一種胰島素在制備抗膿毒癥骨骼肌降解藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種胰島素在制備抗膿毒癥骨骼肌降解藥物中的應(yīng)用，屬于膽管炎癥藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】。該藥物為治療有效量的胰島素，注入量為2.4-4.8mU.kg-1.min-1，通過大量動物實驗，通過外源性的給予胰島素，可減少膿毒癥時內(nèi)毒素刺激下單核細(xì)胞TNF-a和IL-6的分泌，并抑制單核細(xì)胞核內(nèi)NF-kB的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)的分泌，從而可有效降低嚴(yán)重膿毒癥狀態(tài)下的骨骼肌蛋白降解率。
【專利說明】一種胰島素在制備抗膿毒癥骨骼肌降解藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種胰島素在制備抗膿毒癥骨骼肌降解藥物中的應(yīng)用，屬于膽管炎癥藥物制備【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]急性膽管炎的重癥類型(acute cholangitis severe type, ACST)是一種威脅生命的、起源于膽管的感染，存在著細(xì)菌易位和腸源性內(nèi)毒素血癥，其中，內(nèi)毒素可直接或間接觸發(fā)機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)，引起免疫功能紊亂，并造成機(jī)體高代謝狀態(tài)，最終導(dǎo)致多器官功能障礙甚至衰竭；且常伴發(fā)一個或多個臟器的功能障礙，容易發(fā)生膿毒性休克，及時解除膽道梗阻、通暢的膽汁引流、合理的抗生素應(yīng)用是目前臨床治療ACST的三種基本方法。ACST時膿毒癥發(fā)生率為100%，ACST發(fā)生膿毒癥時，蛋白合成抑制和高分解代謝是其主要特點，骨骼肌蛋白作為人體最大氮庫，約占機(jī)體細(xì)胞總重50%，其分解消耗對機(jī)體無疑會產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。膿毒癥會涉及功能性厭食、貧血、脂肪及胰島素抵抗等非常復(fù)雜的代謝紊舌L使機(jī)體陷入負(fù)氮平衡，導(dǎo)致不良預(yù)后，膿毒癥所引起的蛋白降解表現(xiàn)為“自噬性”和“強(qiáng)制性”特點，單純通過補(bǔ)充蛋白質(zhì)或氨基酸并不能有效抑制骨骼肌蛋白的高降解。早期骨骼肌的分解代謝對機(jī)體有利，用于合成急性期蛋白，可為機(jī)體提供大量游離氨基酸，供肝臟合成功能蛋白和進(jìn)行糖異生等，以使機(jī)體度過應(yīng)激期；但后期大量的蛋白持續(xù)分解供能，引起負(fù)氮平衡及一系列并發(fā)癥，導(dǎo)致全身炎癥介質(zhì)失控性“瀑布樣”釋放，多臟器功能受累，甚至死亡；ACST研究主要集中在如何更有效的阻斷或緩解嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，但對ACST所引起的機(jī)體高代謝研究甚少，僅僅停留在腸內(nèi)或腸外營養(yǎng)支持方面，而膿毒癥本身可導(dǎo)致外源性營養(yǎng)支持的不應(yīng)性，嚴(yán)重影響病人預(yù)后。
[0003]膿毒癥狀態(tài)下的骨骼肌高分解代謝是目前營養(yǎng)支持領(lǐng)域所面臨的一個難題，目前尚無一種有效的防治措施。80年代開始，調(diào)整分解代謝激素的分泌與改進(jìn)合成代謝的代謝調(diào)理治療受到重視。生長激素等治療盡管可減少手術(shù)、創(chuàng)傷引起的中度分解代謝病人的骨骼肌蛋白降解，取得了一定的療效，但同時有較多的副作用，而且與創(chuàng)傷相比，膿毒癥患者肌肉蛋白分解程度更加嚴(yán)重，生長激素并不能減輕這種傾向，為此，必須尋找更為有效的治療藥物。
[0004]目前有多項研究表明泛素一蛋白酶體通路(ubiquitin proteasomepathway ；UPP)是膿毒癥骨骼肌蛋白降解的重要途徑之一。UPP是細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質(zhì)降解通路，主要由三部分組成:①泛素:是標(biāo)記靶蛋白降解的信號分子，由76個氨基酸殘基組成的多肽，相對分子質(zhì)量約為8500，存在于所有細(xì)胞中；②泛素相關(guān)酶:包括泛素活化酶(El)、泛素偶聯(lián)酶(E2s)、泛素連接酶(E3s)、泛素鏈延長酶(E4)以及去泛素化酶，其中前三類負(fù)責(zé)活化，并介導(dǎo)泛素分子與特定靶蛋白結(jié)合，隨后在E4的作用下，形成能被蛋白酶體識別的降解信號一泛素鏈，其中E2 14k酶與骨骼肌蛋白降解關(guān)系密切；③蛋白酶體:泛素化蛋白的降解場所，其C2亞基為蛋白酶體的中心結(jié)構(gòu)。當(dāng)胰島素不足或胰島素抵抗將導(dǎo)致肌肉蛋白降解增加，且泛素-蛋白酶體的活性上調(diào)；泛素-蛋白酶體可通過降解胰島素受體底物(IRS)，從而產(chǎn)生胰島素抵抗；但對于糖尿病人，是胰島素的相對不足導(dǎo)致了泛素一蛋白酶體通路的激活，還是泛素蛋白酶體的活化引起或加重胰島素抵抗，或者二者互為因果，目前尚無定論。
[0005]胰島素的PI3K_Akt通路是胰島素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵通路，它不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝，還可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如糖原合成、蛋白質(zhì)合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運、抗脂肪分解、抑制細(xì)胞凋亡等，Akt/PKB為PI3K通路中的關(guān)鍵分子。最近有研究表明，在糖尿病大鼠中抑制PI3K途徑能增加泛素系統(tǒng)活性，導(dǎo)致肌肉蛋白分解，但膿毒癥狀態(tài)下的胰島素PI3K路徑和泛素一蛋白酶活性間的作用尚無任何研究。
[0006]回顧80多年的胰島素研究的歷程，胰島素作用之多樣，機(jī)制之復(fù)雜，至今仍未完全闡明，現(xiàn)在所認(rèn)識的胰島素的生理功能僅是其“冰山一角”，還存在諸多新功能等待人們發(fā)現(xiàn)與研究。探明胰島素對膿毒癥狀態(tài)下泛素系統(tǒng)介導(dǎo)骨骼肌蛋白質(zhì)分解的抑制作用及可能的信號傳導(dǎo)通路，將為胰島素在臨床膿毒癥等嚴(yán)重應(yīng)激狀態(tài)下的代謝調(diào)理治療提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服膿毒癥中代謝調(diào)理治療過程中所存在的機(jī)理不明、蛋白分解程度嚴(yán)重的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種應(yīng)用胰島素調(diào)理并抵抗膿毒癥機(jī)體尤其是骨骼肌高分解代謝治療方法，以滿足臨床膿毒癥等嚴(yán)重應(yīng)急狀態(tài)下的代謝調(diào)理治療。
[0008]本發(fā)明所述的藥物為治療 有效量的胰島素。
[0009]所述的胰島素的注入量為2.4-4.8mU.kg' mirT1。胰島素的注入量過低對骨骼蛋白降解影響較小，不能起到抗膿毒癥骨骼肌蛋白降解，胰島素注入量多高，則會引起血糖含量過高，患者會出現(xiàn)不適癥狀，因此，注入量控制在2.4-4.8mU.kg' mirT1，通過調(diào)節(jié)25%葡萄糖的輸注率(GIR)將血糖維持在5mmo/L左右；只有當(dāng)血糖超過11.9mmol/L時才加用胰島素。
[0010]胰島素一直廣泛應(yīng)用于臨床治療糖尿病，本發(fā)明通過大量動物實驗，通過外源性的給予胰島素，可減少膿毒癥時內(nèi)毒素刺激下單核細(xì)胞TNF-a和IL-6的分泌，并抑制單核細(xì)胞核內(nèi)NF-kB的表達(dá)，減少炎癥介質(zhì)的分泌。內(nèi)毒素、TNF-a等介質(zhì)是直接或間接導(dǎo)致骨骼肌蛋白降解的重要誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)因子，抑制炎癥介質(zhì)NF-kB途徑可有效降低嚴(yán)重膿毒癥狀態(tài)下的骨骼肌蛋白降解率。
[0011]泛素-蛋白酶體通路是真核生物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質(zhì)降解通路，不僅能降解變性的、異常的或起短暫作用的蛋白質(zhì)，而且能降解植物色素、轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)膜蛋白和細(xì)胞周期蛋白等天然蛋白質(zhì)，因而在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的降解、蛋白質(zhì)穩(wěn)定狀態(tài)的調(diào)節(jié)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期的控制和免疫介導(dǎo)等過程中起重要作用，其與膿毒血癥所致肌肉萎縮等密切相關(guān)。膿毒癥時細(xì)胞因子對骨骼肌蛋白合成起到抑制作用，如IL 一 6家族因子抑瘤素M通過UPP調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白Dl水平誘使骨骼肌細(xì)胞停滯在Gl期，抑制蛋白合成并誘導(dǎo)凋亡。膿毒癥時骨骼肌蛋白降解增強(qiáng)，并多伴有嚴(yán)重的代謝性酸中毒，UPP上調(diào)是酸中毒時骨骼肌流失的蛋白質(zhì)增加內(nèi)在機(jī)制。
[0012]MG-132是最早用于研究的蛋白酶體抑制劑，其通過結(jié)構(gòu)中的醛基和蛋白酶體催化中心20S的β I和β 2蘇氨酸殘基的-OH結(jié)合，形成一個半縮醛的結(jié)構(gòu)，可逆性的抑制蛋白酶復(fù)合體的活性，應(yīng)用MG-132后ACST膿毒癥骨骼肌內(nèi)UPP通路受到抑制，泛素、E2-14K、蛋白酶體C2亞基相關(guān)基因表達(dá)均降低，蛋白酶體C2亞基的蛋白表達(dá)亦降低，同時降低了骨骼肌蛋白降解率；而應(yīng)用MG-132阻斷UPP通路后，再應(yīng)用胰島素鉗夾ACST膿毒癥大鼠正常血糖，結(jié)果骨骼肌蛋白降解得到進(jìn)一步改善，UPP通路受到進(jìn)一步抑制。蛋白酶體催化中心20S的β復(fù)合體酶分別具有類糜蛋白酶活性(ChTL)、類胰蛋白酶活性(TL)、蛋白酶樣活性，而目前蛋白酶體抑制劑主要抑制其中的一個或兩個來阻止蛋白的降解，如MG-132就只抑制類糜蛋白酶，對其他的兩個酶沒有影響。采用MG132對UPP進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)MG132可以誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞凋亡，凋亡率與MG132呈量效關(guān)系，泛素、E1、E2、E3、26S蛋白酶體mRNA的表達(dá) 均降低，與MG-132呈量效關(guān)系。低胰島素大鼠的UPP活性和骨骼肌蛋白分解顯著增加，蛋白酶體c2和c8亞基的表達(dá)也能被胰島素所抑制，從而使骨骼肌蛋白分解下降。經(jīng)胰島素鉗夾正常血糖的ACST膿毒癥大鼠，在基因水平上亦提示UPP活性受到抑制，且呈現(xiàn)出胰島素應(yīng)用劑量上的依賴性。
[0013]胰島素發(fā)揮生理作用的信號傳導(dǎo)通路中，IRS-1磷酸化是胰島素大部分生物學(xué)效應(yīng)的啟動步驟，它下游主要存在三條信號偶聯(lián)系統(tǒng)，包括PI3K信號通路、G蛋白信號通路和大鼠肉瘤基因(RAS)信號連接通路。其中，胰島素的PI3K通路是胰島素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵通路，它不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝，還可產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)，如糖原合成、蛋白質(zhì)合成、葡萄糖轉(zhuǎn)運、抗脂肪分解、抑制細(xì)胞凋亡等，Akt/PKB為PI3K通路中的關(guān)鍵分子。膿毒癥時Akt活性下降，而胰島素能激活A(yù)kt，從而抑制UPP活性表達(dá)。這一影響可能來源于胰島素受體水平、或胰島素受體底物-1水平；也可能是在Akt水平直接影響。而應(yīng)用LY294002特異阻斷胰島素PI3K路徑后，完全阻斷了胰島素激活A(yù)kt的作用，ρ-Akt蛋白表達(dá)水平下降，而UPP活性明顯增強(qiáng)，骨骼肌蛋白降解增強(qiáng)，這表明激活PI3K-Akt通路是胰島素影響UPP活性的主要機(jī)制。
[0014]因此，胰島素是通過抑制UPP活性來降低ACST膿毒癥大鼠骨骼肌降解率，通過本發(fā)明首次揭示了胰島素抑制膿毒癥骨骼肌蛋白降解的機(jī)制，ACST膿毒癥狀態(tài)下，胰島素能抑制骨骼肌降解，該作用可能是通過在基因和蛋白水平激活PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制UPP表達(dá)和活化而實現(xiàn)的。
【具體實施方式】
[0015]1.藥物制備
[0016]膜島素的給予量為2.4mU.kg-1.min_l和4.8mU.kg-1, min-1兩種規(guī)格。
[0017]2.建立動物實驗?zāi)Ｐ筒⒎诸?br> [0018]⑴實驗動物
[0019]選用二級清潔健康SD大鼠(浙江省實驗動物中心提供)40只，雄性，體重227~385g，標(biāo)準(zhǔn)顆?；旌巷暳?浙江省實驗動物中心提供)喂養(yǎng)，所有大鼠實驗期間禁食，靜脈給予葡萄糖 4.5mg.kg-1.min-1。
[0020]選用人外徑約0.9mm的硬膜外麻醉導(dǎo)管(規(guī)格F3，購于浙江海圣醫(yī)療器械有限公司)，并從近端(即鈍頭，含側(cè)孔)剪下長約5cm—段，遠(yuǎn)端連接帶有封帽的注射組件，以用于頸外靜脈及膽總管置管。所余另一段用于頸內(nèi)動脈置管，其近端加熱并略拉長，使其變軟為平口，防止刺穿血管壁，遠(yuǎn)端組件接微電腦數(shù)字式注射泵。[0021](2)大鼠正常血糖鉗夾模型制備
[0022]大鼠在ACST模型建立前6天，行右頸外靜脈、左頸內(nèi)動脈置管備用。所有大鼠置管前禁食6小時，自由飲水。1%的戊巴比妥(50mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，解剖出右頸外靜脈后，遠(yuǎn)端結(jié)扎；剪開頸外靜脈，用眼科鉗夾住血管壁后置入外徑約0.9mm的硬膜外麻醉導(dǎo)管，深度約3~4cm，雙線固定不可拔出，導(dǎo)管由頸背部皮膚引出固定。300uL等滲鹽水(肝素40U/mL)氨節(jié)青霉素5g/L沖洗導(dǎo)管,后用80%?\^-1(含肝素30011/11^)充滿導(dǎo)管防止血液返流，肝素帽封口，為血糖檢測采血用。另一麻醉導(dǎo)管置入左頸內(nèi)動脈直至主動脈弓，并經(jīng)皮下延續(xù)至頸背，穿行于彈簧螺旋管內(nèi)，彈簧一端用蝴蝶夾固定于頸背部皮膚，另一端固定于飼養(yǎng)籠外的支架上。導(dǎo)管外端接微電腦數(shù)字式注射泵，為造模術(shù)中輸液備用。待ACST模型建立后，將胰島素、25%葡萄糖分別用二個微電腦數(shù)字式注射泵由頸內(nèi)動脈泵入，每30min經(jīng)頸外靜脈抽血用血糖儀測定血糖濃度，并通過調(diào)節(jié)25%葡萄糖的輸注率(GIR)將血糖維持在5mmo/L左右；只有當(dāng)血糖超過11.9mmol/L時才需加用胰島素。
[0023](3) ACST膿毒癥大鼠模型建立
[0024]1%的戊巴比妥(50mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，無菌條件下進(jìn)人腹腔后，在膽總管距左右肝管匯合處Icm處離斷膽管，遠(yuǎn)端結(jié)扎，近端插入直徑0.9mm的麻醉導(dǎo)管，插入深度6_，妥善固定硅膠管后經(jīng)皮膚穿一小孔置于體外，逐層關(guān)腹。確定膽汁排出通暢后，向?qū)Ч軆?nèi)緩慢注入大腸桿菌內(nèi)毒素(055B5) 10mg/kg,再注射空氣0.2ml，然后用封帽封閉導(dǎo)管，隨即關(guān)腹。而對于假手術(shù)組，僅在無菌條件下進(jìn)入腹腔，鈍性剝離膽總管周圍組織后即關(guān)閉腹腔。
[0025](4)動物分組
[0026]40只SD大鼠按月齡、體重同窩飼養(yǎng)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、ACST模型組、低劑量胰島素ACST模型組(胰島素給予量為2.4mU.kg-1.min-1)、高劑量胰島素ACST模型組(胰島素給予量4.8mU.kg-1.min-1), MG132 +高胰島素ACST模型組、MG132ACST模型組、LY294002 +高胰島素ACST模型組、LY294002ACST模型組，每組5只。其中阻斷泛素一蛋白酶通路方法為，在內(nèi)毒`素注射30分鐘后腹腔注射泛素一蛋白酶體特異性抑制劑MG132 (30mg/kg) (merck公司德國)；阻斷PI3K_Akt通路的方法為，在內(nèi)毒素注射30分鐘后頸外靜脈注射PI3K特異性阻斷劑LY294002 (0.3mg/kg) (merck公司德國)。
[0027]3.檢測標(biāo)本和方法
[0028]模型建立用藥后12小時分離雙側(cè)伸趾長肌、股四頭肌，進(jìn)行離體-80°C冰箱凍存待測。主要指標(biāo)檢測:高效液相一色譜分析法檢測伸趾長肌內(nèi)3 -甲基組氨酸含量；real-time PCR法檢測伸趾長肌內(nèi)編碼泛素、E2_14k和蛋白酶體C2亞基的mRNA表達(dá)變化。蛋白免疫印跡法檢測股四頭肌內(nèi)蛋白酶體C2亞基的蛋白表達(dá)變化，以及胰島素信號傳導(dǎo)PI3K-Akt通路中p-Akt蛋白表達(dá)的變化。
[0029](I)高效液相一色譜分析法檢測伸趾長肌內(nèi)3 -甲基組氨酸
[0030]①儀器、試劑美國安捷倫(Aglient Technologiesl200Series)高效液相色譜儀，486紫外檢測器，冷凍真空抽吸系統(tǒng)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，Waters PICO-TAG分析柱(3.9X300mm)。甲醇、乙腈為德國Merck公司產(chǎn)品，乙酸鈉為英國BDH公司產(chǎn)品，3-MH為美國Sigma公司產(chǎn)品。
[0031]②樣品處理大鼠雙側(cè)伸趾長肌稱重后，分別移入含500ul3%三氯乙酸的2ml勻漿管內(nèi)，高速勻漿，勻漿液移入0.5ml離心管，14000r (4°C )離心25min，吸取上清液，待用。取上清液30ul冷凍干燥，再加50ul衍生試劑，在室溫下衍生反應(yīng)20min后繼續(xù)冷凍真空干燥，進(jìn)樣前以50ul流動相A液稀釋，進(jìn)樣20ul。
[0032]③色譜條件流動相A:1000ml超純水內(nèi)含9.54g乙酸鈉，25ml乙腈，250ul IOmmolEDTA，用10%乙酸調(diào)pH值為6.50。流動相B:450ml乙腈加400ml超純水和150ml甲醇。衍生試劑:異硫氰酸苯酯(PITC):甲醇:乙醇:三乙胺:水=1:6:1:1:1。紫外波長254nm，柱溫 46°C。
[0033](2)Real-time PCR檢測伸趾長肌內(nèi)編碼泛素、E2_14k和蛋白酶體C2亞基的mRNA表達(dá)變化
[0034]①肌組織內(nèi)總RNA的提取
[0035]將50mg伸趾長肌在液氮中磨成粉末后，加入1ml RNA提取液(Trizol:北京艾德萊生物科技有限公司)內(nèi)高速(32000r / min)勻漿，4°C、10000Xg離心lOmin，取上清液按Iml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，4°C、12000Xg離心15min,取上層水相,按每ImlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，4°C、12000 Xg離心IOmin0棄上清液，按每ImlTrizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇進(jìn)行洗滌，4°C、7500X g離心lOmin，洗滌沉淀，棄上層75%的乙醇溶液。讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥5min，加50ul的0.01%焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Genview公司)溶解RNA沉淀60°C IOmin, _70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0036]②反轉(zhuǎn)錄成cDNA
[0037]根據(jù)RT-PCR試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每樣本均加入lug RNA，將混合好的液體放置在PCR儀中，輕輕混勻，42°C孵育50min，65°C加熱15min失活TUREscript H—Rtase，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于一 20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> [0038]③PCR反應(yīng)
[0039]實時熒光定量PCR在羅氏ROCHE實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行，采用real_timePCR試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作。PCR擴(kuò)增體系50ul，雙蒸水50ul，Tag DNA聚合酶0.5ul，上下游引物各lul，cDNA模板2ul。PCR引物:參閱相關(guān)文獻(xiàn)，并通過Genebank檢索，以Primer5.0軟件設(shè)計大鼠泛素引物序列、作為內(nèi)參照的大鼠管家基因GAPDH引物序列、大鼠E2-14k和蛋白酶體C2亞基的引物序列，由上海激活生物科技公司合成。引物序列分別如下:(1)泛素(ubiquitin, Ub):擴(kuò)增片段為156bp,5’ -TAAGAC CAT CAC CCT CGA TT-3’(正義鏈)；5’ -TGG ATG TTG TAG TCA GAC AGG G-3’(反義鏈)；(2)三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH);擴(kuò)增片段為309bp，5’-TCC CTC AAG ATT GTC AGCAA’-3(正義鏈);5，-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3，(反義鏈);(3) E2_14k:擴(kuò)增片段為 251bp，5’-TTATGAAGGTGGCTATTATC-3’(正義鏈)，5’ - TCGTGAAGTCCGATGTCT-3’(反義鏈)；(4)蛋白酶體C2亞基:其擴(kuò)增片段為234bp:5’ -AGCAAGGCTCAGCGACAG-3’(正義鏈)，5’ -GGCGAGATACGGGAAGTG-3’(反義鏈)。將PCR反應(yīng)體系置手掌型離心機(jī)內(nèi)數(shù)秒鐘離心混勻后，置PCR儀(羅氏ROCHE實時熒光定量PCR儀)內(nèi)。反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性2min ;然后進(jìn)行40個循環(huán)的反應(yīng)，每一循環(huán)包括變性94°C，30sec，退火60°C，30sec,延伸72°C，30sec,最后72°C IOmin結(jié)束反應(yīng)。以假手術(shù)組大鼠肌肉組織各mRNA表達(dá)量為參照量，采用2_AAc;t法計算各模型組肌肉組織對應(yīng)mRNA相對表達(dá)量ΛΛ Ct= (Ct目的基因一 Ct管家基因)模型組一(Ct目的基因一 Ct管家基因)假手術(shù)組。表示模型組目的基因的表達(dá)相對于假手術(shù)組的變化倍數(shù)，使用Iightcycler 480 sofeware 1.5軟件分析。
[0040](3) Western blot測定骨骼肌組織C2亞基蛋白的表達(dá)以及胰島素信號傳導(dǎo)PI3K-Akt通路中p-Akt蛋白表達(dá)的變化。
[0041]①蛋白樣本的制備
[0042]將股四頭肌組織塊稱重，利用液氮、研缽粉碎組織，每克組織加入3ml RIPA蛋白裂解液，超聲波粉冰浴勻漿破碎。然后4°C、13000r / min離心15min，將上清液移至1.5mlEP管中，一 80°C冰箱中儲存待用。
[0043]②蛋白定量取IOOul股四頭肌蛋白樣品通過BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。
[0044]③蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳與轉(zhuǎn)膜參照文獻(xiàn)。
[0045]電泳:配制10%分離膠10ml，灌注分離膠至玻璃夾層中，室溫聚合60min。配制4%的積層膠，灌注積層膠置玻璃夾層中，插入梳子至積層膠溶液中，室溫聚合30min。用5XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液按1:4稀釋蛋白樣品，100°C沸水浴中變性5min。以IXTAE電泳緩沖液充滿電泳槽，將玻璃板放入電泳槽，小心拔出梳子。加樣孔中加入蛋白樣品(固定蛋白總量)后連接電源，調(diào)節(jié)電壓90V，電泳約Ih后，當(dāng)溴酚藍(lán)染料從積層膠進(jìn)入分離膠，調(diào)節(jié)電壓至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部為止關(guān)閉電源，取出凝膠。
[0046]轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后將取下的凝膠在適量的轉(zhuǎn)移緩沖液中室溫平衡30min。裁剪一張與凝膠大小一樣的聚偏氟乙烯(PVDF)膜及4張3麗濾紙，并以適量的轉(zhuǎn)移緩沖液平衡lOmin。電轉(zhuǎn)裝架，從負(fù)極到正極方向依次為:濾紙一凝膠一PVDF膜一濾紙，逐層疊放，壓平并排除氣泡。
[0047]④免疫化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白質(zhì)
[0048]I XTBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。用含5%的脫脂奶粉溶液稀釋純化的一抗(工作濃度1:2500，abeam公司，英國)，與PVDF膜孵育，4°C振蕩孵育過夜。I X TBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。用含5%的脫脂奶粉溶液稀釋HRP標(biāo)記的二抗(工作濃度1:5000，Jackson公司，美國)，與PVDF膜孵育2h，室溫輕柔搖動。I X TBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。應(yīng)用UltraECL底物化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)進(jìn)行蛋白檢測，于暗室中將顯色劑A、B各0.5ml混勻室溫平衡lmin，加入PVDF膜。用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，以去除膜上多余的液體。膜的蛋白面朝上，置于潔凈保鮮膜。用吸管將配制的發(fā)光檢測液轉(zhuǎn)移到蛋白膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育1-2分鐘。用平頭鑷夾持蛋白膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，以去除膜上多余的液體。膜的蛋白面朝上，包裹于潔凈保鮮膜內(nèi)。輕輕趕出其間的氣泡，固定在X片暗盒內(nèi)。在暗室中取一張X片直于包裹的I旲上，合上暗盒，曝光I分鐘。將曝光后的X線片置于顯影液中，輕輕晃動數(shù)十秒后放人定影液中，稍后開燈觀察結(jié)果，掃描膠片，結(jié)果應(yīng)用IMAGE J2X軟件分析WB條帶，根據(jù)電泳條帶的面積和平均灰度，計算樣本的灰度值(面積X平均灰度)，計算目的蛋白相對表達(dá)量:目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。
[0049]4.統(tǒng)計學(xué)結(jié)果分析
[0050]采用SPSS11.0軟件進(jìn)行多組間單因素方差分析，計量資料以表示，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；而1111?^相對表達(dá)量數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，故采用中位數(shù)結(jié)合范圍表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。P〈0.05或P〈0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0051](I)伸趾長肌內(nèi)3-MH含量的變化(見表1)
[0052]ACST模型組大鼠伸趾長肌內(nèi)3-MH含量為(3.69 土 0.20)nmol/g，較假手術(shù)組(2.07 士 0.13)nmol/g顯著升高(P=0.000);顯著高于高胰島素ACST模型組(2.39 土 0.21)nmol/g(P=0.000)和低胰島素 ACST 模型組(2.87 土 0.19) nmol/g (P=0.000)。MG132 +高胰島素ACST模型組大鼠伸趾長肌內(nèi)3-MH含量為(2.09 土 0.19) nmol/g和MG132ACST模型組(2.32 土 0.18)nmol/g 較 ACST 模型組均顯著降低(P=0.000,0.000) ? LY294002 + 高胰島素 ACST 模型組為(3.63 土 0.11) nmol/g、LY294002ACST 模型組為(3.62 土 0.17) nmol/g,與ACST模型組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.607,0.546)。MG132 +高胰島素ACST模型組、LY294002 +高胰島素ACST模型組以及LY294002ACST模型組大鼠伸趾長肌內(nèi)3-MH含量較高胰島素ACST模型組均顯著降低(P=0.011,0.000,0.000)。MG132ACST模型組骨骼肌內(nèi)3-MH含量與高胰島素ACST模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.523)。而MG132+高胰島素ACST模型組與MG132ACST模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.049)。
[0053]表1大鼠伸趾長肌內(nèi)3-MH含量(Ι±^，n=5)
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種胰島素在制備抗膿毒癥骨骼肌降解藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為治療有效量的胰島素。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的胰島素的注入量為2.4-4.8mU.kg—1.mirf1。
4.一種抗膿毒癥骨骼肌降解的藥物，其特征在于:所述的藥物為治療有效量的胰島 素。
5.如權(quán)利要求4所述的一種抗膿毒癥骨骼肌降解的藥物，其特征在于:所述的胰島素的注入量為 2.4-4.8mU.kg' mirT1。
【文檔編號】A61P29/00GK103721246SQ201310694178
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】魯葆春 申請人:紹興市人民醫(yī)院