專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木霉菌株及其應(yīng)用。具體是一株能代謝產(chǎn)生芥子酶、對(duì)常見(jiàn)植物病原真菌有強(qiáng)烈拮抗作用的深綠青霉(Trichederma atroviride)及其在以蕓薹屬植物為土壤熏蒸材料時(shí)促進(jìn)硫代葡萄糖甙降解的應(yīng)用。屬于利用微生物對(duì)農(nóng)業(yè)廢棄物或農(nóng)副產(chǎn)品下腳料通過(guò)生物降解提高其生物有效性或?qū)崿F(xiàn)廢棄物的高附加值的具體應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土傳病害是危害設(shè)施蔬菜生產(chǎn)的重要病害之一，主要通過(guò)土壤、植物殘?bào)w或土壤中的病菌殘?bào)w傳播。土壤消毒處理是控制土傳病害的重要措施，其中以溴甲烷為代表的土壤熏蒸劑因?yàn)槠漭^好的使用效果一直在多種作物土傳病害的防治上被廣泛應(yīng)用，但由于它對(duì)臭氧層的破壞作用，聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署在1997年規(guī)定工業(yè)國(guó)家在2005年禁用溴甲烷，而發(fā)展中國(guó)家也將于2015全面禁用溴甲烷。因此，溴甲烷替代技術(shù)研究將是當(dāng)前及未來(lái)很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)土壤消毒的研究熱點(diǎn)之一。生物熏蒸是利用外源加入到土壤中的植物有機(jī)質(zhì)在分解過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性殺生氣體抑制或殺死土壤中的有害生物的方法。1994年Angus等將蕓薹屬(Brassica spp.) 植物組織深翻到小麥田，發(fā)現(xiàn)能夠減少小麥全蝕病菌(Gaeumannomyces graminis var. tritici)的數(shù)量，并首次將該種土壤處理方法稱(chēng)為生物熏蒸。蕓薹屬植物組織中含有大量的硫代葡糖酸酯(Glucosinolates, GSLs), GSLs本身的殺生活性不高,但植物組織在腐爛過(guò)程中，GSLs可被植物自身產(chǎn)生的植物源酶一黑芥子酶(Myrosinase)水解而形成揮發(fā)性和殺生性很強(qiáng)的異硫氰酸酯(Isothiocyanates, ITCs)類(lèi)物質(zhì),對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的寄生線蟲(chóng)、 鍵刀菌(Fusarium spp.)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)大_花輪枝抱(Verticillium dahliae)、根腐絲囊霉(Aphanomyces euteiches)、疫霉(Phytophthoraspp.)和畸雌腐霉 (Pythium irregulare)等多種重要土傳植物病原菌和雜草昆蟲(chóng)等具有很強(qiáng)的抑制殺生作用。此外，生物熏蒸還能提高土壤有機(jī)質(zhì)含量、改善土壤結(jié)構(gòu)、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、對(duì)植物無(wú)藥害，因此被視為很有應(yīng)用前景的環(huán)保型土壤處理措施。生物熏蒸材料的降解是由微生物或酶參與的生物學(xué)過(guò)程，大量的應(yīng)用和研究發(fā)現(xiàn)，即使是相同的植物原料，生物熏蒸效果仍然不穩(wěn)定，可預(yù)見(jiàn)性差，影響生物熏蒸效果的因素主要有熏蒸材料中GSLs的總含量及GSLs的種類(lèi)、土壤水份含量、土壤溫度以及熏蒸材料的降解速度和降解程度，因此，如何通過(guò)優(yōu)化以上影響提高生物熏蒸的效果將是生物熏蒸技術(shù)研究的熱點(diǎn)。國(guó)外已有的研究表明，在土壤處理時(shí)間內(nèi)，蕓薹屬植物中硫代葡萄糖苷的降解率僅為30-50%，排除土壤條件及材料的破碎程度的影響后，促進(jìn)熏蒸材料中GSLs 降解的芥子酶的含量及活性高低是重要的影響因素，而通過(guò)在土壤中添加能促進(jìn)生物熏蒸材料快速降解、釋放殺生氣體的微生物菌株將為生物熏蒸研究提供新的思路和技術(shù)支撐。芥子酶普遍存在于所有含硫甙葡萄糖苷植物的種子、根、莖和葉中。目前在分屬 15個(gè)科500多種雙子葉植物中均鑒定到黑芥子酶的存在，但在實(shí)際的熏蒸過(guò)程中，植物內(nèi)源的芥子酶的活性仍不能滿(mǎn)足GSLs降解的要求。此外，國(guó)外研究還發(fā)現(xiàn)微生物體內(nèi)以及一些以含黑芥子酶的植物為宿主的昆蟲(chóng)中也存在黑芥子酶，例如Aspergillus sp. NR46F13、 啤酒酵母、交鏈抱霉屬的 Alternaria brassicae、莖點(diǎn)霉(Lepthosphaeria maculans 或 Phoma Iingam)、擬步行蟲(chóng)(Tenebrio molitor)、黃條跳甲(Phyllotreta undulate)、甘藍(lán)蟲(chóng)牙(Brevicoryne brassicae)、小菜蛾(Plutella xylostella)和粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等。但國(guó)內(nèi)對(duì)微生物或昆蟲(chóng)體內(nèi)芥子酶的研究幾乎還處于空白狀態(tài)。更未有通過(guò)添加產(chǎn)芥子酶的微生物提高生物熏蒸效果的公開(kāi)報(bào)道。深綠木霉由于其較強(qiáng)的生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)能力、對(duì)許多植物病原真菌的生長(zhǎng)抑制作用以及對(duì)作物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，已被國(guó)內(nèi)外作為一種重要的生防菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用，但對(duì)于能代謝產(chǎn)生芥子酶的深綠木霉，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)以蕓薹屬植物為土壤生物熏蒸材料時(shí)，其中的GSLs降解釋放殺生氣體ITCs的速度慢、降解程度低進(jìn)而熏蒸效果不穩(wěn)定的生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題，提出將一種能代謝產(chǎn)生芥子酶促進(jìn)GSLs降解釋放殺生氣體ITCs、同時(shí)對(duì)植物病原菌具有拮抗作用而對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用、生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、土壤定殖力強(qiáng)的深綠木霉 Trichederma atroviride菌株應(yīng)用于土壤的生物熏蒸，以提高其對(duì)土傳病蟲(chóng)害的防治效果O本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種產(chǎn)芥子酶的深綠木霉(Trichederma atroviride)菌株，其特征在于所述深綠木霉菌株的保藏號(hào)為CGMCCNo. 5609,該菌株在 PDA平板上30°C培養(yǎng)4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏松、平坦，初為白色；在培養(yǎng)的第3天明顯可見(jiàn)有孢子產(chǎn)生，最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋，培養(yǎng)基背面棕黃色。一種保藏號(hào)為CGMCC No. 5609的產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于 將所述深綠木霉以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬(Brassica spp.)植物組織為熏蒸材料的土壤中，通過(guò)生物熏蒸殺滅土壤中的病蟲(chóng)害，防治作物土傳病害。在所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用中所述深綠木霉的固體菌劑是這樣獲得的將深綠木霉的保藏菌株置入試管斜面培養(yǎng)基PDA中進(jìn)行試管斜面活化后，再置入裝有液體培養(yǎng)基I3DB的容量為250ml的三角瓶，裝液量為80ml/250ml ;將三角瓶置于搖床培養(yǎng) 3-4天，搖床的轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)期的環(huán)境溫度為28±2°C;結(jié)束后以5%接種量V/W接入固體培養(yǎng)基，在28±2°C環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)6-8天，每隔2-3天翻拌一次，至產(chǎn)孢；最后自然風(fēng)干或30°C烘干后粉碎過(guò)10-20目篩，獲得固體菌劑，固體菌劑中的含菌量為lO.Ucfu/g。在所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用中所述的試管斜面培養(yǎng)基PDA是這樣獲得的稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20 克，瓊脂20克，溶化后補(bǔ)足水至1000毫升；所述的液體培養(yǎng)基PDB是這樣獲得的稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20克，溶化后補(bǔ)足水至1000毫升；所述的固體培養(yǎng)基是由質(zhì)量配比為I : I : I的麩皮草炭稻草粉復(fù)配均勻混合后獲得。在所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用中所述的以固體菌劑形式加入到含有蕓薹屬植物組織的土壤中進(jìn)行生物熏蒸防治植物土傳病害是指在蕓薹屬植物組織均勻撒到土壤表層后，將固體菌劑均勻撒在植物組織表面，隨后進(jìn)行土壤旋耕，澆水后覆蓋塑料膜， 固體菌劑用量為30-40公斤/畝。在所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用中所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、 油菜、大白菜、甘藍(lán)的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)的殘?bào)w，或由它們制備的餅柏。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于保藏號(hào)為CGMCC No. 5609的產(chǎn)芥子酶的深綠木霉 (Trichederma atroviride)菌株,對(duì)殺生氣體ITCs有極強(qiáng)的耐受能力，它不僅能代謝產(chǎn)生促進(jìn)GSLs降解快速釋放殺生氣體ITCs，而且作為一種已被廣泛接受的生防菌，對(duì)多種土傳病害有較好的防效；尤其是該菌株生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)且產(chǎn)孢子量大，有較強(qiáng)的土壤及根際定殖能力，在土壤熏蒸期發(fā)揮其促進(jìn)ITCs釋放的功能，熏蒸結(jié)束后繼續(xù)發(fā)揮其生防菌的功能，是一株優(yōu)良的多功能生防菌株。該菌株的固體菌劑的可以通過(guò)常規(guī)的固體淺盤(pán)培養(yǎng)， 成本低，生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，本發(fā)明為土壤生物熏蒸注入新生力量，提供一種新的技術(shù)支撐。


圖I是深綠木霉(Trichederma atroviride)) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚類(lèi)結(jié)果。圖2是固體菌劑對(duì)瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的抑制作用；圖中，A為培養(yǎng)24小時(shí)的觀察圖，B為培養(yǎng)72小時(shí)的觀察圖。圖3是固體菌劑對(duì)立枯絲核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn)的抑制作用；圖中，A為培養(yǎng)24小時(shí)的觀察圖，B為培養(yǎng)72小時(shí)的觀察圖。圖4是固體菌劑對(duì)辣椒疫霉病菌(Pytophthora capsici Leonian)的抑制作用； 圖中，A為培養(yǎng)24小時(shí)的觀察圖，B為培養(yǎng)72小時(shí)的觀察圖。圖5是固體菌劑對(duì)辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)的抑制作用；圖中， A為培養(yǎng)24小時(shí)的觀察圖，B為培養(yǎng)72小時(shí)的觀察圖。圖6是固體菌劑對(duì)辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans) 的抑制作用；圖中，A為培養(yǎng)24小時(shí)的觀察圖，B為培養(yǎng)72小時(shí)的觀察圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從土壤中篩選得到一種木霉菌株，該菌株于2011年12月23 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。保藏號(hào)為CGMCC No.5609，菌株特征為在PDA平板上30°C培養(yǎng)4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏松、平坦，初為白色；在培養(yǎng)的第3天明顯可見(jiàn)有孢子產(chǎn)生，最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋，培養(yǎng)基背面棕黃色。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段鑒定為深綠木霉(Trichederma atroviride)。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果深綠木霉(Trichedermaatroviride) ITS 序列為 SEQ ID N0. I。
深綠木霉(Trichederma atroviride) 18SrDNA的ITS3部分序列分析聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖I。圖I為該深綠木霉(Trichederma atroviride)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采用鄰位相連算法(Neighbor Joining method)獲得分支系統(tǒng)樹(shù),并通過(guò)自舉分析(bootstrap)進(jìn)行置信度檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1000次。用Mega4. O進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類(lèi)分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。用Kimura 雙參數(shù)模型，計(jì)算各序列分化距離，缺少和不確定的位點(diǎn)在計(jì)算中被省略。結(jié)果表明該菌株與發(fā)育樹(shù)中深綠木霉(Trichederma atroviride)的同源性最高,達(dá)90%,所以確定該菌株為深綠木霉。實(shí)施例2 培養(yǎng)基的配制試管斜面培養(yǎng)基PDA的配制稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20克，瓊脂20克，溶化后補(bǔ)足水至1000毫升，裝量為試管高度的1/5-1/6，用試管塞塞好試管口，121°C高壓滅菌25min，趁熱取出后擺斜面至冷卻備用， 斜面高度不超過(guò)試管高度的1/3。液體種子培養(yǎng)基PDB的配制稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20克，補(bǔ)足水至1000毫升，然后分裝，裝液量為80-100ml/250ml 三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121 °C高壓滅菌25min，冷卻后備用。固體培養(yǎng)基的配制麩皮草炭稻草粉質(zhì)量配比為I: I : I。在本實(shí)施例中， 取麩皮1kg，草炭1kg、稻草粉Ikg均勻攪拌，加水調(diào)整培養(yǎng)基水分含量為60-65%，121 °C高壓滅囷40min,間隔24小時(shí)后在冋樣條件重新滅囷一次，冷卻后備用。實(shí)施例3 產(chǎn)芥子酶的深綠木霉(Trichederma atroviride)固體菌劑的制備(本實(shí)施例涉及的各種培養(yǎng)基均勻?qū)嵤├?提供)a)菌種的活化采用試管斜面保藏菌種的活化方法將試管斜面保藏的菌種挑取一塊直徑5mm左右的保藏號(hào)為為CGMCC No. 5609的深綠木霉菌絲塊接種到試管斜面培養(yǎng)基PDA中活化，在 28±2°C的環(huán)境中培養(yǎng)3-5天后備用。采用安瓿管冷凍干燥保藏菌種的活化方法在超凈工作臺(tái)中用70%酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中挫一道溝，用無(wú)菌紗布?jí)|或無(wú)菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開(kāi)安瓿管向其中加入0. 5-1. Oml液體培養(yǎng)基TOB，慢慢旋轉(zhuǎn)安瓿，使凍干菌種復(fù)水，然后再將此轉(zhuǎn)接到試管斜面培養(yǎng)基PDA中活化，在28±2°C的環(huán)境中培養(yǎng)3-5天后備用。b)液體培養(yǎng)將試管活化好的所述深綠木霉挑取三塊直徑8mm左右的菌塊分別接種在三個(gè)容積為250ml的裝有IOOml液體培養(yǎng)基PDB三角瓶中，置于搖床，搖床的轉(zhuǎn)速160r/min，在 28±2°C的環(huán)境中培養(yǎng)3-4天后備用。c)固體培養(yǎng)將液體培養(yǎng)好的250ml所述深綠木霉培養(yǎng)物接入5kg固體培養(yǎng)基中，將固體培養(yǎng)物平鋪在淺盤(pán)中，厚度5-8cm，上面蓋上雙層經(jīng)高壓滅菌處理的紗布，在28±2°C環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)6-8天，每隔2-3天翻拌一次，同時(shí)適當(dāng)補(bǔ)加無(wú)菌水，培養(yǎng)至產(chǎn)孢；最后自然風(fēng)干或30°C烘干(水分含量小于10% )即為固體菌劑，菌劑含菌量為lO—cfu/g。以上所有接種操作必須在無(wú)菌條件下，即在超凈工作臺(tái)的酒精燈旁或經(jīng)紫外線滅菌處理1-2小時(shí)的房間，固體培養(yǎng)的房間也需事先用紫外線滅菌處理1-2小時(shí)。實(shí)施例4保藏號(hào)為CGMCC No. 5609的深綠木霉(Trichederma atroviride)對(duì)生產(chǎn)上常見(jiàn)病原真菌生長(zhǎng)的抑菌試驗(yàn)參試菌株瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)；立枯絲核病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)；辣椒疫霉病菌(Pytophthoracapsici Leonian)；辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)；辣椒枯萎病菌(Fusaiumoxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)。試驗(yàn)方法將保藏號(hào)為為CGMCC No. 5609的深綠木霉及各病原菌分別單獨(dú)接種到PDA平板上，30°C恒溫培養(yǎng)，獲得各個(gè)菌株的新鮮菌絲塊(直徑5毫米)，再將該深綠木霉分別與各個(gè)病原菌的新鮮菌絲塊接種到PDA平板的中(每個(gè)平板接種I個(gè)深綠木霉的菌絲塊以及I種病原菌的菌絲塊)，兩個(gè)菌絲塊之間相距5厘米，30°C恒溫箱中分別于24小時(shí)和72小時(shí)培
養(yǎng)觀察。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2 圖6，由圖可見(jiàn)，保藏號(hào)為為CGMCC No.5609的深綠木霉 (Trichederma atroviride)對(duì)瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum);立枯絲核病菌(Rh izoctonia solani Kiihn);辣椒疫霉病菌(Pytophthora capsici Leonian);辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici);辣椒枯萎病菌(Fusaium oxyspourm Schl. f. sp. Suyd. et Hans)等都有比較明顯的生長(zhǎng)抑制作用，所述的深綠木霉主要是通過(guò)重寄生作用抑制或殺滅病原菌，即通過(guò)分泌多種復(fù)合抗生物質(zhì)或者能降解病原菌細(xì)胞壁的多種酶達(dá)到抑制靶標(biāo)病原菌生長(zhǎng)的效果。實(shí)施例5 產(chǎn)芥子酶的深綠木霉(Trichederma atroviride)固體菌劑(實(shí)施例3提供)的使用土壤施足底肥，再均勻施入事先破碎成5-8厘米長(zhǎng)短蕓薹屬植物組織或殘?bào)w或相應(yīng)餅肥，每畝用量干物重400-500公斤，將固體菌劑均勻撒到土壤表層，隨后進(jìn)行土壤旋耕，再給土壤澆水至土壤持水量的70%左右，然后覆蓋塑料薄膜，塑料薄膜四邊要深埋入土中確保密封不漏氣，平均土溫高于15度時(shí)保持10-13天，平均土溫低于15度時(shí)保持20-25 天，熏蒸結(jié)束后揭開(kāi)塑料膜自然晾曬2-3天后即可栽種。固體菌劑用量為30-40公斤。采用這種方法可完全殺死土壤中的各種病原生物和雜草種子，對(duì)土壤進(jìn)行徹底消毒，加入深綠木霉在夏季使得熏蒸時(shí)間縮短3-5天，冬天縮短5-7天。所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)的殘?bào)w，或由它們制備的餅柏。實(shí)施例6 :固體菌劑(由實(shí)施例3提供)加入到用菜柏作為熏蒸材料的土壤中對(duì)辣椒疫霉病的防效(盆栽試驗(yàn))
病原菌辣椒疫霉由本實(shí)驗(yàn)室收藏或者到中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心也可獲得?；瘜W(xué)熏蒸劑棉隆，由南通壟鑫農(nóng)藥有限公司提供。菜柏隴油7號(hào)油菜的菜柏。實(shí)驗(yàn)在溫室進(jìn)行，土壤為水稻田土自然風(fēng)干后過(guò)5mm篩后與草炭以5 I (V/V)比例混合備用，病原菌為辣椒疫霉游動(dòng)孢子液，接種濃度為100個(gè)孢子/g土。設(shè)以下處理1、 空白對(duì)照，土壤不作任何處理。2、病原菌，土壤只接種辣椒疫霉孢子液。3、棉隆+病原菌， 棉隆用量為O. 01% (W/W)。4、菜柏+病原菌，菜柏用量為O. I % (W/W)。5、固體菌劑+菜柏 +病原菌，菜柏用量為O. 1% (W/W)，固體菌劑接種濃度為IXlO6個(gè)孢子/克土。將每個(gè)處理的土壤混合物裝入塑料袋中密封，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。人工氣候箱條件為12h，35°C，相對(duì)濕度80%，另外1211，181，相對(duì)濕度80%。土壤濕度70%。培養(yǎng)10天后，打開(kāi)塑料袋口自然攤晾24小時(shí)后裝盆，移栽4葉期辣椒苗，每盆栽I棵，每個(gè)處理10棵，分別在移栽后的
7、15、21天觀察辣椒發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)做2次。表I盆栽條件下不同熏蒸方法對(duì)辣椒疫病發(fā)病率的影響)
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)芥子酶的深綠木霉(TricAeofezma airoririofe)菌株,其特征在于所述深綠木霉菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 5609，該菌株在PDA平板上30°C培養(yǎng)4天即可覆蓋直徑90mm的平板，菌絲體表面疏松、平坦，初為白色；在培養(yǎng)的第3天明顯可見(jiàn)有孢子產(chǎn)生， 最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋，培養(yǎng)基背面棕黃色。
2.一種保藏號(hào)為CGMCC No. 5609的產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于將所述深綠木霉以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬(Brassica )植物組織為熏蒸材料的土壤中，通過(guò)生物熏蒸殺滅土壤中的病蟲(chóng)害，防治作物土傳病害。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于所述深綠木霉的固體菌劑是這樣獲得的將深綠木霉的保藏菌株置入試管斜面培養(yǎng)基PDA中進(jìn)行試管斜面活化后，再置入裝有液體培養(yǎng)基PDB的容量為250ml的三角瓶，裝液量為80ml/250ml ;將三角瓶置于搖床培養(yǎng)3-4天，搖床的轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)期的環(huán)境溫度為28±2°C ;結(jié)束后以5%接種量V/W接入固體培養(yǎng)基，在28 ±2°C環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)6-8天，每隔2_3天翻拌一次，至產(chǎn)孢；最后自然風(fēng)干或30°C烘干后粉碎過(guò)10-20目篩，獲得固體菌劑，固體菌劑中的含菌量為Wcfu/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的試管斜面培養(yǎng)基PDA是這樣獲得的稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20克，瓊脂20克，溶化后補(bǔ)足水至1000毫升；所述的液體培養(yǎng)基PDB是這樣獲得的稱(chēng)取馬鈴薯200克，去皮，切成塊煮沸半小時(shí)，然后用兩層紗布過(guò)濾，再加葡萄糖20克，溶化后補(bǔ)足水至1000毫升；所述的固體培養(yǎng)基是由質(zhì)量配比為I :1 1的麩皮草炭稻草粉復(fù)配均勻混合后獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的以固體菌劑形式加入到含有蕓薹屬植物組織的土壤中進(jìn)行生物熏蒸防治植物土傳病害是指在蕓薹屬植物組織均勻撒到土壤表層后，將固體菌劑均勻撒在植物組織表面，隨后進(jìn)行土壤旋耕，澆水后覆蓋塑料膜，固體菌劑用量為30-40公斤/畝。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株的應(yīng)用，其特征在于所述的蕓薹屬植物組織是指芥菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)的植物組織，或芥菜、油菜、大白菜、甘藍(lán)的殘?bào)w，或由它們制備的餅柏。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)芥子酶的深綠木霉菌株及其應(yīng)用，深綠木霉菌株的保藏號(hào)為CGMCCNo.5609，使用中，是將所述深綠木霉以固體菌劑的形式施用到含有蕓薹屬植物組織為熏蒸材料的土壤中，通過(guò)生物熏蒸殺滅土壤中的病蟲(chóng)害，防治作物土傳病害。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102604842SQ20121006820
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月15日
發(fā)明者常志州, 張建英, 徐躍定, 殷蒙, 馬艷 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院