專利名稱：一種動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程中酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種對動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁有強(qiáng)烈破壁作用的溶解酶反應(yīng)液組合物。
背景技術(shù)：
多數(shù)動(dòng)植物特別是綠色植物、海洋動(dòng)物、藻類植物和微生物細(xì)胞內(nèi)含有多種細(xì)胞活性成分，并具有多方面的保健、醫(yī)療作用。如靈芝孢子、蜂花粉、小球藻、人參、黃芪、長春花、鯊魚軟骨素等。由于上述物質(zhì)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，在人體內(nèi)消化困難，使有效成分難以被機(jī)體吸收利用，必須通過細(xì)胞破壁技術(shù)使細(xì)胞內(nèi)的活性成分得到有效應(yīng)用。目前比較先進(jìn)的細(xì)胞破壁技術(shù)為選用酶制劑進(jìn)行酶解的方法。
植物細(xì)胞壁主要是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等所構(gòu)成，溶解植物細(xì)胞壁的酶通常稱為植物組織崩解酶，主要是由纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶組成。而微生物的細(xì)胞壁不同于植物細(xì)胞壁，微生物和動(dòng)物的細(xì)胞壁構(gòu)造復(fù)雜的多，而且不同動(dòng)物或微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)也不同，須用不同類型的酶方能溶解，常用的可分為細(xì)菌細(xì)胞壁溶解酶、酵母和霉菌細(xì)胞壁溶解酶等三種。在美國雖然也有研制細(xì)胞壁溶解酶用于微生物破壁，但重金屬含量與安全性均存在問題。因此，這類產(chǎn)品僅僅使用在分子生物學(xué)分析、研究上，且價(jià)格昂貴，折合人民幣約每公斤42萬元，沒有任何推廣和使用價(jià)值。國內(nèi)曾有用于特定某種植物細(xì)胞壁破壁用酶技術(shù)的記載，如2004年6月2日公開的中國專利申請02148743.X提供了一種獲取靈芝孢子活性成分的方法，針對靈芝孢子細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成選用內(nèi)-β-1，3-葡聚糖酶、蛋白酶或/和殼多糖酶進(jìn)行破壁的技術(shù)；2004年9月1日公告的中國專利ZL02112655.0涉及小球藻生長因子提取方法，它通過小球藻溫浴后先用果膠酶使小球藻細(xì)胞壁發(fā)生水解反應(yīng)，然后再加入核酸酶和蛋白酶使其水解為小球藻精的混合物。上述破壁技術(shù)都只能對單一一種植物的細(xì)胞壁進(jìn)行破壁，不能通用，而且破壁前需要對植物體進(jìn)行加工處理，破壁時(shí)間較長，破壁酶的活性低，破壁率低。目前還沒有同時(shí)可以對動(dòng)植物、藻類和微生物原料進(jìn)行破壁的酶反應(yīng)物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種同時(shí)用于動(dòng)植物特別是綠色植物和藻類植物、動(dòng)物以及微生物細(xì)胞破壁的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，能夠把動(dòng)植物和微生物細(xì)胞內(nèi)的有效藥物成分和營養(yǎng)成分釋放出來，達(dá)到高度的提取率。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于該反應(yīng)液包括細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料。
該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的重量百分比組成為細(xì)胞壁溶解酶 2-5％ 原生質(zhì)液 5-50％ 酶促進(jìn)劑 5-10％無機(jī)鹽 1-16％ 礦泉水 10-70％ 輔料 5-25％所述的細(xì)胞壁溶解酶是用枯草桿菌Bacillus Subtilis K-77或枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25為菌種，以靈芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培養(yǎng)基，采用常規(guī)酶生產(chǎn)工藝制備的溶解酶。
所述的細(xì)胞壁溶解酶是用蠟狀芽孢桿菌BM Cirlulans AL.1.為菌種，以靈芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培養(yǎng)基，采用常規(guī)酶生產(chǎn)工藝制備的溶解酶。
所述的原生質(zhì)液為從水果、蔬菜、蛋類、豆類和奶類中榨取或提取的汁液中的一種、任兩種或兩種以上混合物，包括玉米漿、胡蘿卜汁、蛋清、蘋果汁、梨汁、青菜汁、苦瓜汁、豆油、白菜汁、蓮子汁、豆芽汁、大豆汁、冬瓜汁、海帶汁、牛乳中的一種、任兩種或兩種以上混合物。
所述的酶促進(jìn)劑為酵母膏或/和吐溫80或/和紅曲粉。
所述的無機(jī)鹽為KH2PO4、K2HPO4中的一種或兩種與(NH4)2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、Na2SO4、ZnSO4、CaCl2、CaSO4、(NH4)2SO4、NH4NO3、KCl、FeSO4、NaCl、MnSO4、CaCO3、NaNO3中的任一種、兩種或兩種以上的混合物。
所述的輔料為蛋白胨、蛋白粉、甘油、葡萄糖、蜂王漿、瓊脂、乳酸、白糖、紅糖、檸檬酸中的一種、任兩種或兩種以上的混合物。
所述的礦泉水為市售飲用礦泉水。
本發(fā)明還涉及該動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液在動(dòng)物細(xì)胞破壁、植物細(xì)胞破壁、藻類植物細(xì)胞破壁和微生物細(xì)胞破壁中的應(yīng)用。。
所述的植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液在動(dòng)物細(xì)胞破壁、植物細(xì)胞破壁、藻類植物細(xì)胞破壁和微生物細(xì)胞破壁中的應(yīng)用方法，其特征在于將動(dòng)物、植物、藻類植物或微生物原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05～0.15。
該細(xì)胞壁溶解酶是以枯草桿菌(Bacillus Subtilis)、蠟狀芽孢桿菌(BMCirlulans)為菌種培育的，枯草桿菌為芽孢桿菌屬(Lactobacillus)的一種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖，故此得名。蠟狀芽孢桿菌為腸桿菌屬(Enter Dolacter)。本發(fā)明選用的菌種為枯草桿菌Bacillus SubtilisK-77、枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25、蠟狀芽孢桿菌BM Cirlulans AL.1.。上述酶的生產(chǎn)方法可以按常規(guī)方法生產(chǎn)，生產(chǎn)方法見《酶制劑工業(yè)》(張樹政主編，科學(xué)出版社1989年出版)。
該細(xì)胞壁溶解酶可使細(xì)胞壁崩解，使動(dòng)植物和微生物細(xì)胞自溶，從而把動(dòng)植物藥物、藻類植物和微生物藥物的有效藥物成分和營養(yǎng)成分從細(xì)胞液中釋放出來，達(dá)到高度的提取率。
原生質(zhì)液是從水果、蔬菜、蛋類、豆類和奶類中榨取或提取出來的汁液，在反應(yīng)液中主要作為生長素，生長素對酶是必需的。這些與酵母酵解活性有關(guān)的生長素中的成分成為輔酶，它本身不是酶，也不是蛋白質(zhì)，通常為菸酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，NAD、NADP以及其它與氧化還原酶有關(guān)的輔酶起著氫供體或氧受體的作用。它是一種中間體，沒有這些中間體，酶解無法進(jìn)行下去，這就是為什么有些酶活性很高但酶解效果不好的原因。
酶促進(jìn)劑屬于酶的誘導(dǎo)物或表面活性劑，能增加產(chǎn)酶速度提高酶解反應(yīng)速度。所述的無機(jī)鹽為含微量元素的無機(jī)鹽，無機(jī)鹽中的金屬離子對于酶解的影響是多方面的，磷是構(gòu)成核酸、磷脂的成分，并參與腺三磷(ATP)和鳥三磷(GTP)在內(nèi)的所有能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，同時(shí)也是許多酶的活性基團(tuán)成分，因?yàn)橛袡C(jī)發(fā)酵原料中的磷量往往不能滿足酶解需要，必須補(bǔ)充添加，磷在本發(fā)明使用的無機(jī)鹽中是不可缺少的元素；硫是菌體蛋白中含硫氨基酸加胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等的組成部分。也是輔酶的組成部分；鉀以離子狀態(tài)存在于菌種中，其作用是控制細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)的膠體狀態(tài)和細(xì)胞膜得透性作用；酶以離子狀態(tài)存在菌種中，對細(xì)胞壁溶解酶的活性有促進(jìn)作用；鈣可以起到控制細(xì)胞透性調(diào)酸等作用，對細(xì)胞壁溶解酶的活性起到穩(wěn)定和活化作用；金屬鈉可促進(jìn)酶的產(chǎn)量。硝酸銨和其他硝酸鹽和銨鹽還能夠增加氮，實(shí)現(xiàn)碳氮比平衡。
輔料的主要作用是調(diào)節(jié)碳和氮的比例，促進(jìn)發(fā)酵，穩(wěn)定pH值。
該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的制備方法是將細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、輔料和礦泉水按比例混合即可。
該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液在應(yīng)用時(shí)，可將動(dòng)植物、藻類植物和微生物原料進(jìn)行常規(guī)的衛(wèi)生加工和粉碎，其粉碎細(xì)度達(dá)到60目即可，需要消毒的原料可以置于紫外燈下照射3小時(shí)，必要時(shí)可以在乳酸溶液中浸制24小時(shí)。將細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液和待處理原料放入發(fā)酵罐中，充分?jǐn)嚢韬蟀l(fā)酵，一般保持發(fā)酵的溫度不能超過37℃，發(fā)酵全過程為72-96小時(shí)，當(dāng)PH值在3.5-6.2之間時(shí)即為發(fā)酵破壁后的合格成品。其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比最好為1∶0.05～0.15。
本發(fā)明的有益效果在于，該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液無毒，生物降解性好，通過對動(dòng)植物和微生物原料酶解和發(fā)酵，可將原料中的有效成分和化學(xué)成分進(jìn)行有效的提取，由于對動(dòng)植物和微生物原料的酶解發(fā)酵，產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)起了根本性的變化，使細(xì)胞內(nèi)的小分子蛋白、游離氨基酸、亞麻酸和多肽等生物活性物質(zhì)質(zhì)量大大提高，更容易被人體吸收。該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對動(dòng)植物特別是動(dòng)物、綠色植物、藻類植物以及微生物均具有較高的破壁率和優(yōu)異的破壁效果，可以廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品和飲料等領(lǐng)域中對動(dòng)植物以及微生物原料中的有效成分和化學(xué)成份的有效提取。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 一、細(xì)胞壁溶解酶的制備以枯草桿菌Bacillus Subtilis K-77為選育菌種，以蜂花粉為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方松花粉75％，米糠或麩皮23％，蔗糖1％，石膏粉1％，水料比1.5∶1。
培育條件和培育方法(1)將培養(yǎng)基拌勻，培養(yǎng)料的含水量達(dá)65％左右；(2)培養(yǎng)料拌均勻后裝入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐溫度控制在30℃～37℃之間，加入栽培菌種，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)，PH值3.0～4.0；(3)通氣、攪拌、每8個(gè)小時(shí)攪拌1次；(4)發(fā)酵后過濾，去渣、取上清液；(5)上清液加硫酸銨沉淀，取沉淀物；(6)在60℃以下的烘干箱中烘干，即得酶粗粉。
按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液5％，其中菠菜汁2％，苦瓜汁1％，雞蛋清2％；2.酶促進(jìn)劑6.5％，其中酵母膏3％，吐溫80 1.5％，紅曲粉2％；3.無機(jī)鹽7.4％，其中KH2PO40.1％，K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O 1.5％，Na2SO44.5％，(NH4)2SO40.7％，KCl 0.5％；4.細(xì)胞壁溶解酶2％；5.輔料9.1％，其中蛋白胨2％，葡萄糖6％，蛋白粉1.1％；6.礦泉水70％。
二、細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對蜂花粉的細(xì)胞破壁使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對蜂花粉(福建農(nóng)林大學(xué)產(chǎn))進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的蜂花粉放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05。
對破壁后的蜂花粉進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然蜂花粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表一。
表一 天然蜂花粉經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

由表一可以看出，細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液利用細(xì)胞壁溶解酶的破壁作用對花粉細(xì)胞壁起崩解作用，能充分提取細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的各種有效成分，利用酶的活性還能加強(qiáng)花粉多糖蛋白的生物代謝，使天然蜂花粉活性蛋白提高30％，細(xì)胞破壁率達(dá)97％。
實(shí)施例2 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，只是其中的培養(yǎng)基原料松花粉用靈芝孢子粉代替，并按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液10％，為蘋果汁；2.酶促進(jìn)劑10％，其中吐溫80 5％，紅曲粉5％；3.無機(jī)鹽3％，其中KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.2％，NH4NO31.4％，CuSO40.2％，KCl 0.5％，ZnSO40.2％，F(xiàn)eSO40.2％，MnSO40.2％；4.細(xì)胞壁溶解酶2％；5.輔料9％，其中紅糖3.6％，瓊脂2％，檸檬酸3.4％；6.礦泉水66％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對靈芝孢子粉進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.15。
輔料是米糖或麩皮、蔗糖、石膏粉。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然的原料進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表二。
表二 靈芝孢子粉經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例3 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，但選用的菌種為枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25，培養(yǎng)基原料松花粉用油菜花粉代替，按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液32.6％，其中大豆汁5％，玉米漿5％，梨汁10％，蘋果汁10％，蛋清2.6％；2.酶促進(jìn)劑10％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽1％，其中KH2PO40.2％，NaCl 0.3％，(NH4)2SO40.5％；4.細(xì)胞壁溶解酶2％；5.輔料10.4％，其中瓊脂2％，檸檬酸3.4％，蛋白胨5％；6.礦泉水49％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對銀杏葉進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.1。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及黃酮和內(nèi)脂含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然原料粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表三。
表三 銀杏葉經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例4 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液10％，為胡蘿卜汁；2.酶促進(jìn)劑10％，其中吐溫80 5％，紅曲粉5％；3.無機(jī)鹽7％，其中MgSO4·7H2O 1％，KH2PO42％，(NH4)2HPO42％，KCl 1％，NH4NO32％；4.細(xì)胞壁溶解酶4％；5.輔料24％，其中瓊脂2％，檸檬酸20％，蛋白胨2％；6.礦泉水45％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對長春花進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料于物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及長春花堿含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然長春花粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表四。
表四 長春花粉經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例5 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，但選用的菌種為枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25，培養(yǎng)基原料松花粉用油菜花粉代替，按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液50％，其中冬瓜汁30％，海帶汁20％；2.酶促進(jìn)劑10％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽5.5％，其中NaNO33％，KCl 0.5％，F(xiàn)eSO40.2％，KH2PO41.5％；4.細(xì)胞壁溶解酶3％；5.輔料5.5％，為檸檬酸；6.礦泉水26％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對鯊魚軟骨素進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.15。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及膠原蛋白含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然鯊魚軟骨素進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表五。
表五 鯊魚軟骨素經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例6 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液50％，其中蛋清10％，牛乳10％，菠蘿汁10％，大豆油5％，玉米漿5％；2.酶促進(jìn)劑10％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽1％，為KH2PO4；4.細(xì)胞壁溶解酶2％；5.輔料18％，其中蛋白胨5％，甘油2％，紅糖6％，葡萄糖5％；6.礦泉水19％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對黃芪進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.08。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然黃芪粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表六。
表六 黃芪經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例7 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，但選用的菌種為枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25，培養(yǎng)基原料松花粉用靈芝孢子粉代替，并按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液20％，其中牛乳5％，白菜汁10％，蓮子汁5％；2.酶促進(jìn)劑6％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽10％，其中K2HPO41％，NaCl 1％，NaNO34％，ZnSO42％，NaSO4；4.細(xì)胞壁溶解酶5％；5.輔料9％，其中瓊脂2％，葡萄糖5％，檸檬酸2％；6.礦泉水50％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對人參進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.12。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及皂甙含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然人參粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表七。
表七 人參粉經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例8 以實(shí)施例1的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，并按下列重量百分比和組成取細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液
1.原生質(zhì)液15％，其中蘋果汁10％，豆芽汁5％；2.酶促進(jìn)劑5％，為酵母膏；3.無機(jī)鹽3％，其中KH2PO41％，K2HPO41％，(NH4)2SO40.5％，MnSO40.5％，CaCl 1.0％，CaSO41.0％；4.細(xì)胞壁溶解酶5％；5.輔料22％，其中蛋白胨5％，酵母膏5％，葡萄糖5％，白糖5％，乳酸5％；6.礦泉水50％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對枸杞進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及多糖、活性蛋白含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然_枸杞粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表八。
表八 枸杞經(jīng)細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

對比例1 按常規(guī)煎煮中藥方法提取靈芝孢子粉煎煮液，然后取同重量的靈芝孢子采用實(shí)施例2提供的方法經(jīng)過細(xì)胞壁溶解酶制備的靈芝孢子發(fā)酵酶解產(chǎn)物，用比色法(BECKMAN DU-640紫外/可見分光光度計(jì))分析二者產(chǎn)物中的靈芝多糖含量，可知，采用本發(fā)明細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液酶解的靈芝多糖提取率是常規(guī)煎煮中藥方法的4倍。
對比例2 將松花粉按常規(guī)煎煮的方法提取松花粉煎煮液，然后取同重量的松花粉采用實(shí)施例1提供的工藝處理得到靈芝孢子發(fā)酵酶解產(chǎn)物，比較兩種方法提取產(chǎn)物中花粉蛋白的收取率，結(jié)果表明采用本發(fā)明提供的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液處理的花粉蛋白的提取率是常規(guī)煎煮方法的2.2倍。
實(shí)施例9 以蠟狀芽孢桿菌BM Cirlulans AL.1.為菌種進(jìn)行選育，培育條件和培育方法培養(yǎng)基配方松花粉75％ 米糠或麩皮23％ 蔗糖1％ 石膏粉1％水料比1.5∶1。培育條件和培育方法(1)將培養(yǎng)基拌，培養(yǎng)料的含水量達(dá)65％左右；(2)料拌均勻后裝入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐溫度控制在30℃～37℃之間，加入栽培種，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)，PH值3.0～4.0；(3)通氣、攪拌、每8個(gè)小時(shí)攪拌1次；(4)發(fā)酵后過濾，去渣、取上清液；(5)上清液加硫酸胺沉淀，取沉淀物；(6)在60℃以下的烘干箱中烘干，即得酶粗粉。
制備細(xì)胞壁溶解酶后，按下列重量百分比和組成取該細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液15％，其中蘋果汁10％，豆芽汁5％；2.酶促進(jìn)劑5％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽3％，其中KH2PO41％，K2HPO41％，(NH4)2SO40.5％，MnSO40.5％，MgSO4·7H2O 2％，；4.細(xì)胞壁溶解酶5％；5.輔料22％，其中蛋白胨5％，甘油5％，葡萄糖5％，白糖5％，乳酸5％；6.礦泉水50％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對靈芝孢子粉進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料_放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及_多糖進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然枸杞粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表九。
表九 枸杞粉經(jīng)破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

實(shí)施例10 以實(shí)施例9的方法制備細(xì)胞壁溶解酶，但選用的培養(yǎng)基原料松花粉用油菜花粉代替，制備細(xì)胞壁溶解酶后，按下列重量百分比和組成取該細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料并混合制得細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液1.原生質(zhì)液28％，其中胡蘿卜汁10％，梨汁10％，豆芽汁5％，玉米漿3％；2.酶促進(jìn)劑10％，為吐溫80；3.無機(jī)鹽2％，其中KH2PO41％，(NH4)2SO40.5％，MnSO40.3％，CaCO30.2％，；4.細(xì)胞壁溶解酶2％；
5.輔料25％，其中蜂王漿10％，白糖15％；6.礦泉水33％。
使用上述制備的細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對人參進(jìn)行破壁處理，將經(jīng)過衛(wèi)生加工、烘干和紫外線消毒的原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后常溫常壓發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，控制發(fā)酵溫度不高于37℃，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.12。
對破壁后的粉劑進(jìn)行進(jìn)行細(xì)胞破壁率以及皂甙含量進(jìn)行分析，并同時(shí)對天然人參粉進(jìn)行上述分析，分析項(xiàng)目和數(shù)據(jù)結(jié)果見表十。
表十 人參粉經(jīng)破壁前后的各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析

通過以上實(shí)施例可以看出，本發(fā)明提供的溶解酶反應(yīng)液能夠?qū)Ψ浠ǚ?、靈芝孢子粉、銀杏葉、黃芪、鯊魚軟骨素、長春花粉等動(dòng)植物細(xì)胞以及微生物細(xì)胞進(jìn)行破壁作業(yè)，普適性強(qiáng)，破壁效率高，能夠有效提高破壁后原料中的有效成分的溶出，提高藥用性能。
權(quán)利要求
1.一種動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于該反應(yīng)液包括細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于該反應(yīng)液的重量百分比組成為細(xì)胞壁溶解酶 2-5％ 原生質(zhì)液 5-50％ 酶促進(jìn)劑 5-10％無機(jī)鹽1-16％礦泉水10-70％輔料 5-25％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于所述的細(xì)胞壁溶解酶是以枯草桿菌Bacillus Subtilis K-77或枯草桿菌Bacillus Subtilis YT-25為菌種，以靈芝孢子粉、松花粉或油菜花粉做培養(yǎng)基，采用常規(guī)酶生產(chǎn)工藝制備的溶解酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于所述的細(xì)胞壁溶解酶是用蠟狀芽孢桿菌BM Cirlulans AL.1.為菌種，采用常規(guī)酶生產(chǎn)工藝制備的溶解酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于所述的原生質(zhì)液為從水果、蔬菜、蛋類、豆類和奶類中榨取或提取的汁液中的一種、任兩種或兩種以上混合物，包括玉米漿、胡蘿卜汁、蛋清、蘋果汁、梨汁、青菜汁、苦瓜汁、豆油、白菜汁、蓮子汁、豆芽汁、大豆汁、冬瓜汁、海帶汁、牛乳中的一種、任兩種或兩種以上混合物；所述的酶促進(jìn)劑為酵母膏或/和吐溫80或/和紅曲粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，其特征在于所述的無機(jī)鹽為KH2PO4、K2HPO4中的一種或兩種與(NH4)2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、Na2SO4、ZnSO4、CaCl2、CaSO4、(NH4)2SO4、NH4NO3、KCl、FeSO4、NaCl、MnSO4、CaCO3、NaNO3中的任一種、兩種或兩種以上的混合物；所述的輔料為蛋白胨、蛋白粉、甘油、葡萄糖、蜂王漿、瓊脂、乳酸、白糖、紅糖、檸檬酸中的一種、任兩種或兩種以上的混合物。所述的礦泉水為市售飲用礦泉水。
7.權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液在動(dòng)物細(xì)胞破壁、植物細(xì)胞破壁、藻類植物細(xì)胞破壁和微生物細(xì)胞破壁中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求7所述的動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液在動(dòng)物細(xì)胞破壁、植物細(xì)胞破壁、藻類植物細(xì)胞破壁和微生物細(xì)胞破壁中的應(yīng)用方法，其特征在于將動(dòng)物、植物、藻類植物或微生物原料放入發(fā)酵罐中，與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液混合后發(fā)酵至PH值為3.5-6.2，其中原料干物質(zhì)與細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液的質(zhì)量比為1∶0.05～0.15。
全文摘要
一種動(dòng)植物和微生物細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液，屬于細(xì)胞工程中酶解技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于該反應(yīng)液包括細(xì)胞壁溶解酶、原生質(zhì)液、酶促進(jìn)劑、無機(jī)鹽、礦泉水和輔料。該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液無毒，生物降解性好，可將原料中的有效成分和化學(xué)成分進(jìn)行有效的提取，由于對動(dòng)植物和微生物原料的酶解發(fā)酵，產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)起了根本性的變化，使細(xì)胞內(nèi)的小分子蛋白、游離氨基酸、亞麻酸和多肽等生物活性物質(zhì)質(zhì)量大大提高，更容易被人體吸收。該細(xì)胞壁溶解酶反應(yīng)液對動(dòng)植物特別是動(dòng)物、綠色植物、藻類植物以及微生物均具有較高的破壁率和優(yōu)異的破壁效果，可以廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品和飲料等領(lǐng)域中對動(dòng)植物以及微生物原料中的有效成分和化學(xué)成分的有效提取。
文檔編號(hào)C12N9/36GK1740327SQ20051010483
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者林陸山 申請人:福州恒豐量子生物科技有限公司