列而言是外源序列的信號肽編碼區(qū)。當(dāng)編碼序列并沒有天然地包含信號肽編碼區(qū)的時(shí)候，就可能需要外源的信號肽編碼區(qū)?；蛘咄庠吹男盘栯木幋a區(qū)可能簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以便提高多肽的分泌。
調(diào)控序列也可能是編碼連接到多肽羧基端的氨基酸序列并指導(dǎo)被編碼的多肽在細(xì)胞中特異性定位的定位肽。
反義技術(shù)包含克隆區(qū)核酸片段并將它與啟動子有效地連接，以使得反義的(或互補(bǔ)的)RNA鏈將被轉(zhuǎn)錄。這種結(jié)構(gòu)然后被轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞并產(chǎn)生反義RNA鏈。
術(shù)語“表達(dá)載體”指的是含有核酸結(jié)構(gòu)以及那些將其遞送進(jìn)微生物宿主細(xì)胞并在其中自主復(fù)制的序列的載體。上述的各種不同的核酸和調(diào)控序列可能被結(jié)合在一起而產(chǎn)生重組表達(dá)載體，該載體可能包括一個(gè)或更多個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，在這樣的位點(diǎn)允許插入或替換編碼多肽的核酸序列。或者，本發(fā)明的核酸序列可以通過將該核酸序列或包含該序列的核酸結(jié)構(gòu)插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列可以在載體上定位，以使得該編碼序列能夠可操作性地與適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列連接以便表達(dá)。
為了合成基本上類似于本發(fā)明多肽的多肽，對編碼該多肽的核酸序列進(jìn)行修飾可能是必須的。對多肽而言，術(shù)語“基本上類似于”指的是該多肽的非天然產(chǎn)生的形式。這些多肽可能以某種改造的方式與從其天然來源中分離的多肽有差別，例如在比活性、溫度穩(wěn)定性、最適PH值、亞細(xì)胞定位或類似性質(zhì)上有差別的變體。變體序列可能以表現(xiàn)為示例序列的多肽編碼部分或其子序列的核酸序列為基礎(chǔ)而構(gòu)建；和/或通過引入核苷酸替代而構(gòu)建，該核苷酸替代的引入并不導(dǎo)致產(chǎn)生由該核酸序列編碼的多肽的另外一個(gè)氨基酸序列，但卻符合用于該酶生產(chǎn)的宿主生物體的密碼子選擇；或通過導(dǎo)入可能導(dǎo)致另外一個(gè)氨基酸序列的核苷酸替代而構(gòu)建。核苷酸替代的一般性描述，可參見例如Ford等，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)和純化(Protein Expression and Purification)295-107。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，明了的是，這種替代可以在對分子功能有關(guān)鍵性影響的區(qū)域以外進(jìn)行，并依然可以產(chǎn)生有活性的多肽。對由本發(fā)明的分離的核酸序列所編碼的多肽的活性來說是必需的、因此優(yōu)選不進(jìn)行替代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序識別出來，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(舉例來說，見Cunninghan和Well，1989，科學(xué)(Science)2441081-1085)。在后者的技術(shù)中，突變被引進(jìn)分子中每一個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基處，得到的突變分子進(jìn)行酶活性測試以識別對分子活性有關(guān)鍵作用的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過分析三維結(jié)構(gòu)而確定，三維結(jié)構(gòu)是通過例如核磁共振分析，結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)而確定的(舉例來說，見de Vos等，1992，科學(xué)255306-312；Smith，1992，分子生物學(xué)雜志(Journal of Molecular Biology)，224899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBS Letter 30959-64)。
術(shù)語“宿主細(xì)胞”是已經(jīng)被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或能夠被外源多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可能是單細(xì)胞微生物，例如原核生物細(xì)胞，或非單細(xì)胞微生物，例如真核細(xì)胞。真核細(xì)胞可以包括任何的細(xì)胞，例如來自昆蟲、真菌或植物的細(xì)胞。宿主細(xì)胞的實(shí)例、將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法以及克隆方法在美國專利5,374,540號中有描述，它也由此被列入為參考文獻(xiàn)。
植物宿主細(xì)胞包括但并不限于體細(xì)胞，配子或胚胎?！芭咛ァ敝傅氖情_始發(fā)芽前的孢子體植物。胚胎可以通過有性雜交或自花授粉引起配子受精而形成?！坝行噪s交”是一株植物被另外的植物授粉?！白曰ㄊ诜邸笔峭ㄟ^自身授粉而產(chǎn)生種子，也就是說，花粉和胚珠來自同一植物。術(shù)語 “回交”指的是F1代雜交植物與它的親本植物之一進(jìn)行雜交?；亟槐坏湫偷赜脕韨鬟f基因給近交系，這些基因賦予簡單遺傳的、具有高度可遺傳性的性狀。近交系被稱為回歸親本。所需要的性狀來源于供體親本。當(dāng)供體和回歸親本有性雜交之后，擁有來自供體親本的所需要的性狀的F1代雜交植物被選擇出來并且重復(fù)地與回歸親本或近交系進(jìn)行雜交(即回交)。
胚胎也可以通過“胚胎體質(zhì)發(fā)生”和“克隆”而形成。體細(xì)胞胚胎發(fā)生是從植物的細(xì)胞、組織和器官中直接地或間接地產(chǎn)生胚胎。間接的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的特點(diǎn)是愈傷組織的生長和在愈傷組織表面形成胚胎。直接的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是在外植體組織上從單一細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)形成無性生殖胚胎，并不涉及愈傷組織階段。因?yàn)閺挠鷤M織容易產(chǎn)生異常植物，所以直接的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是優(yōu)選的。
在此使用的術(shù)語“植物”指的是各種植物細(xì)胞，其在很大程度上分化成在植物發(fā)育任何階段所存在的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)包括但并不限于整株植物、植物的部分或器官，例如愈傷組織、根、果實(shí)、種子、芽、莖、塊莖、葉、小花器官，包括穎片、外稃、內(nèi)稃、絨氈層和花粉，以及上述結(jié)構(gòu)的后代。植物后代包括植物、植物的部分和植物細(xì)胞的后代?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的植物種類通?？梢詮V泛到能夠接受轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類，包括單子葉植物和雙子葉植物。
術(shù)語“后代”指的是特定的植物或再生體(自交)的后裔，或一對植物(雜交或回交)的后裔。通過自花受粉產(chǎn)生的后代可以是T1代、T2代、或任何后續(xù)世代，而通過雜交產(chǎn)生的后代可以是F1代、F2代、或任何后續(xù)世代。典型地，親本是花粉供體和胚珠供體，它們通過雜交產(chǎn)生本發(fā)明的后代植物。親本也表示本發(fā)明的雜交植物(F2代植物)的F1代親本。最后，親本指的是回歸親本，它與本發(fā)明的雜交植物回交而產(chǎn)生本發(fā)明的另外的雜交植物。
術(shù)語“植物組織”包括已分化的和未分化的植物組織，包括但并不限于根、芽、葉、花粉、種子、瘤組織和培養(yǎng)中的不同類型的細(xì)胞(例如單個(gè)細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚胎、愈傷組織等)。植物組織可以存在于植物體、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、或細(xì)胞培養(yǎng)中。
植物的部分的例子有莖、愈傷組織、葉、根、果實(shí)、種子和塊莖。同樣，特定的植物組織，例如葉綠體、質(zhì)外體、線粒體、液泡，過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)，也被視為植物的一部分。此外，任何的植物細(xì)胞，無論來源于何種組織，也被視為植物的部分。
“轉(zhuǎn)基因植物”是通過重組技術(shù)將核酸序列導(dǎo)入其體內(nèi)的植物，這些重組技術(shù)有包含核酸的載體、克隆、體細(xì)胞胚胎發(fā)生，或被技術(shù)人員用來產(chǎn)生植物的任何其他的技術(shù)。
“系”涉及植物或它的種質(zhì)，轉(zhuǎn)化而來的原代再生體，(T0)代植物或它的后代，其是由于遺傳轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，其中所有或部分轉(zhuǎn)基因已經(jīng)被穩(wěn)定整合。
術(shù)語 “單子葉植物”指的是具有單一子葉的植物種類，包括小麥、燕麥、大麥、稻、黑麥、黑小麥、玉米和其他的谷類作物，以及甘蔗、高粱、鳳梨、山藥、洋蔥、香蕉、椰子、海棗、蛇麻草和草類，例如草地早熟禾、飼用牧草。
通貫全文所使用的谷類作物的俗名表示下列各屬的各種植物
雙子葉植物指的是一個(gè)植物種類，其特點(diǎn)是在發(fā)芽時(shí)出現(xiàn)一對胚胎子葉，它包括煙草、馬鈴薯、蕃茄、大豆、豌豆、菜豆、甜菜、番木瓜、南瓜屬植物(Cucurbita)(南瓜、黃瓜、甜瓜、倭瓜、夏南瓜)、核果樹、棉花、甘薯、十字花科植物(十字花科(Brassicaceae))，例如花椰菜、菜籽油菜以及近親型生物(鼠耳芥)。
其他對真菌或細(xì)菌性疾病易感的植物也被包括在內(nèi)，包括例如葡萄、古柯豆和堅(jiān)果類。
“EST”指的是已表達(dá)序列標(biāo)志，它是完整或不完cDNA的核苷酸序列，代表在器官、組織或細(xì)胞類型中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本或信使RNA，通常長度為100個(gè)或更多個(gè)核苷酸。發(fā)明詳述I.真菌細(xì)胞壁降解酶和編碼該酶的核酸分子本發(fā)明涉及編碼具有細(xì)胞壁降解活性(包括葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性)的多肽、來自鐮孢真菌基因的分離的核酸序列，以及分離的具有細(xì)胞壁降解活性的多肽。A1.編碼葡聚糖酶活性的核酸分子葡聚糖酶指的是具有降解葡聚糖β-1，3鍵能力的多肽。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明針對編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少70％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(b)編碼具有與SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NOl的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(ii)(i)的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d) (a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有葡聚糖酶活性的多肽片段。
編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的分離的核酸分子包括編碼葡聚糖酶并指導(dǎo)和調(diào)控葡聚糖酶編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)的基因組序列；以及編碼有葡聚糖酶活性的多肽的cDNA序列。
編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列的具體實(shí)施方案在SEQ ID NO1，3和16中給出?？勺鳛榉独钠暇厶敲富虍a(chǎn)物具有SEQ ID NO2，4，5和17所給出的預(yù)測氨基酸序列。包含全長葡聚糖酶基因的基因組DNA序列呈現(xiàn)在SEQ ID NO3中。此基因組DNA序列長度是3622bp，核苷酸序列分析顯示有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。編碼區(qū)包含第1801到2014位核苷酸和第2070到2761位核苷酸，編碼一個(gè)長度為301個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO4)。F.venenatum葡聚糖酶未修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO1中給出。此cDNA序列長度是1023bp。產(chǎn)生的可讀框(編碼部分)開始于第37位堿基，終止于第942位堿基，編碼一個(gè)長度為301個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO2)。一個(gè)F.venenatum的編碼葡聚糖酶的、經(jīng)過修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO16中給出。該cDNA長度是932bp?？勺x框開始于第18位堿基，終止于第923位堿基，編碼一個(gè)長度為301個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO17)。對未經(jīng)修飾的葡聚糖酶序列所做的一個(gè)修飾是CA豐富的5’前導(dǎo)序列GGATCCACCAACCAGCG(GLUC 5’引物中的#1-#17堿基，表2)的替代。經(jīng)過修飾的5’前導(dǎo)序列直接存在于葡聚糖酶編碼序列的ATG起始密碼子的上游。該修飾作用使得前導(dǎo)序列富含C和A核苷酸，并將T核苷酸的量減到最少。這些特性據(jù)說在植物中可以提高基因的翻譯效率。SEQ ID NO5顯示了有301個(gè)氨基酸的葡聚糖酶，是由F.venenatum cDNA所編碼的。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒GLU2中的序列(SEQ ID NO16，是F.venenatum的葡聚糖酶經(jīng)過修飾的全長cDNA序列)，該質(zhì)粒包含在大腸桿菌(Escherichia coli)NRRLB-30201中。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒FvGluS或FvGluAS中的序列，這兩個(gè)質(zhì)粒分別包含在大腸桿菌NRRLB-30204和NRRL B-30205中。
本發(fā)明也包含與SEQ ID1，3或16的編碼區(qū)、或SEQ ID NO3的編碼區(qū)加上內(nèi)含子有如下程度的序列同一性的核酸序列，序列同一性至少是70％，優(yōu)選至少約75％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約85％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選約為95％，且該序列編碼可有效降解葡聚萄糖β-1，3-鍵的多肽。就本發(fā)明而言，兩個(gè)核酸序列之間的同一性的程度由Clustal方法確定(Thompson等，1994)，使用ClustalW 1.7或1.8版(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)K-tuple＝2；裂隙(gap)減分＝5；窗口大?。?；對角線-4。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10；裂隙伸展減分＝5。
進(jìn)一步說，那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO1，3或16 DNA序列的編碼區(qū)或SEQ ID NO3的編碼區(qū)加上內(nèi)含子雜交，并編碼可有效降解葡聚糖β-1，3-鍵的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明也包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，3或16 DNA序列的編碼區(qū)或SEQ ID NO3的編碼區(qū)加上內(nèi)含子雜交的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸、優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1，3或16 DNA序列的編碼區(qū)或SEQ ID NO3的編碼區(qū)加上內(nèi)含子雜交的核酸序列或核酸序列子序列的互補(bǔ)鏈。這些子序列為至少100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步指向上述核酸序列的子序列，其中該子序列編碼具有葡聚糖酶活性的多肽片段。A2.具有葡聚糖酶活性的多肽本發(fā)明也涉及分離的、由上述核酸分子編碼的具有葡聚糖酶活性的多肽。分離的具有葡聚糖酶活性的多肽包括(a)具有與SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100個(gè)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有葡聚糖酶活性的片段。
圖1是由F.venenatum cDNA(上)和擬分枝孢鐮孢基因組DNA(下)(分別是SEQ ID NO5和4)所編碼的全長葡聚糖酶的比較。
由分離的核酸序列編碼的如下多肽也包括在本發(fā)明中，這些多肽所含有的氨基酸序列與SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸序列具有一定程度的同一性，這種序列同一性為至少約80％，優(yōu)選至少為5％，更優(yōu)選至少約90％，再更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約97％，而且這些多肽具有葡聚糖酶活性(同源多肽)。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所確定，使用ALIGN(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/seq-search/alignment.html)程序，以及BLOSUM50或PAM250評分矩陣和下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)在裂隙中的第一個(gè)殘基的裂隙減分＝-12，其它殘基的裂隙減分為-2；K-tuple＝2。多序列比對是由BLOSUM矩陣進(jìn)行的，使用ClustalW 1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10，裂隙伸展減分＝0.05；親水性裂隙減分功能打開(親水性殘基GPSNDQERK)；并有殘基特異性裂隙減分。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO2，4，5或17的氨基酸序列或其具有葡聚糖酶活性的片段。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸或其具有葡聚糖酶活性的片段。
SEQ ID NO2，4，5或17的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的多肽。片段優(yōu)選包含至少256個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少包含271個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少包含286個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明涉及分離的具有葡聚糖酶活性的多肽，其是由在上面詳述過的中度嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列所編碼的，這些序列是(i)SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈。
SEQ ID NO1，3或16的子序列可以至少是100個(gè)連續(xù)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸。而且，子序列可能編碼具有葡聚糖酶活性的多肽片段。
遺傳密碼的簡并性在本領(lǐng)域已經(jīng)廣為人知；因此，一個(gè)或更多個(gè)密碼子被替代的同義編碼序列可以很容易地被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所確定。同義編碼序列與示例的編碼序列不同，但卻編碼與在此明確地提供的具有相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
保守替代的例子發(fā)生在下列各組中堿性氨基酸(例如精氨酸、賴氨酸和組氨酸)，酸性氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)，極性氨基酸(例如谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(例如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)，芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。如上所述，通常不改變比活性的氨基酸替代在本領(lǐng)域已廣為人知，舉例來說，見H.Neurath和R.L Hill，1979，在蛋白質(zhì)(Theproteins)，學(xué)術(shù)出版社，紐約。最普遍發(fā)生的交換是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly，以及那些相反的交換。
本發(fā)明多肽具有至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少80％，甚至再更優(yōu)選至少90％，和最優(yōu)選至少100％的SEQ ID NO2，4，5或17的多肽的葡聚糖酶活性。
本發(fā)明的多肽可以從任何屬的微生物中獲得。就本發(fā)明而言，在此使用的與給定的來源相關(guān)的術(shù)語“從…中獲得”將意味著由該核酸序列編碼的多肽是由該來源，或已經(jīng)插入了來自該來源的該核酸序列的細(xì)胞所產(chǎn)生的。
本發(fā)明多肽可以是真菌多肽，例如曲霉屬(Aspergillus)，鐮孢屬，Magnaporthe或疫霉(Phytophthora)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多肽是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)，F(xiàn)usariumcerealis，F(xiàn)usarium crookwellense，大刀鐮孢，禾谷鐮孢，禾赤鐮孢(Fusarium graminum)，異孢鐮孢(Fusarium heterosporum)，合歡木鐮孢(Fusarium negundi)，尖孢鐮孢，多枝鐮孢(Fusariumreticulatum)，玫瑰色鐮孢，接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)，膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)，擬分枝孢鐮孢，硫色鐮孢Fusarium sulphureum)，F(xiàn)usarium torulosum，F(xiàn)usariumtrichothecioides或Fusarium venenatum多肽。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum細(xì)胞是Fusariumvenenatum A3/5，它本來被作為禾谷鐮孢ATCC 20334而保藏，最近被重新歸類為Fusarium venenatum(見Yoder和Christianson 1998，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)(Fungal Genetics and Biology)，2362-80和O’Donnell等，1998，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)，2357-67)；以及Fusarium venenatum的分類學(xué)同等物而不管它們當(dāng)前所稱的種名。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，F(xiàn)usarium venenatum細(xì)胞是在WO97/26330中Fusarium venenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC20334的形態(tài)學(xué)突變體。
很容易理解的是，就上述種而言，本發(fā)明包含其完全階段和不完全階段，以及其他的分類學(xué)同等物，例如無性型，而不管它們所稱的種名。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會很容易地識別適當(dāng)?shù)耐任锏耐恍浴Ｅe例來說，鐮孢的分類學(xué)同等物被D.L.Hawksworth，P.M.Kirk，B.C.Button，和D.N.Pegler(編輯)，1995，“Ainsworth & Bisby’s Dictionaryof the Fungi”，第八版，CAB International，大學(xué)出版社，劍橋，英國，第173-174頁所定義。
公眾可以很容易地在許多培養(yǎng)物保藏中心得到這些種的菌株，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，德意志微生物保藏中心(DSM)，真菌菌種保藏中心(CBS)，和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)。
此外，這樣的多肽可以是通過使用前述的探針，從包括微生物在內(nèi)的其他來源中識別和獲得的，而這些微生物是從自然界(舉例來說，土壤，堆肥，水等)中分離的。從其自然的生活環(huán)境中分離微生物的技術(shù)在本領(lǐng)域是廣為人知的。通過同樣地篩選另外的微生物的基因組或cDNA文庫，就可能獲得核酸序列。一旦用探針檢測出編碼多肽的核酸序列，就可以使用那些本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的技術(shù)(例如見Sambrook等，1989，前已述及)分離或克隆該序列。
正如在此定義的那樣，“分離的”多肽是基本上不含其他的非葡聚糖酶多肽的多肽，舉例來說，由十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所確定的純度至少是約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，甚至更最優(yōu)選約95％純。
由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽也包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中在所述多肽或其片段的N-端或C-端融合著另外一個(gè)多肽。融合多肽是通過將編碼另外一個(gè)多肽的核酸序列(或它的一部分)與本發(fā)明的核酸序列(或它的一部分)融合而制備出來的。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的，包括將編碼各多肽的編碼序列進(jìn)行連接，以便它們符合讀框，并且融合多肽的表達(dá)是在相同的啟動子和終止子的調(diào)控之下。B1.編碼內(nèi)切殼多糖酶活性的核酸分子內(nèi)切殼多糖酶指的是通過在殼多糖聚合物中隨機(jī)裂解C1和C4鍵而降解殼多糖的多肽。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明指向編碼具有內(nèi)部殼多糖活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；
(b)編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列，所說的多肽具有與SEQ ID NO11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(ii)(i)的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d) (a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽片段。
真菌內(nèi)部殼多糖核酸分子包括編碼內(nèi)切殼多糖酶及指導(dǎo)和調(diào)控內(nèi)切殼多糖酶編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)的基因組序列；以及編碼內(nèi)切殼多糖酶的cDNA序列。
編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的核苷酸序列的具體實(shí)施方案在SEQ ID NO10和18中給出?？勺鳛榉独膬?nèi)切殼多糖酶基因產(chǎn)物具有SEQ ID NO11和19所給出的預(yù)測氨基酸序列。F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶未修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO10中給出。該cDNA序列長度是1494bp。產(chǎn)生的可讀框(編碼部分)開始于第186位堿基，終止于第1385位堿基，編碼一個(gè)長度為399個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO11)。一個(gè)編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的經(jīng)過修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO18中給出。此cDNA長度是1227bp?？勺x框開始于第18位堿基，終止于第1217位堿基，編碼一個(gè)長度為399個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO19)。對未經(jīng)修飾的內(nèi)切殼多糖酶序列所做的一個(gè)修飾是CA豐富的5’前導(dǎo)序列GGATCCACCAACCAGCG(ENDO 5’引物中的#1-#17堿基。表2)的替代。經(jīng)過修飾的5’前導(dǎo)序列直接存在于內(nèi)切殼多糖酶編碼序列的ATG起始密碼子的上游。該修飾使得前導(dǎo)序列富含C和A核苷酸，并將T核苷酸的量減到最少。這些特性據(jù)說在植物中可以提高基因的翻譯效率。含有內(nèi)切殼多糖酶cDNA 5’部分的DNA序列(圖2)呈現(xiàn)在SEQ ID NO6中，引物的其余部分就被設(shè)計(jì)于此，該部分cDNA長度是467bp。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒ENDO167中的序列(SEQ ID NO18，是F.venenatum的內(nèi)切殼多糖酶經(jīng)過修飾的全長cDNA序列)，該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30202中。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒FvEndoS或FvEndoAS中的序列，這兩個(gè)質(zhì)粒分別包含在大腸桿菌NRRL B-30206和NRRL B-30207中。
本發(fā)明也包含與SEQ ID NO10或18的編碼區(qū)有一定程度的序列同一性的核酸序列，其中所述序列同一性是至少75％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約85％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選約95％，且該序列編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽，內(nèi)切殼多糖酶活性就是通過裂解內(nèi)部糖苷鍵而降解殼多糖的能力。就本發(fā)明而言，兩個(gè)核酸序列之間的同一性的程度由Clustal方法確定(Thompson等，1994)，使用ClustalW 1.7或1.8版(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)K-tuple＝2；裂隙減分＝5；窗口大?。?；對角線-4。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10；裂隙伸展減分＝5。
進(jìn)一步說，那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下能與SEQID NO10或18的DNA序列編碼區(qū)雜交并編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明也包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO10或18的DNA序列編碼區(qū)雜交的子序列，這些子序列是至少100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO10或18的DNA序列編碼區(qū)雜交的核酸序列或核酸序列子序列的互補(bǔ)鏈。這些子序列為至少100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步指向上述核酸序列的子序列，其中該子序列編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽片段。B2.具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽本發(fā)明也指向分離的、由上述核酸分子編碼的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽。分離的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽包含(a)具有與SEQ ID NO11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的片段。
由分離的核酸序列編碼的如下多肽也包括在本發(fā)明中，這些多肽所含有的氨基酸序列與SEQ ID11或19的氨基酸序列具有一定程度的同一性，這種序列同一性為至少約85％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約97％，而且這些多肽具有內(nèi)切殼多糖酶活性(同源多肽)。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所確定，使用ALIGN程序(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/seq-search/alignment.html)，以及BLOSUM50或PAM250評分矩陣和下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)在裂隙中的第一個(gè)殘基的裂隙減分＝-12，其它殘基的裂隙減分為-2；K-tuple＝2。多序列比對是由BLOSUM矩陣進(jìn)行的，使用ClustalW1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10，裂隙伸展減分＝0.05；親水性裂隙減分功能打開(親水性殘基GPSNDQERK)；并有殘基特異性裂隙減分。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO11或19的氨基酸序列或其具有內(nèi)切殼多糖酶活性的片段。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO11或19的第1到399位氨基酸或其具有內(nèi)切殼多糖活性的片段。
SEQ ID NO11或19的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的多肽。此片段優(yōu)選包含至少339個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少包含359個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少包含379個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明涉及分離的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽，其是由在上面詳述過的中度嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列所編碼的，這些序列是(i)SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈。
SEQ ID NO10或18的子序列可以是至少100個(gè)連續(xù)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸。而且，該子序列可能編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽片段。
同義編碼序列和保守氨基酸替代，正如上文詳細(xì)描述的那樣，在此通過參考而引入。
本發(fā)明多肽具有至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少80％，甚至再更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少100％的SEQ ID NO11或19的多肽的內(nèi)切殼多糖酶活性。
本發(fā)明多肽可以是從上文詳細(xì)描述過的任何屬的微生物中獲得的，這些微生物在此通過參考而引入。
正如在此定義的那樣，“分離的”多肽是基本上不含其他的非內(nèi)切殼多糖酶多肽的多肽，舉例來說，由十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所確定的純度是至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，甚至更最優(yōu)選約95％純。
由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽也包括如上文詳細(xì)描述過的融合多肽或可裂解的融合多肽，在此通過參考而引入。C1.編碼外切殼多糖酶活性的核酸分子外切殼多糖酶指的是具有降解殼多糖能力的多肽，它從殼多糖聚合物的末端開始順序裂解每個(gè)C1-C4鍵而降解殼多糖。在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明指向編碼具有內(nèi)部殼多糖活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(b)編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列，所說的多肽具有與SEQ ID NO13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(ii)(i)的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d) (a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽片段。
編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽的分離的核酸分子包括編碼外切殼多糖酶及指導(dǎo)和調(diào)控外切殼多糖酶編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)的基因組序列；以及編碼外切殼多糖酶的cDNA序列。
編碼外切殼多糖酶的核苷酸序列的具體實(shí)施方案在SEQ IDNOS8，12和20中給出?？勺鳛榉独耐馇袣ざ嗵敲富虍a(chǎn)物具有SEQ ID NO13和21所給出的預(yù)測氨基酸序列。F.venenatum外切殼多糖酶未修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO12中給出。此cDNA序列長度是1949bp。產(chǎn)生的可讀框(編碼部分)開始于第108位堿基，終止于第1853位堿基，編碼一個(gè)長度為581個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。被編碼的蛋白質(zhì)被描述在SEQ ID NO13中。F.venenatum的一個(gè)編碼外切殼多糖酶的、經(jīng)過修飾的全長cDNA序列在SEQ ID NO20中給出。該cDNA長度是1781 bp。可讀框開始于第18位堿基，終止于第1763位堿基，編碼一個(gè)長度為581個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(SEQ IDNO21)。對未經(jīng)修飾的外切殼多糖酶序列所做的一個(gè)修飾是CA豐富的5’前導(dǎo)序列GGATCCACCAACCAGCG(EXO 5’引物中的#1-#17堿基。表2)的替代。經(jīng)過修飾的5’前導(dǎo)序列直接存在于外切殼多糖酶編碼序列的ATG起始密碼子的上游。該修飾使得前導(dǎo)序列富含C和A核苷酸，并將T核苷酸的量減到最少。這些特性據(jù)說在植物中可以提高基因的翻譯效率。
含有擬分枝孢鐮孢外切殼多糖酶基因的5’部分的基因組DNA序列(圖3)呈現(xiàn)在SEQ ID NO8中。推導(dǎo)出的多肽序列在SEQ ID NOS9中給出。基因組DNA序列長度是995bp，核苷酸序列分析顯示它有2個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒EXO 9中的序列(SEQ ID NO20，是F.venenatum的外切殼多糖酶經(jīng)過修飾的全長cDNA序列)，該質(zhì)粒包含在大腸桿菌NRRL B-30203中。
在另外的一個(gè)實(shí)施方案中，所說的核酸分子是包含在質(zhì)粒FvExoS或FvExoAS中的序列，這兩個(gè)質(zhì)粒分別包含在大腸桿菌NRRLB-30208和NRRL B-30209中。
本發(fā)明也包含與SEQ ID12或20的編碼區(qū)有一定程度的序列同一性的核酸序列，其中所述序列同一性是至少75％，優(yōu)選至少約80％，再優(yōu)選至少約85％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選約95％，而且該序列編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽，外切殼多糖酶活性就是通過裂解末端糖苷鍵而降解殼多糖的能力。就本發(fā)明而言，兩個(gè)核酸序列之間的同一性的程度由Clustal方法確定(Thompson等，1994)，使用ClustalW 1.7或1.8版(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/multi-align/multi-align.html)以及下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)K-tuple＝2；裂隙減分＝5；窗口大?。?；對角線-4。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10；裂隙伸展減分＝5。
進(jìn)一步而言，那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQID NO12或20的DNA序列編碼區(qū)雜交并編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列也包含在本發(fā)明中。
本發(fā)明也包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO10或18的DNA序列編碼區(qū)雜交的子序列，這些子序列是至少100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包含那些在上面定義過的中度或高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO12或20的DNA序列編碼區(qū)雜交的核酸序列或核酸序列子序列的互補(bǔ)鏈，其中這些子序列是至少100個(gè)連續(xù)核苷酸，優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列。
本發(fā)明進(jìn)一步指向上述核酸序列的子序列，其中子序列編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽片段。C2.具有外切殼多糖酶活性的多肽本發(fā)明也指向分離的、由上述核酸分子編碼的具有外切殼多糖酶活性的多肽。分離的具有外切殼多糖酶活性的多肽包括(a)具有與SEQ ID NO13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有外切殼多糖酶活性的片段。
圖4顯示了F.venenatum cDNA(上)和擬分枝孢鐮孢基因組DNA(下)編碼的外切殼多糖酶的比較(分別是SEQ ID NO14和15)。
由分離的核酸序列編碼的如下多肽也包括在本發(fā)明中，這些多肽所含有的氨基酸序列與SEQ ID NO13或21的氨基酸序列具有一定程度的同一性，這種序列同一性為至少約85％，優(yōu)選至少約90％，更優(yōu)選至少約為95％，最優(yōu)選至少約97％，而且這些多肽都具有外切殼多糖酶活性(同源多肽)。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度由Pearson(1990)的FASTA/FASTP方法所確定，使用ALIGN程序(http//dot.imgen.bcm.tmc.edu9331/seq-search/alignment.html)，以及BLOSUM50或PAM250評分矩陣和下列各項(xiàng)成對比對參數(shù)在裂隙中的第一個(gè)殘基的裂隙減分＝-12，其余殘基的裂隙減分為-2；K-tuple＝2。多序列比對是由BLOSUM矩陣進(jìn)行的，使用ClustalW 1.7算法(Thompson等，1994)。多序列比對參數(shù)是裂隙開始減分＝10，裂隙伸展減分＝0.05；親水性裂隙減分功能打開(親水性殘基GPSNDQERK)；并有殘基特異性裂隙減分。
本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQ ID NO13或21的氨基酸序列或其具有外切殼多糖酶活性的片段。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽包含SEQ ID NO13或21的第1到581位氨基酸或其具有外切殼多糖酶活性的片段。
SEQ ID NO13或21的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端刪除了一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的多肽。這個(gè)片段優(yōu)選包含至少494個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少包含523個(gè)氨基酸殘基，最優(yōu)選至少包含552個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明涉及分離的具有外切殼多糖酶活性的多肽，其是由在上面詳述過的中度嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列所編碼的，這些序列是(i)SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈。
SEQ ID NO12或20的子序列可以是至少100個(gè)連續(xù)核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)核苷酸。而且，此子序列可以編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽片段。
同義編碼序列和保守氨基酸替代，正如上文詳細(xì)描述的那樣，在此通過參考而引入。
本發(fā)明一個(gè)多肽可以是從上文詳細(xì)描述過的任何屬的微生物中獲得的，在此通過參考而引入。
正如在此定義的那樣，“分離的”多肽是基本上不含其他的非外切殼多糖酶多肽的多肽，舉例來說，由SDS-PAGE所確定的純度是至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選約60％純，甚至更優(yōu)選約80％純，最優(yōu)選約90％純，甚至最優(yōu)選約95％純。
由本發(fā)明的核酸序列所編碼的多肽也包括如上文詳細(xì)描述過的融合多肽或可裂解的融合多肽，在此通過參考而引入。D.編碼細(xì)胞壁降解酶的核酸分子任何編碼具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的分離的細(xì)胞壁降解核酸分子都可以用于本發(fā)明。所使用的具體多核苷酸和氨基酸序列不是本發(fā)明的關(guān)鍵性特征，只要能實(shí)現(xiàn)所需要的細(xì)胞壁降解功能就行。E.與已知的真菌細(xì)胞壁水解酶的比較對GenBank/EMBL序列數(shù)據(jù)庫(Altschul等，1997)進(jìn)行的計(jì)算機(jī)檢索顯示F.venenatum全長cDNA序列編碼的多肽與已知的真菌細(xì)胞壁水解酶具有同一性。F.venenatum葡聚糖酶與來自酵母粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的葡聚糖1，3-β-葡萄糖苷酶(GenBank編號Z99126和AB000539)具有37％的氨基酸序列同一性；與來自釀酒酵母(SwissPro編號P15703；Klebl和Tanner，1989)和白色假絲酵母(SwissPro編號P43070)的葡聚糖1，3-β-葡萄糖苷酶具有34％的氨基酸序列同一性。F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶與來自其他真菌的殼多糖酶相類似。該內(nèi)切殼多糖酶與一種來自構(gòu)巢曲霉的殼多糖酶(GenBank編號D87063)的氨基酸序列具有56％的同一性，與來自粗球孢菌的殼多糖酶抗原具有53％的同一性(Yang等，1996；Zimmerman等，1996)，而且與來自Aphanocladium album的一個(gè)殼多糖酶具有48％的同一性(Blaiseau和Lafay，1992)。F.venenatum外切殼多糖酶與來自Trichoderma harzianum的兩個(gè)外切殼多糖酶有66％和58％的氨基酸序列同一性(Draborg等，1995)，與來自T。harzianum的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶具有64％的同一性(Peterbauer等，1996)。II.使用探針識別和分離序列的同系物其他鐮孢屬細(xì)胞壁降解基因或同系物基因，包括非功能的序列同系物的分離，可以使用許多技術(shù)來完成。例如，正如前面詳細(xì)描述的那樣，以公開的序列為基礎(chǔ)的核酸探針可以用來從cDNA或基因組DNA文庫分離所需要的基因。核酸探針可以是DNA或RNA。所需要的基因可以通過探針與目的序列的雜交而分離出來，這些目的序列包括基因組文庫克隆、cDNA文庫克隆或未克隆的分離的DNA或cDNA片段。雜交可以是在嚴(yán)格、高度嚴(yán)格、或低嚴(yán)格條件下在膜上或在溶液中進(jìn)行的。核酸探針在真菌中可以被當(dāng)做限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記來使用，以進(jìn)行基因座的遺傳學(xué)作圖，尤其在真菌中，或在真菌中識別同源基因或基因座。III.使用引物擴(kuò)增核苷酸序列以公開的序列為基礎(chǔ)的引物可以用來分離來自cDNA或基因組文庫的所需要的基因。感興趣的核酸可以從核酸樣品中使用擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出來。例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可以用來直接從基因組DNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫中擴(kuò)增鐮孢屬細(xì)胞壁降解酶和相關(guān)基因的序列。PCR和另外的體外擴(kuò)增方法也可用于舉例來說，克隆編碼被表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸序列，制備核酸以作為檢測在樣品中所需要的DNA或mRNA的存在的探針；用于核酸測序；或其他的目的。對于PCR的一般綜述參見PCR程序方法及應(yīng)用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)，Innis等，(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego(1990)。IV.重組核酸分子(結(jié)構(gòu))的制備在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，包含分離的細(xì)胞壁降解序列、并適合轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的重組核酸分子被制備出來。編碼所需要的多肽的核酸序列，舉例來說，編碼全長蛋白質(zhì)的cDNA或基因組序列，或編碼同源多肽的核酸序列，適合用來構(gòu)造重組表達(dá)盒，后者可以被導(dǎo)入所需要的宿主細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)盒典型地包含與一個(gè)或更多個(gè)調(diào)控序列可操作性地連接的鐮孢屬細(xì)胞壁降解核酸序列，所述調(diào)控序列在與之合適的條件下，指導(dǎo)編碼序列在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)，表達(dá)盒還可能包括其他的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列，它們將會指導(dǎo)來自有義或反義基因的序列在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的預(yù)期組織中的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)將被理解為包括在多肽的產(chǎn)生中所涉及的任何步驟，包括但并不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。
可以對編碼本發(fā)明多肽的分離的核酸序列進(jìn)行多種操作以便于多肽的表達(dá)。在該核酸序列被插入載體之前對它進(jìn)行處理可能是所希望的或必須的，這取決于表達(dá)載體。利用重組DNA方法修飾核酸序列的技術(shù)在本領(lǐng)域廣為人知。
調(diào)控序列包括對本發(fā)明的多肽的表達(dá)必須的或有利的所有成分。這樣的調(diào)控序列包括但并不限于前導(dǎo)序列，多聚腺苷酸化序列，前肽序列，啟動子，信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列，這已經(jīng)在上文詳細(xì)描述過了。
在此使用的啟動子序列指的是這樣的DNA序列，當(dāng)它連接到感興趣的核苷酸序列上的時(shí)候，能夠調(diào)控感興趣的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成mRNA。這已經(jīng)在上文詳細(xì)描述過了。
啟動子可能是組成型的。當(dāng)術(shù)語“組成型的”關(guān)系到啟動子的時(shí)候，就意味著該啟動子能夠在大多數(shù)缺乏刺激(例如熱休克，化學(xué)刺激，光刺激等)的環(huán)境和發(fā)育條件下和/或在幾個(gè)或許多組織、細(xì)胞類型、或器官中，指導(dǎo)可操作地連接的核酸序列轉(zhuǎn)錄。
啟動子可能是組織特異性或細(xì)胞特異性的。當(dāng)術(shù)語“組織特異性”被應(yīng)用于啟動子時(shí)，它指的是啟動子能夠指導(dǎo)感興趣的核苷酸序列在特異類型的組織(例如花瓣)中的選擇性表達(dá)，而同樣的感興趣的核苷酸序列在不同類型的組織(例如根)中的表達(dá)則相對缺乏。啟動子的組織特異性可以通過下列方法進(jìn)行評估舉例來說，將啟動子序列可操作性地連接報(bào)道基因，產(chǎn)生報(bào)道結(jié)構(gòu)，將報(bào)道結(jié)構(gòu)導(dǎo)入植物的基因組之內(nèi)，以使得報(bào)道結(jié)構(gòu)被整合進(jìn)所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的每個(gè)組織之內(nèi)，并在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中檢測報(bào)道基因的表達(dá)(例如檢測mRNA，蛋白質(zhì)，或被報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。
舉例來說，組成型的植物啟動子片段可能被用于指導(dǎo)鐮孢細(xì)胞壁降解酶在幾種到許多種植物組織中的表達(dá)。這樣的啟動子在大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下是有活性的。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，來自于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的1’-或2’-啟動子，以及技術(shù)人員已知的、來自不同植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
調(diào)控抗鐮孢基因在谷類作物中的組成型表達(dá)的啟動子和它們能夠在其中顯示活性的組織是玉米遍在蛋白-1啟動子，幼葉、根、花粉、種子(谷類作物)(Christensen和Quail，1996)；玉米Adh-1啟動子，胚芽、根、花藥、花粉、種子(稻)(Freeling和Bennett，1985)；稻ACT-1啟動子，葉芽、根、花各部分，包括花粉(稻)(Zhang等，1991)；CaMV 35S啟動子，葉、根(稻)(Battraw等)；ScBv啟動子，莖、內(nèi)稃、外稃、其他的小花器官，花藥(燕麥)(Tzafrir等)，1998。
器官特異性啟動子可以是舉例來說，來自貯藏池組織(Storagesink tissue)例如種子、馬鈴薯塊莖和果實(shí)(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)，或來自新陳代謝池組織例如分生組織(Ito等，1994，Plant.Mol.Biol.24863-878)的啟動子；或種子特異性啟動子，例如來自稻的麥谷蛋白，谷醇溶蛋白，球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等，1998，植物和細(xì)胞生理學(xué)(Plant and CellPhysiology)39885-889)；來自歐洲油菜(Brassica napus)的貯藏蛋白質(zhì)napA啟動子，或在本領(lǐng)域已知的任何其他的種子特異性啟動子。此外，啟動子可以是葉特性啟動子，例如來自稻或蕃茄的rbcS啟動子(Kyozuka等，1993，植物生理學(xué)(PlantPhysiology)102991-1000，或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等，1995，分子遺傳學(xué)和普通遺傳學(xué)(Molecular and General Genetics)248668-674)，或創(chuàng)傷誘導(dǎo)性啟動子例如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等，1993，植物分子生物學(xué)(Plant Molecular Biology)22573-588)。
或者，植物啟動子可以受環(huán)境或發(fā)育的調(diào)控。這樣的啟動子在此稱作“誘導(dǎo)型”啟動子。可能影響誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括病原體攻擊，無氧條件，或光的存在。
啟動子增強(qiáng)子元件也可能用來在植物中實(shí)現(xiàn)基因的較高表達(dá)。例如，啟動子增強(qiáng)子元件可能是被放置在啟動子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間的內(nèi)含子。例如，Xu等，1993，見上文，揭示了稻肌動蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子增強(qiáng)表達(dá)的用途。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用特別適合在單子葉植物中表達(dá)基因的調(diào)節(jié)序列或啟動子。舉例來說，正如在下文實(shí)施所述的那樣，我們選擇了玉米的多聚遍在蛋白-1(Polyubiquitin-1)基因的啟動子(Ubi-1，Christensen和Quail，1996)用來在小麥中調(diào)節(jié)葡聚糖酶和殼多糖酶基因的表達(dá)。Ubi-1啟動子在許多谷物種類中是有活性的。因?yàn)樗谠S多不同的器官和組織中起作用，所以它被稱“組成型的”啟動子，這些器官或組織包括小麥的愈傷組織、幼葉、胚乳(A.Blechl，未發(fā)表)、成熟花粉、和小花器官(P.Okubara和A.Blechl，未發(fā)表)、稻的正在分裂的胚胎形成愈傷組織、葉、根和成熟花粉(Cornejo等，1993)，以及玉米苗的胚芽和基(Liu等，1995)?？梢韵胂蟮玫経bi-1啟動子的用途會被擴(kuò)展到將該結(jié)構(gòu)應(yīng)用到對付那些攻擊小麥其他器官的病原體和攻擊其他谷類作物例如稻、玉米、燕麥和大麥的病原體。
啟動子也能用來啟始mRNA分子的轉(zhuǎn)錄而抑制基因的表達(dá)。使用重組DNA技術(shù)在宿主細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的方法是廣為人知的。例如，可以適當(dāng)?shù)厥褂梅戳x技術(shù)。參見，例如Sheehy等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，858805-8809(1988)和Hiatt等，美國專利4,801,340號。在有義方向?qū)牒怂嵋惨呀?jīng)顯示出這是一個(gè)有效阻斷目的基因的轉(zhuǎn)錄的方法。使用有義抑制方法調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的表達(dá)一個(gè)實(shí)例可參見Napoli等，植物細(xì)胞(The Plant cell)2279-289(1990)，以及美國專利5,034,323號，5,231,020號，和5,283,184號。
調(diào)控序列也可能是合適的前導(dǎo)序列，它是對宿主細(xì)胞的翻譯有重要作用的mRNA的一段非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作性地連接到編碼多肽的核酸序列的5’端。在所選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列都可以在本發(fā)明中使用。
調(diào)控序列也可能是多聚腺苷酸化序列，它可操作性地連接到核酸序列的3’端，并且在轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，被宿主細(xì)胞識別為在轉(zhuǎn)錄出的mRNA上加多聚腺苷酸殘基的信號。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列都可以在本發(fā)明中使用。
調(diào)控序列也可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼一段連接到多肽的氨基末端的氨基酸序列并且指導(dǎo)被編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌路徑。核酸序列的編碼序列的5’端可能天然地包含一個(gè)信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)在翻譯讀碼框架中天然地與編碼被分泌的多肽的編碼區(qū)片段連接?；蛘撸幋a序列的5’端可能包含這樣的信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)對編碼序列而言是外源性的。當(dāng)編碼序列并沒有天然地包含信號肽編碼區(qū)的時(shí)候，就可能需要外源的信號肽編碼區(qū)。或者，外源的信號肽編碼區(qū)可能只是取代天然的信號肽編碼區(qū)，以便提高多肽的分泌。然而，指導(dǎo)被表達(dá)的多肽進(jìn)入被選擇的宿主細(xì)胞的分泌路徑的任何信號肽編碼區(qū)都可能在本發(fā)明中使用。
含有來自細(xì)胞壁降解基因的序列的載體可能包含標(biāo)記基因，它賦予植物細(xì)胞選擇性表型?；蛘撸覍D(zhuǎn)化谷類作物更典型，標(biāo)記基因可以是在單獨(dú)的載體分子上被轉(zhuǎn)化。舉例來說，標(biāo)記基因可能編碼對殺蟲劑的抗性，特別是對抗生素的抗性，例如對卡那霉素、羧芐青霉素、氨芐青霉素或除草劑的抗性；例如對chlorosulfuron或膦絲菌素(在bialaphos和Basta中的活性成分)的抗性。
正如在下面的實(shí)施例中所描述的那樣，為了表達(dá)葡聚糖酶和殼多糖酶基因，我們構(gòu)建了起源于pAHC20(Christensen和Quail 1996)的載體，其中bar選擇性標(biāo)記基因受玉米Ubi-1啟動子(0.9kb，包括位于5’非翻譯區(qū)的第一個(gè)外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子)和NOS 3’終止子調(diào)節(jié)。賦予對除草劑bialaphos(de Block等，1987)的抗性的bar基因在我們的實(shí)驗(yàn)室中被成功地而且例行地當(dāng)做轉(zhuǎn)基因小麥植物的一個(gè)選擇性標(biāo)記。我們也使用了由Kent McCue博士(USDA-ARS，Albany，CA)設(shè)計(jì)的pUBK，設(shè)計(jì)pUBK的目的是避免使用氨芐青霉素抗性。為了構(gòu)建pUBK，McCue博士用pBGS9(Spratt等，1986)的相應(yīng)部分取代了pAHC20(Christensen和Quail 1996)的復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因(bla)，pBGS9編碼對卡那霉素的抗性(nptII)。pUBK可以從McCue博士那里公開得到。
制備重組轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的另外一個(gè)因素是轉(zhuǎn)基因mRNA的翻譯效力。基因序列的計(jì)算機(jī)分析和體外實(shí)驗(yàn)表明翻譯開始的效率受位于ATG開始(起始)密碼子前面并緊靠著該密碼子的三個(gè)核苷酸(-3到-1)所調(diào)節(jié)。有報(bào)告稱真核基因共有的起始密碼子前-3到-1位核苷酸是ACC(Kozak 1987)；對植物基因的一項(xiàng)調(diào)查表明這三個(gè)核苷酸是共有序列ACA(Ftterer和Hohn，1996)；85個(gè)玉米基因優(yōu)選GGC或AAG作為起始密碼子前后序列(Luehrsen和Walbot 1994)。為了檢查葉特異性mRNA的翻譯起始的假設(shè)效力或花粉中的胚乳特異性mRNAs的翻譯起始的假設(shè)效力，我們對一些來自GenBank和EMBL數(shù)據(jù)庫的單子葉植物基因起始密碼子前后的序列進(jìn)行了一次有限的考察(普通小麥，大麥(H.vulgare)，稻(O.sativa)，燕麥(A.sativa)，玉蜀黍(Z.mays))。小麥葉mRNAs共有的起始密碼子前后序列是GCC，單子葉植物花粉mRNAs共有的起始密碼子前后序列是G/A，A/C，非T。
另外，ATG上游的15-20個(gè)核苷酸，包括-3到-1位核苷酸，在許多單子葉植物基因中是富含AC的。我們已經(jīng)設(shè)計(jì)增強(qiáng)了外源基因例如在單子葉植物中的真菌基因的翻譯效率。V.表達(dá)載體本發(fā)明也涉及含有本發(fā)明的核酸序列、啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號的重組表達(dá)載體。在上文描述過的各種核酸和調(diào)控序列可能被結(jié)合在一起構(gòu)成重組表達(dá)載體，該載體可能包括一個(gè)或多個(gè)適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，在這樣的位點(diǎn)將允許編碼多肽的核酸序列的插入或替代?；蛘?，本發(fā)明的核酸序列可以通過將該核酸序列或包含該序列的核酸結(jié)構(gòu)插入一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體而表達(dá)。在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，編碼序列被置于載體的適當(dāng)位置以使得該編碼序列可操作性地與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)調(diào)控序列連接。
重組表達(dá)載體可能是任何載體(舉例來說，質(zhì)?；虿《?，其能適宜地用于重組DNA操作并能實(shí)現(xiàn)核酸序列的表達(dá)。載體的選擇典型地根據(jù)載體與將要導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞之間的相容性來決定。載體可以是線性的或閉合的環(huán)形質(zhì)粒。
載體可能是自主復(fù)制載體，也就是說，載體以一種獨(dú)立于染色體外的實(shí)體形式存在，載體的復(fù)制并不依賴于染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可能含有保證自主復(fù)制的任何工具?；蛘?，載體也可能是這樣的當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞以后，它被整合進(jìn)基因組內(nèi)并且與其整合的染色體一起復(fù)制。此外，也可以使用單一載體或質(zhì)粒，或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，它們共同包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的全部DNA，或者也可以使用轉(zhuǎn)座子。
載體也可能包含在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定核酸結(jié)構(gòu)的整合和表達(dá)的序列。這些序列包括攜帶基質(zhì)附著區(qū)(也被稱為支架附著區(qū))的DNA序列；舉例來說，酵母或植物來源例如來自擬南芥屬或小麥的序列。
載體也可能包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記以便能夠容易地選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
載體也可能包含一個(gè)或幾個(gè)元件，該元件允許將載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，或者允許在細(xì)胞中的載體不依賴于基因組而進(jìn)行自主復(fù)制。
為了整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，載體可以依賴編碼多肽的核酸序列或載體上的任何其他元件，以便通過同源或非同源重組的方式將載體整合進(jìn)基因組內(nèi)。
為了進(jìn)行自主復(fù)制，載體可以進(jìn)一步包含使得載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。
可將本發(fā)明核酸序列的一個(gè)以上的拷貝插入宿主細(xì)胞內(nèi)，以便增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。核酸序列拷貝數(shù)的增加可以通過將序列的至少一個(gè)附加拷貝整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組內(nèi)而獲得，或通過包括可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因與該核酸序列而獲得。那些包含了選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增出來的拷貝，因而也就包含了該核酸序列的附加拷貝的細(xì)胞，可以通過在存在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的情況下培養(yǎng)這些細(xì)胞而選擇出來。
用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的步驟對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已是眾所周知的了(參見，例如Sambrook等，1989，見上文)。VI.轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞的制備和多肽的生產(chǎn)本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的核酸序列的重組宿主細(xì)胞，把它用在多肽的重組生產(chǎn)中是有利的。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的制備和克隆方法在美國專利5,374,540號中有描述，它也在此被列入作為參考文獻(xiàn)。
宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物，例如原核生物；或非單細(xì)胞的微生物，例如真核細(xì)胞。
真核細(xì)胞可以包括任何的細(xì)胞，例如來自昆蟲，真菌類或植物的細(xì)胞。正如在上文中詳細(xì)描述過的那樣，術(shù)語“植物”包括全株植物，植物的部分或器官，植物組織。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)多肽的方法，包括在適合多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞并回收該多肽。細(xì)胞被培養(yǎng)在合適多肽生產(chǎn)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，使用的是在本領(lǐng)域中已知的方法。多肽可以使用本領(lǐng)域中已知的方法檢測和回收。
本發(fā)明也涉及生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于多肽生產(chǎn)的條件下，培養(yǎng)含有編碼有本發(fā)明酶活性的多肽的核酸序列的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞；和(b)回收該多肽。
可以使用在本領(lǐng)域中已知道的對這種多肽特異性的方法檢測多肽。這些檢測方法可以包括使用特異抗體，酶產(chǎn)物的形成，或酶底物的消失。舉例來說，正如在此描述的那樣，可采用酶測定法確定多肽的活性。
產(chǎn)生的多肽可能通過本領(lǐng)域中已知的方法回收。例如，該多肽可以通過傳統(tǒng)的步驟從營養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，這些步驟包括但并不限于離心，過濾，提取，噴霧干燥，蒸發(fā)或沉淀。
本發(fā)明多肽可以通過多種在本領(lǐng)域中已知的步驟進(jìn)行純化，包括但并不限于色譜分析法(舉例來說離子交換，親和層析，疏水層析，色譜凝焦法和分子篩法)；電泳步驟(舉例來說，制備型等電聚焦)；差異溶解度(舉例來說，硫酸銨沉淀)，SDS-PAGE或提取法(舉例來說，見蛋白質(zhì)純化(Protein Purification)，J.-C.Janson和Lars Ryden，編者，VCH出版社，紐約，1989)VIII.轉(zhuǎn)基因植物的制備表達(dá)本發(fā)明的RNA轉(zhuǎn)錄本或多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法構(gòu)建。簡而言之，植物或植物細(xì)胞是通過如下方式構(gòu)建的將編碼本發(fā)明的多肽的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)整合進(jìn)植物宿主基因組內(nèi)，并繁殖所產(chǎn)生的經(jīng)過修飾的植物或植物細(xì)胞而獲得轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是谷類作物植物，包括但并不限于小麥、黑麥、黑小麥、大麥、玉米、高粱和稻。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物是小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥。在一個(gè)備選的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物。
在上文描述過的DNA結(jié)構(gòu)可以通過多種傳統(tǒng)的技術(shù)被導(dǎo)入所需要的植物宿主基因組內(nèi)。轉(zhuǎn)化廣泛多樣的高等植物物種的技術(shù)是眾所周知的，并被描述在技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中。參見，例如Weising等，Ann，Rev.Genet.22421-477(1988)。
DNA結(jié)構(gòu)可以通過使用下列技術(shù)直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組中，例如植物細(xì)胞原生質(zhì)體或胚胎發(fā)生愈傷組織的生物轟擊方法，電穿孔法，PEG穿孔法，和顯微注射法?；蛘?，DNA結(jié)構(gòu)可能與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)結(jié)合，使用根癌農(nóng)桿菌或毛根農(nóng)根菌(A.rhizogenes)載體導(dǎo)入細(xì)胞。
術(shù)語“撞擊”、“轟擊”和“生物轟擊”指的是使粒子加速撞向靶生物學(xué)樣品(例如細(xì)胞，組織等)，以造成靶生物學(xué)樣品細(xì)胞的細(xì)胞膜的損傷和/或使粒子進(jìn)入靶生物學(xué)樣品內(nèi)的方法。生物轟擊的方法在本領(lǐng)域廣為人知(舉例來說，美國專利5,584,807號，其內(nèi)容在此被列入作為參考文獻(xiàn))，而且是商品化的(舉例來說，氦氣驅(qū)動的微粒加速器(PDS-1000/He)(BioRad)。
粒子轟擊技術(shù)在Klein等，Nature 32770-73(1987)中被描述。一個(gè)特別優(yōu)選的轉(zhuǎn)化小麥和其他的谷類作物的方法是轟擊起源于未成熟胚胎的愈傷組織，如Week等，Plant Physiol，1021077-1084(1993)描述的。
顯微注射技術(shù)在本領(lǐng)域廣為人知并在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中被很好地描述。使用聚乙二醇沉淀導(dǎo)入DNA結(jié)構(gòu)的方法在Paszkowski等，EMBO J.32717-2722(1984)中有描述。電穿孔技術(shù)在Fromm等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 825824(1985)中有描述。
根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)也被很好地描述在科學(xué)文獻(xiàn)中。參見例如Horsch等，Science，233496-498(1984)，和Fraley等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 804803(1983)。雖然農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物中，但某些單子葉植物也可以被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。例如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻就被Hiei等，Plant J.6271-282(1994)；美國專利5,187,073號；美國專利5,591,616號；Li等，中國科學(xué)(Sciencein China)3454(1991)；和Raineri等，Bio/Technilogy 833(1990)描述過。Xu等，Chinese J.Bot.281(1990)通過農(nóng)桿菌感染轉(zhuǎn)化了玉米、大麥、黑小麥和蘆筍。
本發(fā)明特別用于小麥和其他的谷類作物。轉(zhuǎn)化谷類作物的許多方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中被描述過了。例如，小麥——包括高度再生品種例如硬質(zhì)白色春小麥Bodwhite的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的可靠方法，就已經(jīng)被描述過了(Vasil等，1992，1993；Week等，1993；Becker，1994；Nehra等，1994，Blechl和Anderson，1996)。Blechl等的美國專利5,650,558號和5,914,450號描述了小麥和非小麥谷類植物的轉(zhuǎn)化，這些專利在此被列為參考文獻(xiàn)。Chen等(1998)將一個(gè)受35S啟動子調(diào)控的稻殼多糖酶基因?qū)胄←湣Ｋ诘谝淮斜槐磉_(dá)，但隨后在后代植物中沉寂下來。Jensen等(1998)將一個(gè)受自身啟動子調(diào)控的修飾過的熱穩(wěn)定1，3-1，4-葡聚糖酶基因?qū)氪篼?，并獲得了在發(fā)芽的糊粉和子葉盤中表達(dá)該基因的植物。Bliffeld等(1998)將一個(gè)受玉米遍在蛋白-1啟動子的調(diào)控的大麥種子II類殼多糖酶基因?qū)胄←湥摻Y(jié)構(gòu)的二個(gè)轉(zhuǎn)基因植物系顯示它們對由真菌禾白粉菌引起的感染的抗性增加了，該真菌可引起白粉病。
轉(zhuǎn)基因玉米再生體已經(jīng)由Fromm等，Bio/Technology8833-839(1990)和Gordon-Kamm等，植物細(xì)胞(Plant cell)2603-618(1990)描述過了。同樣地，燕麥(Sommers等，Bio/Technology 101589-1594(1992))，高粱(Casas等，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 9011212-11216(1993))，稻(Li等，Plant Cell Rep.12250-255(1993))，大麥(Yuechun & Lemaux，Plant Physiol.10437-48(1994))，和黑麥(Castillo等，Bio/Technology 121366-1371(1994))已經(jīng)通過轟擊被轉(zhuǎn)化。稻的轉(zhuǎn)化被Toriyama等，Bio/Technology 61072-1074(1988)，Zhang等，Theor.Appl.Gen 76835-840(1988)，和Shimamoto等，Nature 338274-276(1989)所描述。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及瞬時(shí)表達(dá)所要求保護(hù)的序列的植物、種子、植物組織、植物器官和植物細(xì)胞。涉及表達(dá)指的是在植物中從所要求保護(hù)的DNA序列產(chǎn)生mRNA和/或蛋白質(zhì)，而質(zhì)粒并沒有穩(wěn)定整合進(jìn)入宿主基因組。這樣的表達(dá)可以在使用粒子槍轟擊、土壤桿菌和其他的用于轉(zhuǎn)化植物的方法導(dǎo)入DNA后1到14天被觀察到。
通過上述的任何轉(zhuǎn)化技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞可以被培養(yǎng)以便產(chǎn)生全株植物，該植物擁有被轉(zhuǎn)化的基因型和所需要的表現(xiàn)型。這樣的再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中控制某些植物生長激素，典型地依賴與細(xì)胞壁降解多核苷酸序列一起被導(dǎo)入的殺蟲劑和除草劑標(biāo)記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體中再生植物的方法在Evans等，原生質(zhì)體分離與培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(Protoplasts Isolation andCulture，Handbook of Plant Cell Culture)，Macmillian出版公司，紐約，pp.124-176 1983；以及Binding，植物的再生，植物原生質(zhì)體(Regeneration of Plant，Plant Protoplasts)，CRC出版社，Boca Raton，pp.21-73 1985中被描述。再生也可以從植物的愈傷組織、外殖體、器官、或其部分中獲得。這樣的再生技術(shù)在Klee等，Ann.Rev.of Plant.Phys 38467-486(1987)中有一般性描述。
被轉(zhuǎn)化的植物是通過所需要的性狀的存在與否和/或所需要的性狀的表達(dá)程度來進(jìn)行評價(jià)的。最先的評價(jià)可以包括新導(dǎo)入的基因的表達(dá)水平，被轉(zhuǎn)化的植物的真菌抗性水平，和所需要的性狀的遺傳穩(wěn)定性。
技術(shù)人員應(yīng)明了，在表達(dá)盒穩(wěn)定地整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物中而且確認(rèn)這種整合是可操作性的以后，它可以通過有性雜交而導(dǎo)入其他的植物中。用來將所需要的表現(xiàn)型轉(zhuǎn)移給植物繁殖種群的一種技術(shù)是通過回交。然而，許多的標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)之中的任何一種都可以使用，這取決于所要雜交的物種。
遭受真菌攻擊的任何植物物種或品種都可以被一種或多種本發(fā)明的遺傳結(jié)構(gòu)所轉(zhuǎn)化，以便增強(qiáng)對鐮孢或其他的病原體的抗性，舉例來說，增強(qiáng)對鐮孢性穗枯萎病和其他的真菌性疾病的抗性，包括通過(a)產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶，包括有能力降解F.venenatum和其他的鐮孢屬種(包括禾谷鐮孢和大刀鐮孢，這些真菌是美國的穗枯萎病(瘡痂病)的主要致病因素)的細(xì)胞壁成分葡聚糖和殼多糖的蛋白質(zhì)，(b)在轉(zhuǎn)基因單子葉植物(包括小麥、大麥或燕麥)中表達(dá)細(xì)胞壁降解酶，以賦予部份或者完全的對鐮孢屬種和小麥和其他的谷類作物其他真菌病原體的抗性，(c)限制致病性鐮孢的傳播以及減少DON在受感染的穗上的蓄積，和(d)在雙子葉植物中表達(dá)細(xì)胞壁降解酶以賦予對植物病原體的抗性。
下面的非限制的名單是真菌性疾病的舉例說明鐮孢性穗枯萎病，由尖孢鐮孢或腐皮鐮孢引起的鐮孢萎蔫，由串珠鐮孢引起的莖干腐爛病，由疫霉引起的真菌性疾病。
為了進(jìn)一步說明，下面的非限制性物種名單列舉的是特別感興趣的單子葉植物小麥、稻、大麥、玉米、黑麥、燕麥、高粱、黑小麥。
轉(zhuǎn)基因系的分析可以通過Northern印跡法、原位雜交法、RT-PCR法、S1核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、RNase保護(hù)實(shí)驗(yàn)、Western印跡、酶測定或其他的方法來進(jìn)行，以監(jiān)測mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。IX.用途如上文所述，本發(fā)明的一種特別的用途是提供如下植物或植物細(xì)胞，這些植物或植物細(xì)胞是被編碼葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶的編碼序列的DNA序列轉(zhuǎn)化過的，這種轉(zhuǎn)化使植物具有了對植物病原體的抗性，特別是對鐮孢屬物種的抗性。
同樣，本發(fā)明的另外一種用途是提供能夠在鐮孢屬真菌中檢測葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶基因或其功能性等價(jià)物的探針和引物，以及該探針在分離編碼葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶基因或其功能同等物的DNA序列中的用途。
使用本發(fā)明的核酸序列將便于從宿主分離同源基因以獲得保護(hù)包括真菌和植物在內(nèi)的宿主細(xì)胞，對抗相關(guān)的真菌病原體的基因。
本發(fā)明序列的另外一種用途是以反義方向用作基因敲除。
另外的一種用途是為研究目的而產(chǎn)生鐮孢細(xì)胞壁降解蛋白質(zhì)。
另外的一種用途是產(chǎn)生細(xì)胞壁降解性殼多糖酶和葡聚糖酶以用于降解海產(chǎn)食物的廢棄物，例如包含殼多糖的貝殼，或用于對殼多糖或葡聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾。概述在我們下面的實(shí)施例中，我們詳細(xì)地描述了在抗擊小麥和其他的農(nóng)作物的鐮孢性穗枯萎病(瘡痂病)和其他鐮孢介導(dǎo)疾病中所做的工作。我們分離出編碼能夠降解真菌細(xì)胞壁的葡聚糖和殼多糖成分的酶的cDNAs和基因，并從F.venenatum中識別出三個(gè)不同的cDNA克隆(編碼葡聚糖酶，內(nèi)切殼多糖酶，和外切殼多糖酶)，從擬分枝孢鐮孢中識別出內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶的基因同系物。F.venenatum是穗枯萎病的致病因子禾谷鐮孢的一個(gè)近親。F.venenatum和擬分枝孢鐮孢都產(chǎn)生與穗枯萎病病原體所產(chǎn)生的真菌毒素類似的毒素。來自鐮孢屬物種的細(xì)胞壁降解酶是真菌正常的生長和發(fā)育所需要的。
我們檢查了來自F.venenatum的EST的兩個(gè)葡聚糖酶cDNA克隆，一個(gè)內(nèi)切殼多糖酶cDNA克隆，以及三個(gè)外切殼多糖酶cDNA克隆的核苷酸序列。兩個(gè)葡聚糖酶cDNA克隆被確定為全長序列，而所有的殼多糖酶克隆都是缺少了5’端的不完全cDNA克隆，缺少成分包括ATG翻譯起始密碼子在內(nèi)。為了恢復(fù)缺少的序列，我們對擬分枝孢鐮孢的基因組文庫進(jìn)行了被稱為5’錨式PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。產(chǎn)生的內(nèi)切和外切殼多糖酶的5’基因組片段不能直接添加到不完全的cDNA克隆上，因?yàn)槊總€(gè)片段都攜帶了內(nèi)含子。然而，這些5’片段的核苷酸序列為寡核苷酸PCR引物的設(shè)計(jì)提供了必須的數(shù)據(jù)，以便用該引物最終獲得全長克隆。
為了獲得內(nèi)切和外切殼多糖酶的全長cDNA克隆，我們使用F.venenatum的cDNA文庫進(jìn)行了第二個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)程序。用來擴(kuò)增cDNAs的引物去除了編碼區(qū)側(cè)翼的大部份非翻譯序列。對基因的5’末端有特異性的PCR引物包括附加的核苷酸，其用A或C核苷酸替代了緊靠ATG起始密碼子上游的15-16個(gè)堿基。AC豐富的起始密碼子前后序列(以及5’側(cè)翼核苷酸)預(yù)計(jì)會在多種小麥和其他的單子葉植物器官中使基因轉(zhuǎn)錄物的翻譯變得更加容易。PCR引物把一個(gè)5’BamHI限制位點(diǎn)和一個(gè)3’BglII限制位點(diǎn)加入cDNAs的擴(kuò)增部分的末端。這些位點(diǎn)對于將cDNAs克隆到我們的單子葉植物表達(dá)載體中是有用的。
內(nèi)切和外切殼多糖酶PCR產(chǎn)物，以及葡聚糖酶cDNA，首先被克隆到細(xì)菌載體pCR2.1或pBKS+中。為接下來的克隆程序生產(chǎn)適當(dāng)量的cDNA質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌宿主中很容易做到。同時(shí)，在所有三個(gè)cDNAs被克隆到細(xì)菌載體中之后，要對它們的核苷酸序列進(jìn)行驗(yàn)證，以便核對PCR擴(kuò)增在5’區(qū)引入了修飾以及除去了不必要的側(cè)翼序列而不改變編碼區(qū)。然后cDNAs被引入pUBKBgl II-載體之內(nèi)，以便在單子葉植物中進(jìn)行表達(dá)。該單子葉植物表達(dá)載體攜帶了來自玉米多聚遍在蛋白-1(Ubi-1)基因的啟動子，賦予對除草劑bialaphos抗性的bar基因，一個(gè)來自根癌農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶(nos)基因的3’終止子片斷，和賦予對抗生素卡那霉素抗性的npt II標(biāo)記基因。一個(gè)位于Ubi-1啟動子中的Bgl II限制性酶切位點(diǎn)被定點(diǎn)誘變所消除。這使我們能夠用限制性酶Bgl II和BamHI從pUBKBglII中除去bar基因，并用F.venenatum cDNAs取而代之。我們獲得了三個(gè)cDNAs的有義方向和反向序列(總共6個(gè))，它們是根據(jù)啟動子-轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因-終止子接合點(diǎn)的核苷酸序列而確定的。
普通小麥(Triticum aestivum)品種Bodwhite的胚胎被攜帶了有義方向cDNAs的質(zhì)粒加上攜帶了bar基因的選擇性標(biāo)記質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行轟擊。使用在實(shí)驗(yàn)室中發(fā)展的方法來培養(yǎng)愈傷組織和再生植物。根據(jù)在存在除草劑bialaphos的情況下(bar基因賦予抗性)的生長情況選擇候選轉(zhuǎn)基因植物。來自候選轉(zhuǎn)化體的葉部分的DNA進(jìn)一步用PCR方法進(jìn)行分析，所用的第一個(gè)引物是根據(jù)玉米Ubi-l啟動子序列設(shè)計(jì)的，第二個(gè)引物是分別對每個(gè)轉(zhuǎn)基因(葡聚糖酶，內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶)有特異性的引物。那些攜帶轉(zhuǎn)基因DNA的植物正在繁殖，為的是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因純合的種子。純合系轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以及對禾谷鐮孢和其他的真菌病原體的抗性都要進(jìn)行檢測。
實(shí)施例下列實(shí)施例僅僅想要對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，而不是想要限制由權(quán)利要求書所定義的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中使用了許多對下列領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是眾所周知而且也是容易理解的技術(shù)，這些領(lǐng)域包括分子生物學(xué)領(lǐng)域；植物組織中進(jìn)行的重組DNA操作；以及轉(zhuǎn)基因植物的培養(yǎng)和再生。酶都是從商業(yè)來源獲得的，并且都是按照賣主推薦的方法或其他本領(lǐng)域熟知的變通方法來使用的。提供標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)程序的參考文獻(xiàn)包括Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Painview，紐約；R.Wu(編輯)(1993)，酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)218；Wu等(編輯)，酶學(xué)方法100，101；Glover(編輯)(1985)；DNA克隆(DNA Cloning)，第一卷和第二卷，LRL出版社，牛津，英國；以及Hames和Higgins(編輯)(1985)，核酸雜交(Nucleic AcidHybridization)，LRL出版社，牛津，英國。有關(guān)植物組織的處理和轉(zhuǎn)化的參考文獻(xiàn)有Kung和Arntzen(編輯)(1993)，植物生物技術(shù)(Plant Biotechnology)，Butterworths，Stonehan，MA；R.A.Dixon(編輯)(1985)，植物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)用方法(Plant CellCultureA Practical Approach)，LRL出版社，牛津，英國；Schuler和Zielinski(1989)，植物分子生物學(xué)方法(Methods in PlantMolecular Biology)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，CA；Weissbach和Weissbach(編)(1988)Academic Press，San Diego，CA；I.Potrykus(1991)Ann.Rev.Plant Physiol.PlantMol.Biol.42205；Weising等，(1988)Annu.Rev.Genet.22421；van Wordragen等(1992)，Plant Mol.Biol.Rep.1912；Davey等(1989)，Plant.Mol.Biol.13273；Walden和Schell(1990)，Eur.J.Biochem.192563；Joersbo和Brunstedt(1991)，Physiol.Plant.81256以及在這些參考文獻(xiàn)中引用的參考文獻(xiàn)。所使用的縮寫和專門用語被認(rèn)為是本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)用法并通常見于專業(yè)雜志，例如在此引用的雜志。所有在本申請中引用的參考文獻(xiàn)在此被清楚地并入本文作為參考。實(shí)施例1F.venenatum菌絲的分離F.venenatum CC1-3是鐮孢屬ATCC 20334株的一個(gè)形態(tài)突變株(Wiebe等，1991，Mycol.Research 951284-1288)。用批量進(jìn)料發(fā)酵法在2升實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵罐中培養(yǎng)Fusarium venenatumCC1-3，使用作為碳源的NUTRIOSEJ(Roquette Freres，S.A.，Beinheim，法國)和酵母提取物進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)供給磷酸銨。pH值維持在6-6.5，溫度維持在30℃，伴有活性溶解氧。
分別在接種后的2，4，6，8天收集菌絲的樣品并迅速地在液氮中冷凍。將樣品保存在-80℃中，需提取RNA時(shí)取出使用。實(shí)施例2cDNA文庫的構(gòu)建用Timberlake和Barnard的方法(1981，細(xì)胞(Cell)2629-37)提取實(shí)施例1中所獲得的菌絲樣品的總細(xì)胞RNA。將RNA在含1％甲醛的凝膠上印跡后用Northern雜交的方法分析這些RNA(Davis等，1986，分子生物學(xué)的基礎(chǔ)方法(Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier Science Publishing Co，Inc，紐約)。用mRNA分離試劑盒(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)，按照使用說明從細(xì)胞的總RNA中分離多聚腺苷酸化的mRNA部分。根據(jù)Gubler和Hoffman的方法(1983，基因(gene)25263-269)，用大約5μg的poly(A)+mRNA合成雙鏈cDNA，以NotI-(dT)18引物(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)起始第一條鏈的合成。綠豆核酸酶(Boehringer Mannheim Corporation，Indianapolis，IN)處理cDNA后，用T4 DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)補(bǔ)平末端。
以NotI酶切cDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳選擇合適大小的片段(約0.7-4.5Kb)，然后和pZErO-2.1(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)載體相連接。pZEro-2.1預(yù)先用NotI和EcoRV進(jìn)行酶切，并用牛小腸堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim公司，Indianapolis，IN)進(jìn)行去磷酸化處理。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10的感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。在含有終濃度為50μg/ml卡那霉素的2YT瓊脂板上選擇轉(zhuǎn)化體(Miller，1992，細(xì)菌遺傳學(xué)短期教程(A Short Course in Bacterial Genetics)。大腸桿菌及相關(guān)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)操作手冊，冷港泉出版社，冷港泉，紐約)。
用克隆載體pZErO-2.1構(gòu)建兩個(gè)獨(dú)立的定向的cDNA文庫。文庫A用接種后4天收獲的菌絲的mRNA構(gòu)建，文庫B用接種后6天收獲的菌絲的mRNA構(gòu)建。為了檢測基因在細(xì)胞中有代表性的表達(dá)“瞬志圖(snapshot)”，兩個(gè)文庫都不進(jìn)行擴(kuò)增。而是對文庫進(jìn)行鋪板，滴定，并對來自每個(gè)文庫的獨(dú)立的克隆進(jìn)行DNA測序分析。
文庫A(4天的細(xì)胞)含有7.5×104個(gè)獨(dú)立的克隆。文庫B(6天的細(xì)胞)大約有1.2×105個(gè)克隆。從每個(gè)文庫的各40個(gè)克隆中小量制備DNA并檢測cDNA是否插入及其插入片段的大小。在這項(xiàng)分析中，來自A文庫的40個(gè)克隆中有39個(gè)(97.5％)克隆有大小在600bp至2200bp(平均＝1050bp)的片段插入。類似的，從B文庫中挑選的40個(gè)克隆中39個(gè)克隆(97.5％)有片段插入，其大小在800bp至3600bp之間(平均＝1380bp)。實(shí)施例3模板的制備及核苷酸的測序在實(shí)施例2中所描述的各cDNA文庫中，直接從轉(zhuǎn)化平板上各挑選1192個(gè)轉(zhuǎn)化體克隆，轉(zhuǎn)移到含有200μl 2YT肉湯培養(yǎng)基(Miller，1992，見上文)和50μg/ml卡那霉素的96孔微孔板中。將這些板放置在37℃中過夜培養(yǎng)，不需要搖晃。培養(yǎng)后，往每個(gè)孔中加入100μl 50％無菌的甘油。轉(zhuǎn)化物復(fù)制到二級深盤的96孔微量培養(yǎng)板上(Advanced Genetic Technologies Corporation，Gaithersburg，MD)，每個(gè)孔中含有1ml的Magnificent BrothTM(MacConnellResearch，San Diego，CA)和50μg/ml的卡那霉素。最初的微量板保存在-80℃，二級深孔板在37℃搖床中劇烈震蕩(300rpm)，過夜培養(yǎng)。為了防止液體灑出和相互污染以及供給充足的氧氣，在每個(gè)二級培養(yǎng)板上蓋上一個(gè)聚丙烯板(Advanced GeneticTechnologies Corporation，Gaithersburg，MD)和一個(gè)塑料微量碟蓋。
用經(jīng)Utterback等改進(jìn)(1995，Genome Sci.Technol.11-8)的高級遺傳技術(shù)公司(Advanced Genetic Technologies Co.)的96孔Miniprop試劑盒的方法從每個(gè)孔中分離DNA，用Peikin-Elmer應(yīng)用生物系統(tǒng)377型測序儀XL(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，Ca)進(jìn)行單途徑DNA測序，使用染料終止化學(xué)(Giesecke等，1992，病毒學(xué)方法雜志(Journal of Virolog Methods)3847-60)和反向Lac測序引物(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MD)。實(shí)施例4DNA序列數(shù)據(jù)的分析核苷酸序列資料經(jīng)認(rèn)真仔細(xì)的分析，如果樣品間距錯(cuò)誤或不確切程度超過2％，那么該樣品要被舍棄或重測。在FACTURATM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)的協(xié)助下將載體的序列移除。另外，如果序列的模糊堿基信號數(shù)增多則將每個(gè)樣品的序列的末端截短。用AutoAssemblerTM軟件(Perkin-Elmer Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)將所有的序列進(jìn)行互相比較以確定重復(fù)度。最后，將所有序列按照三個(gè)讀碼框架進(jìn)行翻譯，并用GeneAssistTM軟件(Perkin-ElmerApplied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)在非冗余數(shù)據(jù)庫(NRDB)中進(jìn)行搜索，所用的算法是改進(jìn)的Smith-Waterman算法，采用閾值為70的BLOSUM 62矩陣。NRDB是由Genpept，Swiss-Prot，及PIR數(shù)據(jù)庫所組成的。實(shí)施例5編碼推定的殼多糖裂解酶的ESTs的確定用應(yīng)用生物系統(tǒng)377型XL自動DNA測序儀，根據(jù)使用手冊的說明，對隨機(jī)cDNA克隆作部分測序，識別出編碼推定的殼多糖裂解酶的EST克隆，將每個(gè)EST的推定的氨基酸序列和NRDS中的氨基酸序列進(jìn)行比較，NRDS是從公用的蛋白和核酸數(shù)據(jù)庫構(gòu)成的(如GENBANK，EMBL，TREMBL，GENPEPT，SWISSPROT，PIR)。顯示推定的氨基酸序列與Trichoderma harzianum的外切殼多糖酶(TREMBLP78739)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)內(nèi)切殼多糖酶1的前體(SWISSPROT P54196)，粗球孢菌殼多糖酶(PIR JC4565)，來源于釀酒酵母的外切-β-1，3-葡聚糖酶(SWISSPROT P15703)，來源于熱纖維梭菌的多聚-β-氨基葡萄糖苷酶(TREMRL Q59326)，Emericella nidulans殼多糖酶(GENPEPT D87063)，及來源于家蠶蛾的殼寡糖裂解性(chitooligosaccharidolytic)β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(SWISSPROT P49010)有同一性的EST翻譯用實(shí)施例4的方法鑒定。實(shí)施例6用帶有葡聚糖酶全長cDNA，內(nèi)切殼多糖酶及外切殼多糖酶部分cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌從實(shí)施例5中選出2個(gè)F.venenatum葡聚糖酶克隆，1個(gè)內(nèi)切殼多糖酶克隆和3個(gè)外切殼多糖酶克隆，這些克隆都是在pZErO-2載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)上。按實(shí)施例5所描述的方法，通過和GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的殼多糖酶和葡聚糖酶的序列進(jìn)行配對比較以確定這些克隆的同一性。從cDNA 5’端的初步的核苷酸序列(ESTs)中選出1個(gè)全長的葡聚糖酶克隆，1個(gè)內(nèi)切殼多糖酶cDNA克隆，3個(gè)外切殼多糖酶部分克隆中最長的一個(gè)用于進(jìn)一步的研究。
用電穿孔方法將大約5到10ng帶有上述3種cDNA的質(zhì)粒分別導(dǎo)入大腸桿菌宿主NM522株中。對每份50μl細(xì)胞(3.5×107/μg)，用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-Rad，Hercules，CA)在0.2cm間隙杯中用2500伏電壓進(jìn)行電穿孔。電穿孔后的細(xì)胞懸浮在1ml含有2％(w∶v)細(xì)菌培養(yǎng)用的蛋白胨，0.5％(w∶v)酵母提取物，0.05％(w∶v)氯化鈉，20mM葡萄糖，10mM氯化鎂及2.5mM氯化鉀的培養(yǎng)液中。將細(xì)胞在37℃放置60分鐘，以200-300rpm的速度搖動。取每份50到200μl的細(xì)胞涂布到含50μg/ml的硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板上。在37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)后，將長勢良好的細(xì)菌克隆轉(zhuǎn)移到一個(gè)新鮮的LB-卡那霉素平板上。從這個(gè)儲備平板上挑取單個(gè)克隆另外培養(yǎng)，用于質(zhì)粒DNA的分離提取。實(shí)施例7質(zhì)粒DNA的分離提取30ml含上述cDNA克隆的大腸桿菌在37℃振蕩培養(yǎng)16-18小時(shí)以進(jìn)行質(zhì)粒DNA的分離提取。所用的培養(yǎng)液是經(jīng)過修改的LB，含1.5％(w∶v)細(xì)菌培養(yǎng)用的蛋白胨，0.75％(w∶v)酵母提取物，0.75％(w∶v)氯化鈉，pH＝7.0，15mM Tris-Cl緩沖液，1.5mM氯化鎂及50μg/ml的硫酸卡那霉素。在4℃，8000xg離心10分鐘以收集細(xì)胞。根據(jù)Qiagen Plasmid Midi試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)的使用說明分離質(zhì)粒DNA，用QIAprep 8試劑盒和QIAvacManifold-6S(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)從1.5ml的培養(yǎng)液中分離提取質(zhì)粒DNA。實(shí)施例8用限制性內(nèi)切酶處理鑒定cDNA克隆用Lasergene軟件程序EditSeq和MapDraw(DNASTAR，Inc，Madison，WI)分析初步核酸序列(ESTs)資料以確定限制性酶識別位點(diǎn)的存在。使用能夠在一條或多條cDNA編碼序列中或在pZErO-2的多接頭區(qū)中進(jìn)行裂解的限制性酶。按照酶制造商的使用說明，用ApaI，BamHI，EcoR I或Kpn I在總體積15μl溶液中酶切按實(shí)施例7所述方法制備的DNA(大約0.5-1μg)。酶切產(chǎn)物在含40mM TRIS乙酸、pH 8.2，1mM EDTA的1％的瓊脂糖中分離，溴化乙錠溶液染色(約1μg/ml)。用紫外光源(UVT 400-M transilluminator，IBIKodak，Rochester，NY)照射以顯色觀察。結(jié)果如下表1所示表1
實(shí)施例9葡聚糖酶全長cDNA克隆、內(nèi)切殼多糖酶及外切殼多糖酶部分cDNA克隆的核苷酸序列確定及序列分析。
一個(gè)葡聚糖酶cDNA克隆，內(nèi)切殼多糖酶cDNA克隆，以及最長的外切殼多糖酶cDNA克隆被挑選出來進(jìn)行更嚴(yán)格的、雙鏈核苷酸序列的測定。用改進(jìn)的Sanger法(1977)，根據(jù)ABI Prism BigDyeTM終止物循環(huán)測序現(xiàn)成反應(yīng)試劑盒(Perkin Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City CA)對每個(gè)cDNA進(jìn)行測序，它的反應(yīng)體系是總體積為20μl，其中質(zhì)粒DNA用量為2μl、250-600ng，BigDye Terminator混合物8μl，引物1μl(4μM)。PCR在PTC-100可編程熱調(diào)節(jié)器(MJ research，Watertown，MA)中進(jìn)行(25個(gè)循環(huán)96℃ 30秒，50℃ 15秒，60℃ 4分鐘)。使用通過含有50mg(干重)用水吸收的、DNA級sephadex G-50 Fine(Amersham Pharmacia，Biotech AB，Uppsala，瑞典)的柱子的方法，從未標(biāo)記熒光的雙脫氧核苷酸中富集有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。這些克隆和其他DNA模板序列資料都是用ABI Prism 310基因分析儀獲得的。使用下面的條件可以得到最好的結(jié)果注射時(shí)間是45秒，注射的電壓是3kV，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間是90-120分鐘，運(yùn)轉(zhuǎn)電壓為15kV，溫度是42℃，用Seq POP6(1ml)E模塊。用ABI Prism 310基因分析儀的數(shù)據(jù)收集軟件1.0.2版(PerkinElmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City CA)進(jìn)行序列數(shù)據(jù)的組裝和校對。
插入到pZErO質(zhì)粒中的cDNA的5’和3’端的核苷酸序列通過使用引物M13F(5’GTAAAACGACGGCCAG)和M13R(5’AGCGAATAACAATTTCACACAGGA)而獲得。另外的序列用是通過引物步行而獲得的。為這個(gè)目的而合成的引物有用于葡聚糖酶cDNA的902A和902B；用于內(nèi)切殼多糖酶克隆的958A-D；用于外切殼多糖酶克隆的1082 A-D，如表2所示。葡聚糖酶cDNA有1023bp。未修飾的葡聚糖酶cDNA的全長見SEQ ID NO1。瓊脂糖凝膠電泳測定表明內(nèi)切殼多糖酶未修飾的部分cDNA是1290bp，外切殼多糖酶未修飾的部分cDNA是1390bp。
用BLASTN和BLASTX算法(Altschul等，1997)將序列和GenBank數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。F.venenatum葡聚糖酶部分cDNA序列顯示它與來自粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的1，3-β-葡糖苷酶的基因(Accession Number Z99126)有60％-70％的氨基酸序列同一性。葡聚糖酶cDNA是全長序列，它的ATG起始密碼子的位置和觀察到的粟酒裂殖酵母基因的ATG的位置基本相同。F.venenatum內(nèi)切殼多糖酶部分cDNA片段和來自粗球孢菌的殼多糖酶抗原(編號U33265，Yang等，Infect.Immun.，641992-1997(1996))有70％-80％的氨基酸序列同一性。外切殼多糖酶部分cDNA序列的片段和來自Trichoderma harzianum的外切殼多糖酶基因(AccessionNumber S800069，Draborg等，Biochem.Mol.Biol.Int.36781-791(1995))有80％的氨基酸序列同一性。根據(jù)與在數(shù)據(jù)庫搜索中識別出的序列進(jìn)行的比較以及根據(jù)內(nèi)切和外切殼多糖酶cDNA序列缺乏候選的5’ATG起始密碼子，證明它們都是部分序列。
表2 用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)的引物名稱 目的靶DNA 序列(5’至3’)128 外切殼多糖酶PCRλgt11 TCCTGGAGCCCGTCAGTATCGG產(chǎn)物5’端測序 克隆載體129 外切殼多糖酶5’ λgt11 TGGCTGAATATCGACGGTTTCC部分PCR擴(kuò)增克隆載體410 內(nèi)切殼多糖酶PCRpZERO-2ATTTAGGTGACACTATAG產(chǎn)物5’端測序 克隆載體720 內(nèi)切殼多糖酶5’ pZero-2CAGGACAGGAAACAGCTATGACC部分PCR擴(kuò)增克隆載體902A 葡聚糖酶cDNA 葡聚糖酶 CTATCAAGCAGCACGG測序，正向 cds902B 葡聚糖酶cDNA 葡聚糖酶 CTGGAAGGTCTTGAGGC測序，反向 cds958A 殼多糖酶cDNA 內(nèi)切殼多糖酶 GATATCGATTGGGAGTACC測序，正向 cds958B 殼多糖酶cDNA 內(nèi)切殼多糖酶 CATGGTACGTGACTGAGG
測序，反向 cds958C 殼多糖酶cDNA 內(nèi)切殼多糖酶 CAACCCTCAGTCACGTAC測序，正向 cds958D 殼多糖酶cDNA 內(nèi)切殼多糖酶 CCTCGTTGGCATCCTG測序，反向 cds1003 外切殼多糖酶5’ 外切殼多糖酶 AGATCCTTATAGGCAAGCTCAACGACACCG部分PCR擴(kuò)增 cds1009 外切殼多糖酶 外切殼多糖酶 CATAAATACCGGCAAGATCCPCR產(chǎn)物5’測序 基因5’部分1010 內(nèi)切殼多糖酶 內(nèi)切殼多糖酶 ATCGATATCTATACCGTCAAAACCG5’部分PCR擴(kuò)增 cds1011 內(nèi)切殼多糖酶 內(nèi)切殼多糖酶 ATCGATATCTATACCGTCAAAACCGPCR產(chǎn)物5’測序 cDNA 5’部分1014 葡聚糖酶基因組 pFSC22-2 ATCTGCTGGGCGAGCTTC片段測序1015 葡聚糖酶基因組 pFSC22-2 CAGAAACCACTGGCATCC片段測序1016葡聚糖酶基因組pFSC22-2 AAGTTCGGCCTTACTTGC片段測序1017葡聚糖酶基因組pFSC22-2 CTTTGGGCTCGTATTCAC片段測序1018葡聚糖酶基因組pFSC22-2 CTTCAGCACTCTCAGCAC片段測序1021葡聚糖酶基因組pFSC22-2 GGACTGAGGGAGTGTTGGTTC片段測序1023葡聚糖酶基因組pFSC22-2 TCTACCCTACAACACTCATC片段測序1038葡聚糖酶基因組pFSC22-2 GTCGATCATGGTGGAAAG片段測序1040葡聚糖酶基因組pFSC22-2 TGTCCCTGTTACTAACGG片段測序1042葡聚糖酶基因組pFSC22-2 TAGTCGCCTTTCTAAGCC片段測序1047外切殼多糖酶PCR外切殼多糖酶 AAGAATGCCTCGATGAGGGTACTCG產(chǎn)物5’測序基因5’部分1048外切殼多糖酶PCR外切殼多糖酶 ATCTCACTCACCTCACCTC產(chǎn)物5’測序基因5’部分1082A 殼多糖酶cDNA 外切殼多糖酶 CCGGTATTTATGAGTATGG測序，正向 cds1082B 殼多糖酶cDNA 外切殼多糖酶 GATAGTCTCAGTCCATACGG測序，反向 cds1082C 殼多糖酶cDNA 外切殼多糖酶 GTACCTTGACTGTGGGC測序，正向 cds1082D 殼多糖酶cDNA 外切殼多糖酶 GGAAATGCGAGGGAAG測序，反向 cdsENDO 3’ 起始密碼子前后序列 內(nèi)切殼多糖酶 AGATCTCGCCTCAATTGTCCGGGAACC修飾 基因ENDO 5’ 起始碼子前后序列 內(nèi)切殼多糖酶 GGATCCAACACCACGCGATGGGTGGTGGA修飾 基因EXO 3’ 起始密碼子前后序列 外切殼多糖酶 AGATCTGCGTCAAATTTATCATCCCTCG基因EXO 5’ 起始密碼子前后序列外切殼多糖酶GGATCCACCAACCAGCGATGTGGTCCAAG修飾 基因GCTCTTCTGGCCGTTGFVEN B1 PCR擴(kuò)增泛素-內(nèi)部殼內(nèi)切殼多糖酶GCTTCATGCAACCGTACAAGTTGG多糖酶基因融合物 cdsFVEX B1 PCR擴(kuò)增泛素-外部殼外切殼多糖酶CGACTTCACCCACTGCTTCTTTTGC多糖酶基因融合物 cdsFVGLU B1 PCR擴(kuò)增泛素-葡聚糖葡聚糖酶CCCAGACGCCAACAAGGATCTTC酶基因融合物 cdsGLUC 3’ 起始密碼子前后序列葡聚糖酶AGATCTGGCTTAGCAAGTAAGGCTGAAC修飾 基因GLUC 5’ 起始密碼子前后序列葡聚糖酶GGATCCACCAACCAGCGATGAAGTTCTTCA修飾 基因GCACTCTTAGCGlucgene-1 葡聚糖酶基因組pFSC22-2GTACTGGGTTGGTGAGAC片段測序Glucgene-2 葡聚糖酶基因組pFSC22-2CCATTCCAAGACCAGGC片段測序NOS A跨轉(zhuǎn)基因-NOS融合 NOS 3’UT CCCATCTCATAAATAACGTC
邊界測序UBI 1A跨泛素-轉(zhuǎn)基因融合泛素啟動子 CCTGCCTTCATACGCTAT邊界測序UBI A2PCR擴(kuò)增泛素-轉(zhuǎn)基因 泛素啟動子 CCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGC融合物UBI 1B啟動子中突變BglII泛素啟動子 GACACCAACCAGCGAACCA位點(diǎn)測序UBI 1E用定點(diǎn)突變?nèi)コ? 泛素啟動子 CACACACAACCAGATTTCCCCCAAATCCACC啟動子的BglII位點(diǎn)UBI 1F用定點(diǎn)突變?nèi)コ? 泛素啟動子 GGTGGATTTGGGGGAAATCTGGTTGTGTGTG啟動子的BglII位點(diǎn)實(shí)施例10編碼葡聚糖酶和內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶基因5’端的擬分枝孢鐮孢基因組DNA片段的分離和測序。
葡聚糖酶。按照實(shí)施例9的方法，從pFSC22-2質(zhì)粒克隆中獲得編碼葡聚糖酶的擬分枝孢鐮孢基因組片段的核苷酸序列。用于測序的引物是1014，1015，1016，1017，1018，1021，1023，1038，1040，1042，Glucgene-1和Glucgene-2(表2)。如實(shí)施例9所述對序列進(jìn)行校對和組裝。
內(nèi)切殼多糖酶。從0.5μg擬分枝孢鐮孢cDNA文庫中用PCR方法擴(kuò)增獲取內(nèi)切殼多糖酶cDNA的5’端(圖2)，所用的引物是1010(來自內(nèi)切殼多糖酶EST)和720(來自pZERO-2序列，作為M13反向引物)。1010/720反應(yīng)的PCR條件是94℃，30秒(第一個(gè)循環(huán)為1分鐘)；52℃，25秒；72℃，60秒，25個(gè)循環(huán)。在用瓊脂糖凝膠分離后，純化該P(yáng)CR產(chǎn)物。內(nèi)切殼多糖酶的PCR產(chǎn)物的核酸序列資料是用410和1011引物獲得的，其中410和克隆載體pZERO-2(Invitrogen)的SP6啟動子相對應(yīng)，1011和內(nèi)切殼多糖酶cDNA相對應(yīng)。1011/410循環(huán)測序反應(yīng)的PCR條件是94℃，30秒(第一個(gè)循環(huán)為1分鐘)；52℃，25秒；72℃，50秒，25個(gè)循環(huán)。注意1011/410反應(yīng)利用內(nèi)部引物以減少PCR初始反應(yīng)的非特異性擴(kuò)增。
外切殼多糖酶。如Huynh等1984所述，在Lambda噬菌體λgt11中構(gòu)建擬分枝孢鐮孢的基因組文庫。從擬分枝孢鐮孢文庫(20μl反應(yīng)中有0.5μg的DNA)中擴(kuò)增外切殼多糖酶基因的5’部分(圖3)。所用的引物是與位于λgt11克隆載體EcoRI酶切位點(diǎn)上游的序列相對應(yīng)的129引物(Huynh等1984)，以及和外切殼多糖酶cDNA相對應(yīng)的1003引物。129/1003反應(yīng)的PCR條件是94℃，30秒(第一個(gè)循環(huán)為1分鐘)；52℃，25秒；72℃，135秒，25個(gè)循環(huán)。通過瓊脂糖凝膠純化所得到的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物的核苷酸序列資料(外切殼多糖酶基因的5’部分)是用128和1009引物獲得的，128引物是和位于λgt11克隆載體EcoRI酶切位點(diǎn)上游的序列相對應(yīng)的，1009引物是和外切殼多糖酶cDNA相對應(yīng)的。128/1009循環(huán)測序反應(yīng)的PCR條件是94℃，30秒(第一個(gè)循環(huán)為1分鐘)；52℃，25秒；72℃，50秒，共25個(gè)循環(huán)。注意第二個(gè)PCR反應(yīng)(128/1009)利用內(nèi)部引物以減少初始PCR反應(yīng)的背景。實(shí)施例11全長內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶cDNA序列的組裝用視覺檢測及用MapDraw軟件(DNASTAR，Inc，Madison，WI)分析可讀框的方法檢測部分cDNA的核苷酸序列和對應(yīng)的5’端PCR產(chǎn)物的重疊部分。直接從部分cDNA序列和5’端cDNA PCR產(chǎn)物的序列組合構(gòu)建擬分枝孢鐮孢外切殼多糖酶全長序列。這個(gè)全長外切殼多糖酶cDNA代表擬分枝孢鐮孢5’基因組序列毗連到F.venenatum部分cDNA序列所形成的合成物。外切殼多糖酶信息轉(zhuǎn)錄的開始點(diǎn)被假定為緊接著推定的TATAA共有元件的第一個(gè)A核苷酸。實(shí)施例12含有經(jīng)過修飾的起始密碼子前后序列的全長cDNA的產(chǎn)生用PCR擴(kuò)增的方法獲得了帶有富含AC堿基的5’非翻譯區(qū)的930bp全長葡聚糖酶cDNA。PRC擴(kuò)增反應(yīng)體系是50ng經(jīng)EcoRI酶切的葡聚糖酶質(zhì)粒DNA，0.4uM GLUC 3’和GLUC 5’引物(表2)，0.2uM各種脫氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，TTP)，及1個(gè)單位的Elongase(Gibco BRL，Rockville，MD)，在總共50μl的緩沖液(60mM TRIS硫酸鹽，PH 9.1，18mM的硫酸銨，1mM的硫酸鎂)中進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)在92℃ 30秒，57℃30秒，68℃ 60秒進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后是25個(gè)循環(huán)92℃ 30秒，62℃ 30秒，68℃ 60秒。
用PCR方法對基因組DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶的全長cDNA，所用的引物分別是ENDO3’加ENDO 5’引物，或EXO3’加EXO 5’引物(表2)。產(chǎn)生內(nèi)切殼多糖酶全長cDNA的最后一步是在100μl反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，所用的引物是ENDO5’和ENDO3’，各32pmol。用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)對F.venenatum cDNA文庫“A”(大約0.5礸)進(jìn)行的擴(kuò)增是按照制造商使用說明在Pfu緩沖液中完成的。擴(kuò)增的條件是94℃ 30秒(第一個(gè)循環(huán)1分鐘)；56℃ 25秒；72℃ 150秒，25個(gè)循環(huán)。所用的儀器是PE 2400熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)。所獲得的片段分別按實(shí)施例6和17中所述的方法克隆到細(xì)菌和單子葉植物表達(dá)載體中。
PCR擴(kuò)增外切殼多糖酶全長cDNA是在100μl反應(yīng)體系中完成的，所用的引物是EXO5’和EXO3’，各32pmol。按制造商的使用說明，在Pfu緩沖液中用Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)完成F.venenatum cDNA文庫“A”(約0.5μg)的擴(kuò)增。所用的儀器是PE 2400熱循環(huán)儀(Perkin Elmer)。PCR的條件是94℃ 30秒(第一個(gè)循環(huán)1分鐘)，56℃ 25秒，72℃ 150秒，25個(gè)循環(huán)。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化后，分別按實(shí)施例6和18中所述的方法克隆到細(xì)菌和單子葉植物表達(dá)載體中。
用瓊脂糖凝膠分離方法將cDNA片段從未整合的引物及其他的PCR產(chǎn)物中分離出來(實(shí)施例8)。具有所需要的片段大小的PCR產(chǎn)物(葡糖聚酶是930bp，內(nèi)切殼多糖酶是1240bp，外切殼多糖酶是1780bp)用干凈的剃刀片從膠中切下。然后按推薦的方法用硅珠(GENECLEAN Spin Kit，BIO 101，Inc，CA)吸附來從膠中回收片段。用水從硅基質(zhì)中洗脫cDNA片段，保存在-80℃，用于下一步的克隆實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例16-18)。實(shí)施例13單子葉植物表達(dá)載體pUBKBgl II-的構(gòu)建用QuikChangeTM定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)和使用說明，將pUBK的Ubi-1啟動子區(qū)的Bgl II限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)去除。將pUBK質(zhì)粒DNA懸浮到下列反應(yīng)混合物中125ng引物UBI 1E(表2)，125ng引物UBI 1F(表2)，每種脫氧核苷酸各10mM，2.5單位Pfu聚合酶，在總共50μl 20mM的TRIS鹽酸，pH 8.0，10mM氯化鉀，6mM的硫酸銨，2mM的硫酸鎂，0.1％ Triton X-100，10μg/ml的牛血清白蛋白中。PCR反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀(PerkinElmer Cetus，目前在Foster City，CA)中進(jìn)行，擴(kuò)增條件是96℃ 30秒，55℃ 25秒，68℃ 13分鐘，16個(gè)循環(huán)。得到的擴(kuò)增產(chǎn)物用10個(gè)單位的Dpn I限制性內(nèi)切酶在37℃酶切1小時(shí)。將1μl DpnI酶處理后的PCR混合物和大腸桿菌XL1-Blue宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞在冰上孵育30分鐘，立即轉(zhuǎn)移到42℃的水浴中放置45秒，再到放置冰上2分鐘。細(xì)胞懸浮到0.5ml含1％(w∶v)NZ胺，0.5％(w∶v)酵母提取物，0.5％(w∶v)氯化鈉，20mM葡萄糖，12.5mM氯化鎂，及12.5mM硫酸鎂的液態(tài)培養(yǎng)基中。以225rpm的速度在37℃振蕩孵育1小時(shí)。用1700xg的速度在4℃離心3分鐘以濃縮細(xì)胞，然后將細(xì)胞涂布到含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB瓊脂平板上。
顯示能在LB-卡那霉素平板上生長的細(xì)菌菌落被培養(yǎng)在1.5ml含卡那霉素的LB液中，以便按實(shí)施例7所述的方法分離提取質(zhì)粒DNA。將該質(zhì)粒DNA用Bgl II限制性酶處理，并按實(shí)施例8所述在瓊脂糖凝膠上觀察酶切產(chǎn)物。觀察到一個(gè)單一的片段，這表明在pUBK上的兩個(gè)Bgl II位點(diǎn)中的一個(gè)已經(jīng)在經(jīng)過誘變處理的質(zhì)粒中被除去了?？鐝酵蛔兾稽c(diǎn)的Ubi-1啟動子區(qū)部分的核苷酸序列資料是按實(shí)施例9所述的方法獲得的，使用的是UBI 1B引物(表2)。除了將AGATCT(BglII位點(diǎn))轉(zhuǎn)變成AGATTT以外，還注意到Ubi-1啟動子一部分的296p重復(fù)(見圖5)。
經(jīng)過誘變的質(zhì)粒進(jìn)一步被BamH I+Bgl II，Pst I和Pvu II限制性內(nèi)切酶所處理，使用的是制造商推薦的方法，酶切產(chǎn)物按照實(shí)施例8所述的方法在瓊脂糖凝膠上顯色觀察。經(jīng)過誘變的質(zhì)粒缺失了大約0.7kb的DNA，這段DNA存在于定點(diǎn)誘變前的pUBK上。為了修補(bǔ)這個(gè)缺失，用Hind III和BamH I限制性內(nèi)切酶從經(jīng)過誘變處理的質(zhì)粒上切下一段2.0kb的部分，然后將其連接到已經(jīng)切除了天然的Hind III-BamH I片段的pUBK質(zhì)粒上。連接反應(yīng)大約在10μl50mM Tris鹽酸，pH 7.8，10mM氯化鎂，10mM二硫蘇糖醇，2mM ATP，50μg/ml牛血清白蛋白中含有50ng 2.0kb片段，50ng pUBK載體，0.5單位T4連接酶。反應(yīng)在15℃孵育17小時(shí)。電感受態(tài)(electrocompetent)大腸桿菌NM522細(xì)胞在存在1μl連接混合物的情況下接受電穿孔，并進(jìn)一步被按照實(shí)施例6的方法進(jìn)行處理。六個(gè)抗卡那霉素的細(xì)菌菌落被分別培養(yǎng)在1.5 ml LB-卡那霉素培養(yǎng)液中，以便按照實(shí)施例7所述的方法分離提取質(zhì)粒。正如預(yù)期的那樣，這些質(zhì)粒在用Hind III+BamH I消化后給出4.5kb和2.0kb片段，用Bgl II處理后給出大約6.6kb的單一片段。一個(gè)被稱作單子葉植物表達(dá)載體的質(zhì)粒被選擇出來以進(jìn)行下面的克隆實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例14小麥器官中修飾的Ubi-1啟動子的活性為了測定突變后的Ubi-1啟動子的活性，用攜帶突變區(qū)的2.0kb的HindIII-BamHI片段(實(shí)施例13)替換攜帶有Ubi-1-β-葡萄糖醛酸糖苷酶基因(uidA)融合物的質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)區(qū)，使得GUS報(bào)告基因處于修飾后的Ubi-1啟動子的調(diào)控之下。按照實(shí)施例19中描述的步驟，將該質(zhì)粒導(dǎo)入普通小麥(Triticum aestivum)(小麥)的胚中。測定uidA轉(zhuǎn)基因系中小花器官的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)活性。
攜帶至少一個(gè)Ubi∷uidA轉(zhuǎn)基因拷貝的轉(zhuǎn)基因小麥全穗通過用70％的乙醇處理5分鐘，20％(v/v)漂白劑處理15分鐘進(jìn)行表面消毒。全穗用滅菌水沖洗4到5次，滅菌水或者是被高壓消毒過的，或者是通過0.2微米Millipore濾膜過濾的。在無菌工作臺中解剖小花，這樣將穎片、外稃、內(nèi)稃、發(fā)育的種子和花藥分開。小花器官立即浸入含有10mM磷酸鈉緩沖液，pH7，0.5mM亞鐵氰化鉀，0.5mM鐵氰化鉀，0.5％(w∶v)Triton X-100，330μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸的底物溶液中(Jersey Lab and Glove Supply，Livingston，NJ)。黑暗中孵育16-20小時(shí)，棄底物溶液。植物材料用pH 7的0.1M磷酸鈉緩沖液漂洗兩次。相繼浸入70％，80％和90％乙醇溶液，每種溶液20-24小時(shí)，除去綠色組織中的葉綠素和其他色素。用90％乙醇重復(fù)處理直至組織變?yōu)榘胪该骱徒诪橹?。在小麥的發(fā)育中的種子和花粉中出現(xiàn)的深藍(lán)色色素表明GUS基因的活性，證明修飾的Ubi-1啟動子在這些器官有活性。在穎片、外稃和內(nèi)稃的含四葉綠素的細(xì)胞或組織中也檢測到GUS的活性。在冠毛或花藥中沒有看到GUS的活性。實(shí)施例15將修飾過的全長cDNAs導(dǎo)入細(xì)菌克隆載體代表葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶、外切殼多糖酶的全長cDNA片段并帶有富含AC的5’非翻譯區(qū)序列15到16個(gè)堿基的PCR產(chǎn)物連接進(jìn)入pCR2.1載體(Invitrogen，Carlsbad，CA；用于葡聚糖酶)或Bluescript載體pBKS+(Stratagene，La Jolla，CA；用于內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶)中。如實(shí)施例13所描述進(jìn)行連接，其中使用預(yù)先用Smal限制性酶切割的大約50-100ng細(xì)菌載體DNA和60ng的PCR產(chǎn)物。按照實(shí)施例6所述轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522宿主細(xì)胞(對葡聚糖酶)或者DH5-α宿主細(xì)胞(對內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶)。在含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板上篩選轉(zhuǎn)化體。
為了利于鑒別含有內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶cDNAs的轉(zhuǎn)化體，采用了菌落印跡雜交的方法(Sambrook等，1989)。羧芐青霉素抗性的菌落按有序陳列轉(zhuǎn)移到新鮮瓊脂板上和LB-羧芐青霉素瓊脂上覆有一張Hybond N+尼龍膜(Amersham)的直徑82厘米的圓盤上。轉(zhuǎn)移的菌落在37℃生長16-18小時(shí)。沾有菌落的尼龍圓盤被置于一張用0.5N氫氧化鈉、1.5M氯化鈉浸泡的3MM(Whatman)濾紙上5分鐘，在干凈的紙上簡單吸干，然后轉(zhuǎn)移到用pH7.0，0.5M TRIS-Cl，3M氯化鈉浸泡的紙上5分鐘。菌落圓盤浸入2×SSC(0.3M氯化鈉，0.03M檸檬酸鈉，pH7.0)中10分鐘，并以60-70轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩，使細(xì)菌碎片分散，再在新鮮的2× SSC中漂洗，空氣中干燥。菌落圓盤置于Hybaid雜交爐(National Labnet，Woodbridge，NJ)內(nèi)玻璃管的20ml雜交液中，雜交液組成為5×SSC，0.1％(w∶v)十二烷基肌胺酸鈉，0.02％(w∶v)十二烷基硫酸鈉和封閉試劑(BoehringerMannheim)，65℃孵育17到18小時(shí)。菌落圓盤轉(zhuǎn)移到10ml含有20-25ng熱變性的探針的新鮮雜交液中，在雜交爐中65℃孵育16到20小時(shí)。在終體積20μl體系中，用約100ng內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶PCR產(chǎn)物和4μl DIG HighPrime Mix，37℃孵育16到20小時(shí)，制備地高辛配基標(biāo)記的雜交探針(Boehringer Mannheim)。在0.5M氯化鋰和2.5倍體積95％或100％乙醇中，-80℃ 20分鐘沉淀探針DNA，去除未整合的標(biāo)記。探針DNA重懸于水中，以備雜交溶液中使用。在雜交管中按照下列程序洗雜交膜50ml 2×SSC，0.1％ SDS室溫洗5分鐘兩遍，50ml的0.5×SSC，0.1％ SDS，65℃洗25分鐘兩遍。膜轉(zhuǎn)移到到1升的燒杯中，室溫下以70到75轉(zhuǎn)/分的速度與下列溶液孵育100ml 0.1M順丁烯二酸，0.15M氯化鈉，pH7.5，0.3％(v∶v)Tween 20；100ml 0.1M順丁烯二酸，0.15M氯化鈉，pH7.5和0.1倍體積封閉液，30分鐘；40ml 0.1M順丁烯二酸，0.15M氯化鈉，pH7.5，0.1倍體積封閉液和4μl抗-DIG-AP偶聯(lián)物(Boehringer Mannheim)；100ml 0.1M順丁烯二酸，0.15M氯化鈉，pH7.5，0.3％(v∶v)Tween 20洗兩遍，每次15分鐘；40ml 0.1MTRIS-Cl，pH9.2，0.1M氯化鈉，5分鐘。膜上與地高辛雜交的菌落可以用CSPD試劑(Boehringer Mannheim)檢測，隨后在XAR 5型科學(xué)成象膠片上曝光(柯達(dá)，Rochester，NY)。
候選的葡聚糖酶cDNA克隆用BamHI+BglII，EcoRI或EcoRV處理；候選的內(nèi)切殼多糖酶cDNA克隆用BamHI，BglII，和BamHI+BglII處理；候選的外切殼多糖酶cDNA克隆用BamHI，BglII，BamHI+BglII，Clal，和Xhol處理。限制性酶消化后的帶型表明所有的三個(gè)cDNAs以兩種方向克隆進(jìn)細(xì)菌質(zhì)粒載體中，而且每種cDNA都加上了BamHI和BglII位點(diǎn)。
為了要證實(shí)PCR反應(yīng)和克隆的忠實(shí)性，按照實(shí)施例9所述，每種cDNA兩條鏈的核苷酸序列通過自動熒光測序獲得(見SEQ ID NOS.16，18，和20)。按第三部分所述的方法分析cDNA的雙鏈序列以確定限制性位點(diǎn)的存在，并利用BLASTX分析與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列的匹配。實(shí)施例16將修飾過的全長葡聚糖酶cDNA導(dǎo)入單子葉植物表達(dá)載體之中核苷酸序列與原始的cDNAs具有同一性的經(jīng)PCR修飾過的cDNAs被導(dǎo)入單子葉植物表達(dá)載體pUBKBglII-中，以用于小麥轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。該單子葉植物表達(dá)質(zhì)粒載體用BamHI和BglII限制酶完全酶切。pUBKBglII-質(zhì)粒載體DNA按照實(shí)施例8所述方法在瓊脂糖上分離純化。
選擇葡聚糖酶編碼序列的5’端插在pCR2.1上T7啟動子和M13正向引物位點(diǎn)近端的葡聚糖酶克隆，以構(gòu)建修飾過的葡聚糖酶cDNA。在pCR2.1上用BamHI限制酶部分酶切修飾過的葡聚糖酶cDNA，程序如下在1.5ml錐形底管中，25μg葡聚糖酶質(zhì)粒DNA重懸于125μl含有150mM氯化鈉，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化鎂，1mM二硫蘇糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白的溶液中。每份30μl混合液分到其他2管中。在留有混合液的第一管中，加入10個(gè)單位BamHI酶，徹底混合。然后，取30μl質(zhì)粒-限制酶混合液加到30μl質(zhì)粒混合液而不含BamHI酶的管中，并徹底混合。獲得的溶液將BamHI酶稀釋了2倍。用第2管質(zhì)?；旌弦?沒有BamHI酶)相繼稀釋酶混合液，直至酶稀釋為約1∶4。所有3管在37℃孵育85分鐘?？梢栽?％瓊脂糖凝膠上看到代表部分BamHI酶切產(chǎn)物的4個(gè)不同DNA片段。在含有1∶4稀釋的BamHI酶的酶切混合物中，取約6到8μg質(zhì)粒DNA在1％瓊脂糖上分開。從瓊脂糖凝膠切下約1kb帶有修飾過的葡聚糖酶cDNA的片段，并按照實(shí)施例12所述的硅珠法純化。
約36ng葡聚糖酶cDNA片段和220ng用BamHI和BglII消化的pUBKBglII-載體DNA在10μl體系中15℃連接22小時(shí)。2μl連接產(chǎn)物按照實(shí)施例6所述方法用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α宿主菌。選擇可以生長在含有50μg/ml卡那霉素的LB瓊脂上的細(xì)菌菌落。按照實(shí)施例7所述，從1.5ml液體培養(yǎng)物中制備細(xì)胞。質(zhì)粒DNA和pUBKBglII-DNA在1％瓊脂糖上分離約1小時(shí)，電壓69V。在瓊脂糖凝膠中顯示遷移較慢的質(zhì)粒進(jìn)一步用BamHI+BglII或BamHI限制酶處理。相對于Ubi-1啟動子，修飾過的葡聚糖酶cDNA正向插入可以得到一個(gè)0.55kb大小的BamHI片段，不同于反向插入的cDNA所產(chǎn)生的0.39kb的BamHI片段。
選擇數(shù)個(gè)代表不同方向的克隆，并通過核酸測序確認(rèn)。用引物UBI 1A(見表2)測定Ubi-1啟動子-葡聚糖酶基因融合物(Ubi∷Glu)接合區(qū)的序列；用引物NOS A(見表2)測定葡聚糖酶基因-NOS終止子融合物(GluNOS)序列。并給出代表正向和反向克隆的修飾過的葡聚糖酶cDNA序列。正向插入序列中，Ubi-1連接區(qū)的BamHI位點(diǎn)位于cDNA的5’末端(圖6)。BglII位點(diǎn)和含有EcoRI位點(diǎn)的pCR2.1多接頭區(qū)47個(gè)堿基DNA均位于3’端。在反義方向，位于Ubi-1-cDNA連接區(qū)的BamHI位點(diǎn)后面接著47bp的pCR2.1多接頭區(qū)(含一個(gè)EcoRI位點(diǎn))，然后是位于修飾過的葡聚糖酶cDNA 3’端的BglII位點(diǎn)。(圖7)。反向版本還在cDNA-NOS終止子連接區(qū)包含一個(gè)無功能的嵌合BamHI-BglII位點(diǎn)。實(shí)施例17將修飾過的全長內(nèi)切殼多糖酶cDNA導(dǎo)入單子葉植物表達(dá)載體修飾過的全長內(nèi)切殼多糖酶cDNA來自如下克隆，該克隆中編碼區(qū)5’端接近pBKS+質(zhì)粒的T7啟動子位點(diǎn)。用30個(gè)單位BamHI和30單位BglII限制酶完全酶切約4μg質(zhì)粒DNA，反應(yīng)體系50μl，含150mM氯化鈉，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化鎂，1mM二硫蘇糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白。根據(jù)實(shí)施例12的方法，利用硅珠分離在瓊脂糖凝膠中回收cDNA片段。按照實(shí)施例13的方法，連接90ng cDNA片段和440ng用BamHI和BglII消化的pUBKBglII-，連接體系15μl。用3μl連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5-α細(xì)胞(見實(shí)施例6)，在37℃，存在50μg/ml硫酸卡那霉素的條件下生長。從候選的卡那霉素抗性克隆中抽提質(zhì)粒DNA。在瓊脂糖凝膠中遷移比pUBKBglII-慢的質(zhì)粒用BamHI和BglII限制酶切開。某些(正向)克隆中可以看到一個(gè)約1.2kb片段。反向克隆預(yù)期沒有被BamHI+BglII切開的質(zhì)粒。
用引物UBI 1A(見表2)測定部分克隆的Ubi-1啟動子-內(nèi)切殼多糖酶cDNA融合連接區(qū)的序列；用引物NOS A(見表2)測定內(nèi)切殼多糖酶cDNA-NOS終止子融合物的序列。在pUBKBglII-中cDNA代表性有義和反義方向分別如圖8和9所示。內(nèi)切殼多糖酶的有義克隆包含有位于Ubi-1-編碼序列連接區(qū)的BamHI限制位點(diǎn)和cDNA-NOS連接區(qū)的BglII限制位點(diǎn)。內(nèi)切殼多糖酶反義克隆中不存在BamHI和BglII位點(diǎn)。實(shí)施例18將修飾過的全長外切殼多糖酶cDNA導(dǎo)入單子葉植物表達(dá)載體為獲得修飾過的外切殼多糖酶cDNA，選擇外切殼多糖酶的如下克隆，其中外切殼多糖酶編碼序列的5’端接近pBKS+的T3引物位點(diǎn)。用20個(gè)單位BamHI處理約3μg質(zhì)粒DNA，終體積30μl，含有150mM氯化鈉，10mM TRIS-Cl，pH7.9，1mM氯化鎂，1mM二硫蘇糖醇和100μg/ml牛血清白蛋白。在37℃消化90分鐘。按照實(shí)施例8的方法，從瓊脂糖凝膠中純化約2.0kb的cDNA片段。連接混合物中含有約60ng cDNA片段和220ng pUBK Bgl II-DNA(見實(shí)施例16)。大腸桿菌DH5-α轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)生和生長如實(shí)施例15所述。用UBI 1A和NOS A引物分析遷移速率比pUBKBglII-載體慢的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列(實(shí)施例9)，確定編碼序列在pUBKBglII-中的方向。其它的外切殼多糖酶克隆用菌落印跡程序鑒定(見實(shí)施例15)。pUBKBglII-中有義和反義插入的外切殼多糖酶cDNA的代表性序列分別如
圖10和11所示。外切殼多糖酶的有義克隆在Ubi-1-編碼序列連接區(qū)有一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)，在cDNA-NOS連接區(qū)有一個(gè)BglII限制位點(diǎn)。這些BamHI和BglII位點(diǎn)在外切殼多糖酶反義克隆中不存在。實(shí)施例19用真菌轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化小麥(普通小麥)采用Week等(1993)的方法將修飾過的全長cDNA克隆(在單子葉植物表達(dá)載體pUBKBglII-中)導(dǎo)入小麥，但進(jìn)行下述增改。在開花后約12到14天(dpa)，從普通小麥的Bobwhite品種的種子中切除胚，將胚盾片向上置于15mm×100mm碟子之上，碟子中含有30ml MMS培養(yǎng)基[4.3g/L Murashige & Skoog鹽混合物(Gibco BRL，Rockville，MD)，0.5mg/L鹽酸硫胺素，0.15g/L L-天冬酰胺，40g/L麥芽糖]，并用3.5g/L植物專用瓊脂(Phytagel)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)使其固化和補(bǔ)充2mg/L 2，4-D。將胚在25℃黑暗條件下培養(yǎng)5天，允許愈傷組織發(fā)育，然后轉(zhuǎn)移到15mm×60mm的碟子中，碟中含有20ml上述培養(yǎng)基并補(bǔ)充了0.35M甘露醇。在含有甘露醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)之后，每個(gè)碟子用0.7毫克、直徑1-2微米(平均直徑)的金顆粒(Bio-Rad，Hercules，CA)轟擊胚，金顆粒包被17.4μg pUBKBglII-和19.5μg的FvEndoS，或15.5μgpUBKBglII-和16.2μg FvGluS，或12.5μg pUBK和22.6μg FvExoS。第二天，胚胎發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)移到″MMS2″培養(yǎng)基上(MMS培養(yǎng)基中補(bǔ)充2mg/L 2，4-D，并且用2.5g/L植物專用瓊脂(Phytagel)固化)。每個(gè)碟子愈傷組織密度為20個(gè)(FvGluS)或者40個(gè)(FvEndoS和FvExoS)，在25℃避光培養(yǎng)二星期。然后在25℃黑暗中進(jìn)行選擇，持續(xù)兩個(gè)2周的時(shí)間，選擇在含MMS2并補(bǔ)充下列成分的碟子中進(jìn)行對于FvEndo，0或1mg/L bialaphos(Meiji Seika Kaisha Ltd，東京，日本)，然后2mg/L bialaphos；對于FvExoS，1或1.5mg/L，然后3mg/L bialaphos；對于FvGluS，1mg/L，然后2mg/L bialaphos。然后將存活的愈傷組織轉(zhuǎn)移到MMS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基用2.5g/LPhytagel固化并含有0.2mg/L 2，4 D和3mg/L bialaphos，光照條件下26℃培養(yǎng)6周。在那時(shí)形成的綠芽轉(zhuǎn)移到25mm×150mm試管中，試管中含有18ml生根培養(yǎng)基[2.15g/L Murashige & Skoog鹽混合物，0.25mg/L鹽酸硫胺素，0.075g/L L-天冬酰胺，20g/L麥芽糖，2.5g/L Phytagel]。試管在光照條件，26℃培養(yǎng)。形成芽的根轉(zhuǎn)移到土壤中(Sunshine mix #1)，光照條件下，以22℃在絲龍膜包被下培養(yǎng)1周。在培養(yǎng)的第二星期在絲龍膜上戳孔以降低濕度，并逐漸增加孔數(shù)。然后將植株移植到溫室中，保持23℃，補(bǔ)充光照為16/8小時(shí)的日/夜周期。在開花后約21天，從這些植物的種子上切下未成熟的胚，并在含有100ml用2.5g/L Phytagel固化的MMS培養(yǎng)基的品紅色盒子中過早地萌發(fā)。實(shí)施例20小麥系的轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定整合分析從小麥候選系的葉片中提取基因組DNA或總DNA以分析修飾過的全長葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶cDNA的穩(wěn)定整合。未轉(zhuǎn)化Bobwhite品種植物作為陰性對照。
基因組DNA的制備按照修改的d’Ovidio等的方法(1992)進(jìn)行。從植株中切除濕重為3到5克的健康葉組織，立即置于冰上，然后轉(zhuǎn)到液氮中，或者直接置于在液氮中。在抽提基因組DNA之前，葉片樣品通常在-80℃儲存。用冷的研缽和研棒將葉片組織在液氮中研碎。將研碎的粉末狀組織轉(zhuǎn)移到35-40ml的預(yù)冷的勻漿緩沖液中，緩沖液含有0.5M蔗糖，80mM氯化鉀，10mM TRIS-Cl，10mM EDTA，4mM精胺，1mM亞精胺，pH9.5，180mg/L苯甲磺酰氟(臨使用前加入)和0.1％(v∶v)β-巰基乙醇(使用前加入)。在冷的勻漿器中進(jìn)一步用3到4次5秒脈沖將葉組織勻漿。勻漿液經(jīng)過四層粗棉布過濾，隨后通過一層Miracloth過濾材料(Calbiochem，La Jolla，CA)。澄清的抽提物在4℃ 1000xg離心20分鐘。小心地棄去上清，含有核的沉淀用20到40毫升補(bǔ)加0.5％Triton X-100(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)的勻漿緩沖液洗兩次。洗過的核沉淀重懸于1ml緩沖液中，緩沖液含有50mM TRIS-Cl，pH 8，100mM EDTA，100mM氯化鈉和600μg蛋白酶K。另加入于65℃預(yù)熱的4ml不含蛋白酶K的緩沖液，勻漿液在65℃孵育30分鐘，而后室溫(23°-25℃)孵育30分鐘，隨后加入2.5ml酚(用TRIS緩沖液平衡，pH7.9)，徹底混合。在DNA-酚混合物于4℃放置12-16小時(shí)后，另加入2.5ml的氯仿，徹底混合。抽提物以4000xg室溫離心15分鐘。水相(上層)再用氯仿抽提兩次。室溫用0.1倍體積2.5M醋酸鈉，pH5.2和0.7倍體積異丙醇沉淀DNA。DNA用玻璃棒回收。然后在4℃重懸于水中1到3天。
采用修改的Dellaporta方法(1983)從1到1.5cm2大小的葉片中分離總DNA。用干凈的剪刀切下部分健康葉片，置于1.5ml錐形微量離心管中，直接轉(zhuǎn)移到液氮中。在抽提DNA前，葉片通常在-80℃儲存。葉組織在液氮中用microfuge研杵(Kontes Glass Co.，Vineland，NJ)在微量離心管中勻漿。每管冰凍粉末加入0.5ml抽提緩沖液，緩沖液含有50mM TRIS-Cl，pH8，100mM氯化鈉，10mMEDTA，pH8，1％十二烷基硫酸鈉和10mM β-巰基乙醇(使用前加入)。在勻漿融化之前，管置于65℃水浴中。融化后，劇烈振搖離心管，在65℃至少放置10分鐘但不超過25分鐘。加入180μl 5M乙酸鉀(Sambrook等，1989)后徹底混合抽提物，在冰上放置10分鐘，然后在TOMY MTX-150高速微量冷凍離心機(jī)上4℃離心10分鐘。含有DNA的上清轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，用0.5ml異丙醇室溫沉淀DNA 30分鐘。DNA沉淀通過上述的離心方法得到，上清液倒出并棄掉。沉淀用250μl 70％乙醇(-20℃冷卻)洗一次，4℃離心5分鐘。殘余的乙醇用移液器移去，洗過的沉淀在DNA 110 Speed Vac中干燥3分鐘，而后溶解于50μl水中。新制備的抽提物可以獲得最好的PCR擴(kuò)增效果。
為了進(jìn)行PCR擴(kuò)增，200到400ng基因組DNA或者2μl總DNA用水于0.2ml薄壁管(MJ Research，Inc.，Watertown，MA)中補(bǔ)至10μl。每個(gè)樣品加入40μl PCR混合液，它含25pmol UBI A2引物，25pmol轉(zhuǎn)基因特異的引物(見表3)，50mM氯化鉀，10mMTRIS-Cl，pH 9.0，0.1％ TritonX-100，3mM氯化鎂，dATP，dCTP，dGTP和TTP每種均為1mM，以及2.5單位Taq DNA聚合酶(promega，Madison，WI)。PCR反應(yīng)在PTC-100或PTC-200可編程的溫控裝置(MJ Research，Inc.，Watertown，MA)中進(jìn)行，反應(yīng)程序如下96℃ 30秒；95℃ 1分鐘，62℃ 1分鐘，72℃為1分鐘，35個(gè)循環(huán)；72℃ 15分鐘；4℃保溫。PCR產(chǎn)物(每個(gè)PCR反應(yīng)混合物中10-13μl)在1％到1.6％瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，紫外光下觀察，如實(shí)施例中所描述的那樣。陽性的PCR對照包括10到20ng包含有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶cDNAs的pUBKBglII-質(zhì)粒DNA。
在我們的實(shí)驗(yàn)中，至少三個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥系擴(kuò)增出預(yù)期的425bpUbi-外切殼多糖酶PCR產(chǎn)物，或預(yù)期的375bp Ubi-葡聚糖酶PCR產(chǎn)物，或預(yù)期的340bp Ubi-內(nèi)切殼多糖酶PCR產(chǎn)物(
圖12)。
轉(zhuǎn)基因系的繁殖如實(shí)施例19所述。采用PCR分析后代的bialaphos抗性和/或F.venenatum轉(zhuǎn)基因的存在。在連續(xù)兩代中每一個(gè)后代都有bialaphos抗性和/或在PCR轉(zhuǎn)基因分析中呈現(xiàn)陽性的種群被認(rèn)為是來自轉(zhuǎn)基因純合系。實(shí)施例21分析轉(zhuǎn)基因小麥系的轉(zhuǎn)基因mRNA通過Northern印跡分析根據(jù)實(shí)施例20所述方法鑒定出來的純合系和/或其后代的轉(zhuǎn)基因信使RNA(mRNA)的表達(dá)。在開花后的15-20天，從穗上采集種子，然后在70％乙醇中浸泡5分鐘表面滅菌，隨后用20％(v∶v)次氯酸浸泡15分鐘。用無菌水將種子沖洗4到5次。用解剖鑷子將每個(gè)種子的胚移去，用金屬藥刀的平面將胚乳材料從從種皮中擠出。獲得的胚乳在液氮中凍結(jié)，從15-30粒種子中收集胚乳材料，在RNA分離之前貯存在-80℃。采用修改的Altenbach方法分離總RNA(1998)?；旧希谝旱杏妙A(yù)冷的研缽和研杵將冷凍的胚乳研磨為細(xì)粉。冷凍的勻漿轉(zhuǎn)移到50毫升錐形離心管中，管中包含5ml抽提緩沖液(10mM氯化鈉，10mM TRIS-Cl，pH9.0，1mMEDTA)，2.5ml酚(TRIS緩沖液飽和，pH 4.3，F(xiàn)isher #BP1751)和2.5ml氯仿。將管上下顛倒40次，然后在Sorvall HS-4轉(zhuǎn)子上，4℃，6500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。水相轉(zhuǎn)移到新管中，用等體積酚/氯仿(1∶1 v/v)抽提一次，再用等體積氯仿抽提一次。每次抽提之后混合物按照所描述的方法離心。在水相中加入8M LiCl至終濃度為2M，-20℃過夜孵育。在Sorvall SS-34轉(zhuǎn)子中以4℃，12,500轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，收集含有RNA的沉淀。用冰冷的2M LiCl洗RNA沉淀，空氣中干燥，重懸于無菌水中。8M LiCl溶液和用于重懸RNA的水事先用0.05％(v∶v)焦碳酸二乙酯處理(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。根據(jù)制造商的建議，約100μg總RNA進(jìn)一步經(jīng)過RNeasy柱子(Qiagen Inc.，Valencia，CA)純化。純化的RNA儲存在-80℃。
對于Northern印跡，將大約4-5μg純化的RNA用樣品緩沖液補(bǔ)充至10μl，樣品緩沖液含有50％甲酰胺，6％甲醛(Fisher #BP531)，20mM MOPS，pH7.0，5mM醋酸鈉，10mM EDTA和0.01％溴酚藍(lán)。RNA樣品加熱到60℃，持續(xù)10到15分鐘，在進(jìn)行瓊脂糖分離之前立即置于冰上。瓊脂糖(0.3g)溶于30ml的20mM MOPS，5mM醋酸鈉，10mM EDTA，pH7.0中，加入37％的甲醛至終濃度為6％，加入10μg/μl溴化乙錠至終濃度為166ng/ml。50-70V電泳至2個(gè)小時(shí)。分離的RNA轉(zhuǎn)移到10xSSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸鈉，pH7.0)或50mM氫氧化鈉中的Zeta-Probe GT尼龍膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)3小時(shí)。含有RNA的尼龍膜(northern印跡)用2xSSC(30mM氯化鈉，3mM檸檬酸鈉，pH7.0)沖洗，之后用UV Stratalinker2400(Stratagene，La Jolla，CA)紫外線處理并于80℃真空烘烤(中性轉(zhuǎn)移)，或者空氣中干燥并直接使用(堿性轉(zhuǎn)移)根據(jù)Bio-Rad公司的建議，Northern印跡在Hybaid雜交爐(National Labnet，Woodbridge，NJ)，42℃，5到10ml溶液中進(jìn)行孵育6到7小時(shí)，該溶液含50％(v∶v)甲酰胺，7％(w∶v)十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.25M磷酸鈉緩沖液，pH 7.0，0.25M氯化鈉和1mM EDTA，pH8.0。用于Northern印跡的探針由如下部分或全長cDNA組成來自FvGluS的0.4kb BamHI GLU片段；來自FvEndoS的1.2kbBamHI+BglII Endo片段；或來自FvExoS的1.8kb BamHI+BglII Exo片段。按照實(shí)施例12所述，用瓊脂糖凝分離后純化探針片段。根據(jù)推薦意見，采用Multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)用32P-α-dCTP(3000Ci/mmol)放射標(biāo)記約25-50ng探針DNA，比活度為1-2×106cpm/ng。放射標(biāo)記的片段直接用于Northern印跡，42℃雜交36-40小時(shí)。印跡膜用200到300ml的2×SSC，0.1％(w∶v)SDS室溫洗15分鐘；200到300ml0.5×SSC，0.1％(w∶v)SDS室溫洗15分鐘；200到300ml 0.1×SSC0.1％(w∶v)SDS，62℃洗15分鐘。-80℃使用x光片膠片暗盒和Spectroline L-Plus增感屏(Spectronics Corp.，Westbury，NY)在預(yù)閃光XAR 5膠片(Kodak，Rochester，NY)上，或者室溫下用Storm 820phosphoimager(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)在磷光質(zhì)屏上進(jìn)行放射自顯影。Northern印跡分析在AB8-108系中檢測到內(nèi)切殼多糖酶轉(zhuǎn)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄本的存在(
圖13)。
我們也采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)來分析根據(jù)實(shí)施例20所述方法鑒定的雜合和純合系和/或其后代的轉(zhuǎn)基因mRNA的聚積。RT-PCR是一個(gè)更敏感的探測不同組織和器官中mRNA積累的方法(Altenbach 1998；Wang等，1998)。從開花后2到3個(gè)星期的小麥穎片中獲取總RNA的方法與從胚乳中分離RNA的程序是一樣的(如上)。按照生產(chǎn)廠家的建議，使用GeneAmp PCR核心試劑盒(PerkinElmer，F(xiàn)oster City，CA)或者一步RT-PCR試劑盒(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)，用600ng總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。轉(zhuǎn)基因特異的轉(zhuǎn)錄本用引物RTUBI和RTGLU(內(nèi)切殼多糖酶轉(zhuǎn)錄本5’末端)，RTEND(內(nèi)切殼多糖酶轉(zhuǎn)錄本5’末端)，或RTEXO(外切殼多糖酶轉(zhuǎn)錄本5’末端)來擴(kuò)增。表3為RT-PCR引物列表。轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄本的3’部分用RTNOS和RTGLU2(葡聚糖酶)，RTEND2(內(nèi)切殼多糖酶)或RTEXO2(外切殼多糖酶)擴(kuò)增，退火溫度為58°-60℃。
來自AB9-59b系的胚乳和穎片的總RNA顯示非常低，但是在可檢測水平上的單一700bp RT-PCR產(chǎn)物(
圖14)，代表了轉(zhuǎn)錄本的5’末端，并且包括Ubi外顯子。該產(chǎn)物的大小與預(yù)期的705bp非常接近，預(yù)期大小來自預(yù)測的轉(zhuǎn)基因mRNA的核苷酸序列。葡聚糖酶轉(zhuǎn)錄本的3’部分?jǐn)U增水平也非常低，但水平可以檢測(數(shù)據(jù)未顯示)，產(chǎn)生單一的330bp PCR產(chǎn)物(預(yù)期大小340bp)。
以AB8-108系連續(xù)的兩個(gè)世代分離的胚乳和穎片總RNA中，代表內(nèi)切殼多糖酶mRNA的5’末端、約700bp的單一RT-PCR產(chǎn)物(預(yù)期大小685bp)(
圖15A，左側(cè)與右側(cè)圖)，和代表內(nèi)切殼多糖酶mRNA的3’末端的320bp的單一RT-PCR產(chǎn)物(預(yù)期大小310bp)(
圖15B)強(qiáng)烈擴(kuò)增。C9-25a系的胚乳總RNA中，代表外切殼多糖酶mRNA 5’末端的(預(yù)期大小795bp)(
圖15A，右圖)約800bp的單一RT-PCR產(chǎn)物，和代表外切殼多糖酶mRNA(預(yù)期大小310bp)(
圖15B)3’末端的300bp單一RT-PCR產(chǎn)物也可以檢測到。來自未轉(zhuǎn)化的Bobwhite(bw)品系的總RNA沒有任何RT-PCR產(chǎn)物。
為了鑒定的目的，根據(jù)制造商的建議，用Cla I或Ssp I限制性內(nèi)切酶(New England BioLabs，Beverly，MA)徹底酶切內(nèi)切殼多糖酶5’RT-PCR產(chǎn)物。產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物用6％ TBE丙烯酰胺膠(Novex/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100V分離約1小時(shí)，電泳緩沖液由89mM TRIS-Cl，pH 8.3，89mM硼酸，1.5mM EDTA組成。產(chǎn)生的內(nèi)切殼多糖酶酶切產(chǎn)物如
圖16所示，與預(yù)期的內(nèi)切殼多糖酶mRNA的核苷酸序列非常相配，并證實(shí)了RT-PCR產(chǎn)物的同一性。同樣地，外切殼多糖酶5’RT-PCR產(chǎn)物用Bgl II，EcoRV或Nco I限制酶酶切(New England BioLabs，Beverly，MA)。最終的酶切產(chǎn)物按照實(shí)施例8所述在6％丙烯酰胺膠(
圖17A)或2％瓊脂糖凝膠(
圖17B)上分離，與預(yù)測的內(nèi)切殼多糖酶mRNA的核苷酸序列大小非常接近。由于在起始材料中存在較小的擴(kuò)增產(chǎn)物，(標(biāo)記為none的泳道，
圖17A)，在第一次實(shí)驗(yàn)中可以觀察到額外的酶切片段。第二次實(shí)驗(yàn)中，在Bgl II泳道中，由于BglII的不完全酶切產(chǎn)生主要的約800bp的片段(
圖17B)。
FvEndo和FvExo RT-PCR產(chǎn)物是cDNA-依賴的，因而來自于RNA，而不是來自于RNA制備過程中的基因組DNA污染。只有首先合成cDNA(+)，才可以在3個(gè)獨(dú)立系的胚乳中將FvEndo轉(zhuǎn)錄本的5’和3’端都擴(kuò)增出RT-PCR產(chǎn)物(
圖18A)。缺乏cDNA合成(-)，則不能得到5’或3’RT-PCR產(chǎn)物。如同預(yù)期的一樣，無論是否存在cDNA的合成，未轉(zhuǎn)化的Bobwhite(Bw)系的胚乳中都檢測不到FvEndo的轉(zhuǎn)錄本(
圖18B)。同樣，只有在cDNA合成后，才能從轉(zhuǎn)錄本的5’和3’端都擴(kuò)增到FvExo RT-PCR產(chǎn)物(
圖19)。在沒有轉(zhuǎn)化的Bobwhite樣品中沒有產(chǎn)物。
表3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)用的PCR引物引物 序列(5’到3’) 擴(kuò)增靶RTEND CTGGAAGTTTGTCGCACCG FvEndo轉(zhuǎn)錄本5’末端RTEND2 GAGATAGAGGATGCTGTGCCFvEndo轉(zhuǎn)錄本3’末端RTEXO CAGTGATGTGAAGGTGAAGGC FvExo轉(zhuǎn)錄本5’末端RTEXO2 CGTATGGACTGAGACTATCGAC FvExo轉(zhuǎn)錄本3’末端RTGLU GAGCATCCTTGATGGGAACAC FvGlu轉(zhuǎn)錄本5’末端RTGLU2 GTCAACTCCAAGGCTGTCGTC FvGlu轉(zhuǎn)錄本3’末端RTNOS GCCAAATGTTTGAACGATCTGC 轉(zhuǎn)錄本3’末端RTUBI CAACCTCGTGTTGTTCGGAG轉(zhuǎn)錄本5’末端實(shí)施例22在F.venenatum基因組中確定葡聚糖酶和殼多糖酶基因的拷貝數(shù)在本實(shí)施例中，我們采用A3/5(Wiebe等.1991)株的一個(gè)形態(tài)突變體F.venenatum CC1-3用于DNA印跡。用HindIII，BamHI或EcoRI限制內(nèi)切酶徹底酶切基因組DNA(每個(gè)處理5μg)，按實(shí)施例8所述方法在瓊脂糖凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)移到Nytran SuPerCharge膜上(Schleicher和Schuell，Keene，NH)。將DNA轉(zhuǎn)移到膜上，進(jìn)行放射性和非放射性標(biāo)記的探針的雜交、洗滌的程序如Schleichler和Schuell的網(wǎng)站所述，網(wǎng)站的地址是http//www.s-und-s.de/Pages-NEU-enYOscience/Lab％20Manual/southern.htm。雜交探針由下列成分組成1)FvGlu cDNA(來自實(shí)施例15中所描述的質(zhì)粒)的0.4kb 5’BamHI片段；2)FvEndoS(
圖15)的1.2kb BamHI/BglII的FvEndo cDNA片段；(3)1.8kb BamHI/BglII FvExo cDNA片段(來自實(shí)施例15中所描述的質(zhì)粒)。使用Multiprime DNA標(biāo)記系統(tǒng)(Amersham PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)，用32P-α-dCTP[比活度3000Ci(111tBq)/mmol]放射性標(biāo)記探針。
我們的Southern印跡結(jié)果表明在F.verzenatum基因組中三個(gè)基因的每一個(gè)都是單拷貝的(圖20)。采用HindIII酶切的λ噬菌體DNA作為遷移標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)相應(yīng)于FvGlu的雜交帶的大小是12.5kb(HindIII)，1.6kb(BamHI)和11kb(EcoRI)(見圖20的″kb″)。FvGlu編碼區(qū)包含單一的BamHI位點(diǎn)，這樣用全長的cDNA探針可以得到兩個(gè)雜交的BamHI片段。然而，用于此次實(shí)驗(yàn)的FvGlu探針由BamHI位點(diǎn)5’端側(cè)的cDNA序列組成，這樣，預(yù)期并獲得了一條BamHI雜交片段。雜交的FvEndo片段大小是9.3kb(HindIII)，8.9kb(BamHI)和6.6kb(EcoRI)。雜交的FvExo片段大小是4.3kb(HindIII)，11kb(BamHI)和4.7kb(EcoRI)。在FvEndo和Fvexo中都不含有這三個(gè)內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)。保藏聲明下面所標(biāo)識的質(zhì)粒已導(dǎo)入大腸桿菌宿主，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌于如下日期根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，保藏在農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(NRRL)，農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部，美國農(nóng)業(yè)部，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604 USA，并給予了下列的保藏編號保藏物 保藏編號 圖/序列編號 保藏日期GLU2 NRRL B-30201SEQ16 8/26/99Endo167NRRL B-30202SEQ18 8/26/99Exo9 NRRL B-30203SEQ20 8/26/99FvGluS NRRL B-30204圖6 8/26/99FvGluASNRRL B-30205圖7 8/26/99FvEndoSNRRL B-30206圖8 8/26/99FvEndoAS NRRL B-30207圖9 8/26/99FvExoS NRRL B-30208
圖108/26/99FvExoASNRRL B-30209
圖118/26/99容易理解，前面所給出的詳細(xì)描述僅僅是以舉例說明的方式給出，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，有可能在其中進(jìn)行修改和變化。此處所引用的所有的出版物，專利和專利申請完整地列入作為參考文獻(xiàn)。
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關(guān)于保藏的微生物的說明(PCT實(shí)施細(xì)則第13條之二) PCT/RO/134表保藏物 保藏編號 保藏日期GLU2 NRRL B-30201 8/26/99Endo167NRRL B-30202 8/26/99Exo9 NRRL B-30203 8/26/99FvGluS NRRL B-30204 8/26/99FvGluASNRRL B-30205 8/26/99FvEndoSNRRL B-30206 8/26/99FvEndoAS NRRL B-30207 8/26/99FvExoS NRRL B-30208 8/26/99FvExoASNRRL B-30209 8/26/99
序列表<110>Okubara，Patricia A.
Blechl，Ann E.
Hohn，Thomas M.
Berka，Randy M.<120>編碼細(xì)胞壁降解酶的核酸序列和在設(shè)計(jì)對鐮孢和其它病原體的抗性中的應(yīng)用<130>0079.99R<140><141><150>60/151,582<151>1999-08-30<150>60/224,946<151>2000-08-11<160>82<170>Patentin Ver.2.1<210>1<211>1023<212>DNA<213>Fusarium venenatum<220><221>CDS<222>(37)..(942)<400> 1cagttatctt tttttatcta ctatctttaa ttcact atg aag ttc ttc agc act 54Met Lys Phe Phe Ser Thr1 5ctt agc acc ctt gcg gtg gcc ctc atg atg agt ggc gag gct ctg gct 102Leu Ser Thr Leu Ala Val Ala Leu Met Met Ser Gly Glu Ala Leu Ala10 15 20ggt acc tac aag ggt ttc agc att ggc gcc aac agg gct gat ggt gcc 150Gly Thr Tyr Lys Gly Phe Ser Ile Gly Ala Asn Arg Ala Asp Gly Ala25 30 35tgt aag tgg gag gcc gac tgg aag aag gat ttc cag gcc atc aag agc 198Cys Lys Trp Glu Ala Asp Trp Lys Lys Asp Phe Gln Ala Ile Lys Ser40 45 50tgg aac aag ggt ttc aac gct gtt cgt ctg tac tct gcc tct gac tgt 246Trp Asn Lys Gly Phe Asn Ala Val Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Asp Cys55 60 65 70aac aca ctt gtc aag gct gtc ccc gct gcc aag gcc act ggc atg aag 294Asn Thr Leu Val Lys Ala Val Pro Ala Ala Lys Ala Thr Gly Met Lys75 80 85atc ctt gtt ggc gtc tgg gcc acc gat gat gct cac ttc ggc cgc gac 342Ile Leu Val Gly Val Trp Ala Thr Asp Asp Ala His Phe Gly Arg Asp90 95 100aag gcc gcc ctc ctc aag gct atc aag cag cac ggc acc ggc tgg atc 390Lys Ala Ala Leu Leu Lys Ala Ile Lys Gln His Gly Thr Gly Trp Ile105 110 115gcc gcc atc agt gtc gga tcc gag gac ctc tac cgt gag gac atc tcc 438Ala Ala Ile Ser Val Gly Ser Glu Asp Leu Tyr Arg Glu Asp Ile Ser120 125 130ccc cag aag ctc gca cag cag atc tac gac gtc cga ggc atg gtc cac 486Pro Gln Lys Leu Ala Gln Gln Ile Tyr Asp Val Arg Gly Met Val His135 140 145 150caa tac aac aag aac ctc aag gtc gga cat acc gac acc tgg acc gct 534Gln Tyr Asn Lys Asn Leu Lys Val Gly His Thr Asp Thr Trp Thr Ala155 160 165tgg gtc gac ggc cgc aac gac gtc gtc acc aag gcc tgc gat atc gcc 582Trp Val Asp Gly Arg Asn Asp Val Val Thr Lys Ala Cys Asp Ile Ala170 175 180att aca aac ggt ttc ccc tac tgg cag ggt gtt ccc atc aag gat gct 630Ile Thr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp 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權(quán)利要求
1.編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少70％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(b)編碼具有葡聚糖酶活性的多肽的核酸序列，所說的多肽具有與SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(ii)(i)的至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有葡聚糖酶活性的多肽片段。
2.權(quán)利要求1的核酸分子，其展示在SEQ ID NO1，3或16中。
3.權(quán)利要求1的核酸分子，其包含在質(zhì)粒Glu2，F(xiàn)vGluS或FvGluAS中。
4.包含權(quán)利要求1的核酸分子的核酸結(jié)構(gòu)，該分子可操作地與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列相連接，該調(diào)控序列可在表達(dá)宿主中指導(dǎo)具有葡聚糖酶活性的多肽的生產(chǎn)。
5.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求1的分離的核酸分子的細(xì)胞。
6.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求1的分離的核酸分子的植物。
7.權(quán)利要求6的植物的種子。
8.權(quán)利要求6的植物，其中該植物是單子葉植物。
9.權(quán)利要求8的植物，所說的單子葉植物是小麥。
10.權(quán)利要求6的植物的有性或無性來源的后代。
11.由權(quán)利要求1的核酸分子編碼的葡聚糖酶多肽。
12.分離的具有葡聚糖酶活性的多肽，其選自(a)具有與SEQ ID NO2，4，5或17的第1到301位氨基酸有至少80％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO1的第37位到942位核苷酸；SEQ ID NO3的第1801位到2761位核苷酸；或SEQ ID NO16的第18位到923位核苷酸；(ii)至少100個(gè)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有葡聚糖酶活性的片段。
13.編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(b)編碼具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列，所說的多肽具有與SEQ ID NO11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽片段。
14.權(quán)利要求13的核酸分子，其展示在SEQ ID NO10或18中。
15.權(quán)利要求13的核酸分子，其包含在質(zhì)粒Endo176，F(xiàn)vEndoS或FvEndoAS中。
16.包含權(quán)利要求13的核酸分子的核酸結(jié)構(gòu)，該分子可操作地與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列相連接，該調(diào)控序列可在表達(dá)宿主中指導(dǎo)具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽的生產(chǎn)。
17.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求13的分離的核酸分子的細(xì)胞。
18.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求13的分離的核酸分子的植物。
19.權(quán)利要求18的植物的種子。
20.權(quán)利要求18的植物，其中該植物是單子葉植物。
21.權(quán)利要求20的植物，其中所說的單子葉植物是小麥。
22.權(quán)利要求18的植物的有性或無性來源的后代。
23.由權(quán)利要求13的核酸分子編碼的內(nèi)切殼多糖酶多肽。
24.分離的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽，其選自(a)具有與SEQ ID NO11或19的第1到399位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO10的第186位到1385位核苷酸；或SEQ ID NO18的第18位到1217位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有內(nèi)切殼多糖酶活性的片段。
25.編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽的分離的核酸分子，其選自(a)與下列序列有至少75％核苷酸序列同一性的核酸序列SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(b)編碼具有外切殼多糖酶活性的多肽的核酸序列，所說的多肽具有與SEQ ID NO13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列；(c)在中度或高度嚴(yán)格條件下能與下列序列雜交的核酸序列(i)SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列；或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(d)(a)、(b)或(c)的子序列，其中該子序列編碼有外切殼多糖酶活性的多肽片段。
26.權(quán)利要求25的核酸分子，其展示在SEQ ID NO8，12或20中。
27.權(quán)利要求25的核酸分子，其包含在質(zhì)粒Exo9，F(xiàn)vExoS或FvExoAS中。
28.包含權(quán)利要求25的核酸分子的核酸結(jié)構(gòu)，其中該分子可操作地與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列相連接，該調(diào)控序列可在表達(dá)宿主中指導(dǎo)具有外切殼多糖酶活性的多肽的生產(chǎn)。
29.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求25的分離的核酸分子的細(xì)胞。
30.轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求25的分離的核酸分子的植物。
31.權(quán)利要求30的植物的種子。
32.權(quán)利要求30的植物，其中該植物是單子葉植物。
33.權(quán)利要求30的植物，其中所說的單子葉植物是小麥。
34.權(quán)利要求30的植物的有性或無性來源的后代。
35.由權(quán)利要求25的核酸分子編碼的外切殼多糖酶多肽。
36.分離的具有外切殼多糖酶活性的多肽，其選自(a)具有與SEQ ID NO13或21的第1到581位氨基酸有至少85％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在中度或高度嚴(yán)格條件下可以與下列序列雜交的核酸序列所編碼的多肽，這些序列是(i)SEQ ID NO12的第108位到1853位核苷酸；或SEQ ID NO20的第18位到1763位核苷酸；(ii)至少100個(gè)連續(xù)核苷酸的(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互補(bǔ)鏈；和(c)(a)或(b)的具有外切殼多糖酶活性的片段。
37.轉(zhuǎn)化了一個(gè)或多個(gè)權(quán)利要求1、13或25的分離核酸分子的植物。
38.賦予或增強(qiáng)植物對真菌病原體的抗性的方法，包括用一個(gè)或多個(gè)編碼具有葡聚糖酶活性的多肽、具有內(nèi)切殼多糖酶活性的多肽或具有外切殼多糖酶活性的多肽的分離核酸分子轉(zhuǎn)化所述植物。
39.生產(chǎn)具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的方法，該方法包括在適于生產(chǎn)該多肽的條件下培養(yǎng)包含被轉(zhuǎn)化細(xì)胞的重組宿主細(xì)胞，所述被轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有編碼有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶或外切殼多糖酶活性的多肽的核酸分子；并回收該多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及來源于鐮孢真菌基因的、編碼細(xì)胞壁降解酶葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶的核酸序列;具有葡聚糖酶、內(nèi)切殼多糖酶和外切殼多糖酶活性的分離的多肽;包含該核酸序列的重組核酸分子、載體和宿主細(xì)胞,以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法,包括在植物細(xì)胞中表達(dá)以賦予或提高某種植物對鐮孢和其他病原體的抗性。
文檔編號C12N9/24GK1382220SQ00813628
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月30日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月30日
發(fā)明者P·A·奧庫巴拉, A·E·布萊切, T·M·霍恩, R·M·博卡 申請人:(由農(nóng)業(yè)部部長代表的)美利堅(jiān)合眾國, 諾沃奇梅茲生物技術(shù)有限公司