專利名稱：降解氰化物污染木霉菌轉化子的篩選與固定化制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種降解氰化物污染木霉菌轉化子的篩選與固定化制備方法，從利用限制性內切酶介導的基因整合技術(REMI)得到的木霉菌轉化子中，篩選到具有高氰化物降解活性的木霉菌轉化子，將其細胞固定化后應用于含氰廢水的處理。
背景技術：
由于現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展對產業(yè)生態(tài)保護日益重視，因此有效的處理工業(yè)排放的廢棄物是建立綠色工業(yè)的需要。氰化物作為工礦企業(yè)經常釋放的廢棄物中的主要成分，是對環(huán)境生物毒性最高的化學污染物之一，并可在水體和土壤中較長期富集。氰化物毒性機制至少有三種(1)與二價或三價的金屬形成復合物，(2)在酶解過程中生成穩(wěn)定的氰或腈衍生物，(3)與酮基團形成氰醇。
目前對于氰化物污染物處理最為常用的就是化學法，但其價格昂貴，污泥產量高，在處理過程中常常引入其他有害試劑，同時對于某些金屬氰化物的降解效率非常低。因此，急需一種低成本、高效率的方法來處理被氰化物污染的廢水和土壤，而生物降解則是最有前景的方法之一。
迄今為止，已經發(fā)現(xiàn)很多微生物都具有降解氰化物的能力，木霉便是其中之一。微生物主要是通過產生硫氰酸酶和氰水合酶降解游離氰化物。然而在活體微生物處理氰化物過程中發(fā)現(xiàn)，其對氰化物降解活性將受到多方面因素的影響，如與污水或土壤中其他微生物的競爭作用，生長受環(huán)境某種化學物質(離子)的抑制，抗逆能力差等。木霉作為土壤習居菌長期以來一直作為有生防價值的拮抗性真菌，其生長速度快，搶占空間時間短，競爭力強，同時其產生的厚垣孢子對環(huán)境高溫、高濕，干旱等逆境的抗性高，因此是一種很有實用價值的，能兼顧防治農作物病害的多功能氰化物降解微生物。然而，目前自然篩選的木霉菌菌株降解活性一般較低，而且篩選的工作量大，很難獲得各方面特性均理想的降解菌株，因此需要利用生物技術改良野生株，篩選出比野生株氰化物降解酶系活性更高的菌株。
活體降解微生物直接應用于污染環(huán)境的修復受到很多條件限制，因此一般需要經過固定化之后才能更好的發(fā)揮降解效應。利用固定化細胞建立高效的廢水處理系統(tǒng)于20世紀70年代就已經開始了，此技術具有反應器生物濃度高，處理能力大，污泥產量少，菌種高純高效，適應水質和pH變化等優(yōu)點。然而，利用固定化技術固定微生物，需要解決廢水中各種離子對固定化細胞的侵蝕和固定化載體結構易被破壞等問題，為此，需要研究如何提高固定化細胞機械強度和穩(wěn)定性，并保持固定化細胞原有的高降解活性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種降解氰化物污染木霉菌轉化子的篩選與固定化制備方法，得到的木霉菌轉化子能夠有效降解水體中的氰化物。
為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明首先利用限制性內切酶介導基因整合技術構建木霉菌突變株，通過對出發(fā)菌株及其轉化子間氰化物降解酶系的活性比較分析，篩選出對氰化物高降解活性的木霉菌轉化子，然后在確定了固相化過程中海藻酸鈉和CaCl2濃度、菌絲包埋量、固定化時間、降解溫度與時間等因素的基礎上，使用海藻酸鈉作為載體包埋轉化子細胞，制備固定化細胞小球。最后檢測固定化木霉菌轉化子對含氰廢水修復效應。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1、木霉菌轉化子的構建采用質粒30-40μg、濃度為10U/μl的限制性內切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質?；旌弦?，待用。將濃度為106-108/ml的木霉菌原生質體懸浮液100μl與配制成的酶-質?；旌弦夯靹蚝?，緩慢加入濃度為60％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，加入15-20ml已溶解好并冷卻到45-55℃的固體再生培養(yǎng)基，20-25℃下放置6小時后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10-15ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2-3天后出現(xiàn)轉化子。將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進行二次篩選，對可以正常生長的轉化子進行5-7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時仍舊能夠正常生長的就是通過REMI技術得到的穩(wěn)定的轉化子，把他們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調節(jié)pH值至5.0。固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎上加入18-20g瓊脂粉。
2、轉化子的硅膠粒保存通過對木霉氰化物降解酶的測定后，將得到的降解氰化物活性高的木霉菌轉化子在28℃條件下置于PDA(馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂)培養(yǎng)基培養(yǎng)，平板培養(yǎng)5-7天，使綠色孢子布滿整個培養(yǎng)皿。取螺旋口玻璃管，放入硅膠粒到玻璃管體積的1/4-1/2，經干熱滅菌處理后，冷卻，使用前冰浴15-30分鐘。取5％滅菌的脫脂牛奶0.5-2毫升加入培養(yǎng)皿中，水平搖晃，制成孢子懸液。用無菌移液管或槍吸取0.5-1毫升的孢子懸液，加到已冷卻的玻璃管中的硅膠粒表面，蓋上蓋后，迅速搖動，使硅膠粒濕潤并粘上孢子，立即放回冰浴。10-20分鐘后，擰緊蓋子放入4℃或-20℃冰箱中保存。
3、菌絲的培養(yǎng)取一粒上述浸潤孢子懸液的硅膠粒，放置于倒有PDA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天后，綠色孢子產生，挑取長有孢子的菌絲與5ml-6ml無菌水混合，挑取的孢子量使混合溶液呈綠色即可，用三層擦凈紙過濾得到濾液；取3ml濾液放入50-100ml PDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液體培養(yǎng)基，在搖床中，28℃下100-140rpm下培養(yǎng)60-70小時。將培養(yǎng)好的菌絲，三層擦鏡紙過濾，并用0.7M的NaCl或無菌水將菌絲中培養(yǎng)基沖洗干凈，得到綠色的濕菌絲體。
4、固定化小球的制備按2g-3g海藻酸鈉、1g硅藻土置于100ml蒸餾水的比例，將海藻酸鈉、硅藻土置于蒸餾水中，加熱攪拌溶解并濕熱滅菌，配制成海藻酸鈉溶液。
配制質量濃度為2-3％的CaCl2溶液，裝于瓶中濕熱滅菌。按每200ml海藻酸鈉溶液中放入濕菌絲5克的比例，將濕菌絲放入滅菌后的海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，使用20-50ml注射器吸取菌絲混合液，用針頭將其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并勻速攪拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小時，過濾得到固定化小球。用已滅菌的質量濃度為0.9％的NaCl溶液沖洗，洗去未結合的鈣離子。繼續(xù)將小球放入體積濃度為0.1-0.3％的戊二醛溶液中進行交聯(lián)30秒-2分鐘。用無菌水沖洗后，得到制備好的固定化小球，即為固定化木霉菌轉化子，4℃保存。
將采用本發(fā)明方法得到的固定化木霉菌轉化子加入到含有氰化物的基礎離子培養(yǎng)基中，52ppm和250ppm，500ppm的CN-分別在60小時，12天，22天后，降解率達到95％以上，氰化物的殘留濃度均低于國家檢測標準。
利用本發(fā)明制備的固定化小球來降解氰化物，其降解速度比游離細胞的降解速度要快，而且方便回收，回收的小球在用3％的CaCl2固定2小時后，又可以用于下一批的氰化物降解實驗。
具體實施例方式
以下結合具體的實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。
實施例11、轉化子構建和獲得采用質粒40μg、濃度為10U/μl的限制性內切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1M pH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質?；旌弦海?。將濃度為106/ml的木霉菌原生質體懸浮液100μl與前已配制完成的酶-質?；旌弦夯靹蚝?，緩慢加入濃度為60％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入9cm無菌培養(yǎng)皿中，加入已溶解好的冷卻到45℃，20ml固體再生培養(yǎng)基，25℃下放置6小時后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2天后出現(xiàn)轉化子。將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進行二次篩選，對可以正常生長的轉化子進行7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時仍舊能夠正常生長的就是通過REMI技術得到的穩(wěn)定的轉化子，把它們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1.8mg，MnSO4·H2O 3.2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調節(jié)pH值至5.0；固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎上加入18-20g瓊脂粉。
2、TkA8轉化子篩選與硅膠粒保存將REMI技術得到的轉化子進行降解氰化物酶系活性篩選后，得到了T30轉化子TkA8。將TkA8在PDA上28℃培養(yǎng)6天后，使綠色孢子長滿整皿。之前的準備工作中，將硅膠粒裝滿螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脫脂奶粉50ml，并濕熱滅菌。開始硅膠粒菌種保存前，先將硅膠粒管冰浴30分鐘。取出已培養(yǎng)好的TkA8，在培養(yǎng)皿中放入1ml的5％無菌脫脂奶粉，晃動培養(yǎng)皿，制成孢子懸液，吸取0.5ml的孢子懸液入在冰浴中的硅膠粒管中，迅速拿出劇烈搖動，以保證所有硅膠粒上都粘有孢子即可，再將其放回冰浴中，15分鐘后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkA8轉化子菌絲的培養(yǎng)取出TkA8轉化子硅膠粒一顆，放在已倒好PDA的培養(yǎng)皿中央，28℃溫箱中培養(yǎng)7天后，接種鉤挑出1/3皿上長有孢子的菌絲，與5ml無菌水混合，過濾后得到孢子懸液，取3ml于50ml PDB(馬鈴薯200g，葡萄糖20g，酵母浸膏15g，加水定容到1000ml)液體培養(yǎng)基中，28℃，轉速140rpm，培養(yǎng)70小時。之后，菌絲通過放了三層擦凈紙布氏漏斗過濾得到，用0.7M的NaCl的滅菌溶液洗去菌絲中的培養(yǎng)基。
4、固定化細胞小球的制備固定化細胞制備前，先稱取6g海藻酸鈉和2g硅藻土溶于200ml水中，溶解過程中要加熱攪拌，配制質量濃度為3％CaCl2溶液400ml，所用溶液均濕熱滅菌。另外配制體積濃度為0.3％400ml戊二醛溶液待用。將滅菌的海藻酸鈉-硅藻土200ml倒入400ml的燒杯中，稱取10g TkA8濕菌絲體(濕菌絲體∶海藻酸鈉-硅藻土＝1∶20)于其中，放入轉子攪拌，直至菌絲分布均勻。取無菌注射器，吸取海藻酸鈉-硅藻土-菌絲混合物，使用12號針頭將菌絲混合物注射入3％CaCl2溶液中，同時不斷攪拌CaCl2溶液，小球瞬時形成。將200ml的菌絲海藻酸鈉混合物都制備成小球后，讓它們在CaCl2溶液中，4℃條件下固定2小時，過濾得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液沖洗去多余的鈣離子后，將小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交聯(lián)1分鐘，過濾用無菌水洗凈。得到待用的固定化小球。游離菌絲與包埋入菌絲的海藻酸鈣小球的比例約為1∶18。
稱取10克固定化小球于基礎離子培養(yǎng)基中，固定化小球的重量與基礎離子培養(yǎng)基的體積之比為1∶7.5，并加入終濃度為52微克/毫升CN-氰化鉀溶液，180轉/分振蕩培養(yǎng)60小時后測定CN-濃度，降解率達到95％。
將已降解完全的培養(yǎng)基中的固定化小球取出，無菌水洗凈后，放入3％CaCl2溶液中，4℃固定2小時，得到的小球可以繼續(xù)利用降解含氰溶液，降解效率為新鮮制備的小球的92％，并且可以循環(huán)使用6次以上。
實施例21、轉化子構建和獲得采用質粒30μg、10U/μl的限制性內切酶HindIII10μl、山梨醇緩沖液(1MpH7.5)即STC 200μl，配制成酶-質?；旌弦?，待用。將濃度為106/ml的木霉菌原生質體懸浮液100μl與前已配制完成的酶-質?；旌弦夯靹蚝螅徛尤霛舛葹?0％2ml聚乙二醇即PEG，加入5ml預冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入9cm無菌培養(yǎng)皿中，加入已溶解好的冷卻到55℃，15ml固體再生培養(yǎng)基，25℃下放置6小時后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，3天后出現(xiàn)轉化子。將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進行二次篩選，對可以正常生長的轉化子進行5代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，此時仍舊能夠正常生長的就是通過REMI技術得到的穩(wěn)定的轉化子，把它們接種到PDA斜面上放在4℃冰箱中保存。
2、TkB5轉化子篩選與硅膠粒保存將REMI技術得到的轉化子進行降解氰化物酶系活性篩選后，得到了T30轉化子TkA8。將TkA8在PDA上28℃培養(yǎng)6天后，使綠色孢子長滿整皿。之前的準備工作中，將硅膠粒裝滿螺旋口玻璃管的1/3，配制5％脫脂奶粉50ml，并濕熱滅菌。開始硅膠粒菌種保存前，先將硅膠粒管冰浴30分鐘。取出已培養(yǎng)好的TkA8，在培養(yǎng)皿中放入1ml的5％無菌脫脂奶粉，晃動培養(yǎng)皿，制成孢子懸液，吸取0.5ml的孢子懸液入在冰浴中的硅膠粒管中，迅速拿出劇烈搖動，以保證所有硅膠粒上都粘有孢子即可，再將其放回冰浴中，15分鐘后取出，放入-20℃冰箱保存。
3、TkB5轉化子菌絲體的培養(yǎng)取出TkB5轉化子硅膠粒二顆，放在已倒好PDA的培養(yǎng)皿中，28℃溫箱中培養(yǎng)5天后，接種鉤挑出1/2皿菌絲，與5ml無菌水混合，過濾后得到孢子懸液，取5于100ml PDB液體培養(yǎng)基中，28℃，轉速140rpm，培養(yǎng)60小時后，菌絲通過放了三層擦凈紙布氏漏斗過濾得到，用無菌水將殘留的培養(yǎng)基沖洗干凈。
4、固定化小球的制備固定化小球制備前，先稱取3g海藻酸鈉和1克硅藻土溶于100毫升水中，溶解過程中要加熱攪拌，配制3％CaCl2溶液200毫升，所用溶液均濕熱滅菌。另外配制0.3％戊二醛200ml溶液待用。將滅菌的海藻酸鈉-硅藻土100毫升倒入200毫升的燒杯中，稱取5g TkB5濕菌絲體放于其中，攪拌至菌絲分布均勻。取具12號針頭的無菌注射器，吸取海藻酸鈉-硅藻土-菌絲混合物，注入3％CaCl2溶液中，不斷攪拌，小球瞬時形成。將200毫升的菌絲小球加入CaCl2溶液，4℃條件下固定3小時，過濾得到固定化小球，用0.9％NaCl溶液沖洗去多余的鈣離子后，將小球在4℃的0.3％戊二醛溶液中交聯(lián)2分鐘，過濾用無菌水洗凈，即得到待用的固定化小球。
稱取12.5g制備好的固定化小球放入100ml pH6.5的基礎培養(yǎng)基，加入500ppm CN-終濃度的氰化鉀，28℃，140轉/分，振蕩培養(yǎng)。在22天后，培養(yǎng)基中的KCN濃度的濃度可降解到0.2ppm。
權利要求
1.一種降解氰化物污染木霉菌轉化子的篩選與固定化制備方法，其特征在于包括以下步驟1)木霉菌轉化子的構建采用質粒30-40μg、10U/μl的限制性內切酶HindIII10μl、STC山梨醇緩沖液200μl，配制成酶-質?；旌弦海粚舛葹?06-108/ml的木霉菌原生質體懸浮液100μl與配制成的酶-質?；旌弦夯靹蚝?，緩慢加入濃度為60％2ml聚乙二醇，加入5ml預冷的STC，4℃下2000rpm離心15分鐘，棄上清，加入3ml液體再生培養(yǎng)基，混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中，加入15-20ml已溶解好并冷卻到45-55℃的固體再生培養(yǎng)基，20-25℃下放置6小時后，倒入含300μg/ml潮霉素的水瓊脂10-15ml，平鋪在再生培養(yǎng)基上，2-3天后出現(xiàn)轉化子；將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基進行二次篩選，對正常生長的轉化子進行5-7代PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再一次將轉化子培養(yǎng)在含有250μg/ml潮霉素的PDA培養(yǎng)基上，將仍能正常生長的穩(wěn)定的轉化子接種到PDA斜面上，放在4℃冰箱中保存；其中，所述液體再生培養(yǎng)基的配制為分別取硫酸銨2.8g，尿素600mg，硫酸鉀4g，無水氯化鈣600mg，葡萄糖40g，蔗糖100g，MgSO4·10H2O 200mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 10mg，ZnSO4.7H2O 1·8mg，MnSO4.H2O 3·2mg，CoCl2·6H2O 4mg加入到800ml水中，調節(jié)pH值至5.0；固體培養(yǎng)基則在液體培養(yǎng)基的基礎上加入18-20g瓊脂粉；2)轉化子的硅膠粒保存將經降解酶活性測定后得到的降解氰化物活性高的木霉菌轉化子在28℃條件下置于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，平板培養(yǎng)5-7天，使綠色孢子布滿整個培養(yǎng)皿，取螺旋口玻璃管，放入硅膠粒到玻璃管體積的1/4-1/2，經干熱滅菌處理后，冷卻，使用前冰浴15-30分鐘；取5％滅菌的脫脂牛奶0.5-2毫升加入培養(yǎng)皿中，水平搖晃，制成孢子懸液；用無菌移液管或槍吸取0.5-1毫升的孢子懸液，加到已冷卻的玻璃管中的硅膠粒表面，蓋上蓋后，迅速搖動，使硅膠粒濕潤并粘上孢子，立即放回冰浴，10-20分鐘后，擰緊蓋子放入4℃或-20℃冰箱中保存；3)菌絲的培養(yǎng)取一粒上述浸潤孢子懸液的硅膠粒，放置于倒有PDA的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天后產生綠色孢子，挑取長有孢子的菌絲與5-6ml無菌水混合使混合溶液呈綠色，然后過濾，取3ml濾液放入50-100ml PDB液體培養(yǎng)基，在搖床中，28℃、100-140rpm下培養(yǎng)60-70小時；將培養(yǎng)好的菌絲過濾，并用0.7M的NaCl或無菌水將菌絲中培養(yǎng)基沖洗干凈，得到綠色的濕菌絲體；4)固定化小球的制備按2g-3g海藻酸鈉、1g硅藻土置于100ml蒸餾水的比例，將海藻酸鈉、硅藻土置于蒸餾水中，加熱攪拌溶解并濕熱滅菌，配制成海藻酸鈉溶液；配制質量濃度為2-3％的CaCl2溶液，裝于瓶中濕熱滅菌，按每200ml海藻酸鈉溶液中放入濕菌絲5克的比例，將濕菌絲放入滅菌后的海藻酸鈉溶液中攪拌均勻，使用20-50ml注射器吸取菌絲混合液，用針頭將其打入200ml-400ml的上述CaCl2溶液中并勻速攪拌，形成φ3-5mm的小球，之后小球在CaCl2溶液中4℃下固定2-3小時，過濾得到固定化小球；用已滅菌的質量濃度為0.9％的NaCl溶液沖洗后，繼續(xù)將小球放入體積濃度為0.1-0.3％的戊二醛溶液中進行交聯(lián)30秒-2分鐘，用無菌水沖洗后，得到制備好的固定化小球，即為固定化木霉菌轉化子，4℃保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種降解氰化物污染木霉菌轉化子的篩選與固定化制備方法，首先利用限制性內切酶介導基因整合技術構建木霉菌突變株，通過對出發(fā)菌株及其轉化子間氰化物降解酶系的活性比較分析，篩選出對氰化物高降解活性的木霉菌轉化子，然后在確定了固相化過程中海藻酸鈉和CaCl
文檔編號C12N15/80GK1916157SQ20061003090
公開日2007年2月21日 申請日期2006年9月7日 優(yōu)先權日2006年9月7日
發(fā)明者陳捷, 周曉英, 劉力行, 陳云鵬 申請人:上海交通大學