本申請要求2015年5月14日提交的美國臨時申請?zhí)?2/161,380的申請日的權益，其公開內容在此通過引用并入本文。

技術領域

本實用新型涉及血液培養(yǎng)系統(tǒng)，具體地涉及具有低培養(yǎng)基體積的血液培養(yǎng)系統(tǒng)。

背景技術：

由于其高發(fā)生頻率和高住院死亡率，膿毒癥是重大的衛(wèi)生保健問題。膿毒癥的主要原因之一是血流感染(BSI)。BSI最通常通過血液培養(yǎng)診斷，其中在氣氛受控的封閉系統(tǒng)中使用微生物生長培養(yǎng)基培育血液的樣品以促進細菌生長。當前的自動化血液培養(yǎng)系統(tǒng)可能耗費12-48小時檢測血液中感染性微生物的存在，并且可能耗費多至5天以排除任何感染性微生物的存在。

通常，額外的物質必須與血液培養(yǎng)結合以確保盡可能迅速和準確地測定BSI的存在或不存在。例如，采樣時患者的血液可能已經包含抗生素?？股氐拇嬖诳赡苓M一步增加檢測感染性微生物的存在所需的時間。此外，可耗費多至額外的12-48小時通過傳代培養(yǎng)陽性血液培養(yǎng)物并進行鑒定和抗菌敏感性測試來鑒定引起感染的微生物。這些結果對于更改治療過程太遲，并且導致更嚴重的疾病，并且甚至導致患者的死亡。因此，吸附抗生素并中和其對微生物生長的抑制效應的添加物也添加至血液培養(yǎng)基。

當前的血液培養(yǎng)系統(tǒng)具有促進微生物生長和更快的檢測時間的多種試劑的肉湯混合物。促進微生物生長的一個重要因素是使用生長培養(yǎng)基稀釋血液樣品。使用生長培養(yǎng)基稀釋患者的血液被認為減少抗生素的抑制效應和可能存在于血液樣品中的患者的免疫應答組分。

為了能夠恢復(recover)微生物、改進微生物的恢復和/或減少檢測在抑制微生物生長的高抗生素濃度下的微生物生長所需的時間，多個種類的吸附樹脂可以用于吸附患者的血液樣品中的抗生素。然而，吸附樹脂還可以吸附對微生物生長的早期檢測必不可少的培養(yǎng)基的其它成分。當培養(yǎng)基是溶解性培養(yǎng)基(lytic media)時，吸附樹脂可以吸附溶解性試劑(例如，皂苷)的組分。這樣的吸附引起對微生物生長必不可少的溶解性功能和營養(yǎng)物二者的減少，導致更長的檢測時間。

為了減少或最小化或控制物質如抗體和抗生素的抑制效應，推薦的血液對肉湯比率在大約1∶5至大約1∶10的范圍內。參見Wilson，Michael L.等，Principles and Procedures for Blood Cultures；Approved Guidelines，Clinical and Laboratory Standards Institute，M47-A，Vol.27，No.17，p.8(2007年5月)和Versalovic，J.等，Manual of Clinical Microbiology，Vol.1，Diagnostic Strategies and General Topics，p.16，10th ed.，ASM Press，(2003)(Murray，P.R.等-編輯)。公認的偏好是使用較大體積的血液樣品(每次抽取10ml至20ml)用于培養(yǎng)。參見Forbes，B.等Diagnostics Microbiology，Part 3：Diagnosis by Organ System(10th ed.1998).P 292。

用于接種血液培養(yǎng)瓶的推薦的血液體積是大約8ml至大約10ml，使得推薦的肉湯體積在至少50和150ml之間。因而，用于此血液培養(yǎng)種類的容器是大體積的，使得其難以精確地控制抽取的血液的體積以精確地抽取規(guī)定的8-10ml的血液體積的8-10ml血液(Weinstein，Melvin P.Current Blood Culture Methods and Systems：Clinical Concepts，Technology，and Interpretation of Results.The University of Chicago，Clinical Infectious Diseases，1996)。此外，還存在縮減血液培養(yǎng)消耗品的經濟、工效學和環(huán)境需求。

隨著培養(yǎng)基組分的改進，尤其是將樹脂并入生長培養(yǎng)基，可以減少微生物生長需要的肉湯體積，因為樹脂將吸附抗生素(如果存在)中的一些，其減輕抗生素對微生物生長的不利影響。因而，當前的血液培養(yǎng)系統(tǒng)已經在1∶3和1∶4的血液對肉湯體積比的情況下成功。一個實例是Becton BACTEC^TM(Becton Dickinson and Company的商標)Plus Aerobic產品，其使用至少1∶3的血液對肉湯比率，以及8-10ml血液體積的樣品。當前仍然認為高濃度的血液對肉湯比率(例如1∶2和更大)對產生檢測需要的必需量的全部陽性培養(yǎng)物不是有效的，并且應當被避免。(Weinstein，Current Blood Culture Methods and Systems)。然而，盡管通過使用樹脂實現(xiàn)了功效的改進，但是依舊尋求提供改進的檢測時間同時減少所需的血液樣品和/或肉湯的量的血液培養(yǎng)環(huán)境。

技術實現(xiàn)要素：

根據本實用新型的一個實施方式，將血液樣品遞送入培養(yǎng)基，以使血液體積在大約4ml至大約10ml的范圍內，并且血液體積對將血液樣品遞送入其的培養(yǎng)基的體積的比率是大約2∶1至大約1∶2。在某些實施方式中，比率是大約1∶1。因此，在其中血液對培養(yǎng)基比率是大約2∶1至大約1∶2的實施方式中，培養(yǎng)基體積的范圍是大約2ml至大約20ml。在其中血液對培養(yǎng)基比率是大約1∶1的實施方式中，培養(yǎng)基的體積是大約4ml至大約10ml。

根據本實用新型的另一個實施方式，血液體積是大約1ml至大約3ml，在該實施方式中，培養(yǎng)基的體積在大約0.5ml至大約6ml的范圍內。

在本實用新型的另一個實施方式中，培養(yǎng)基的體積小于40ml，并且血液體積對培養(yǎng)基的比率在大約2∶1至大約1∶2的范圍內，其中血液體積不超過大約20ml。

根據本實用新型的另一個實施方式，血液體積是大約3ml至大約4ml，并且血液體積對培養(yǎng)基的體積的比率是大約2∶1至大約1∶2。

附圖說明

圖1圖解了用于本實用新型的實施方式的血液培養(yǎng)瓶的兩種不同的配置。

圖2A-C圖解了使用肉湯中較高濃度的血液測定不存在抗生素抑制劑的血液中的微生物生長的本實用新型的一個實施方式。

圖3A-C圖解了使用肉湯中較高濃度的血液(提供1∶1的較低的血液對肉湯比率)測定包含抗生素抑制劑的血液樣品中的微生物生長的方法。

圖4A-C圖解了在抗生素存在的情況下PlusAer、PlusLytic和MicroVolume樣品制劑之間的恢復速率比較。

具體實施方式

本文描述了以肉湯中較高濃度的血液(提供較低的血液對肉湯比率)制備和測試血液培養(yǎng)樣品的方法。優(yōu)選地，“肉湯中較高濃度的血液”指的是肉湯(或培養(yǎng)基)體積等于或小于培養(yǎng)樣品的血液體積(例如1∶1、2∶1)。培養(yǎng)基和肉湯在本文是可交換地使用的。與使用更稀釋的血液對肉湯比率(例如1∶3、1∶4)的當前的工業(yè)血液培養(yǎng)樣品瓶相比，本文描述的具有肉湯中較高濃度的血液(即提供較低的血液對肉湯比率)的樣品顯示了類似的或甚至改進的檢測時間(“TTD”)結果。如本文使用的，檢測時間或“TTD”定義為在血液微生物接種入容器的時間點和系統(tǒng)能夠檢測容器中的微生物生長的時間點之間經過的時間。

在一個實施方式中，血液培養(yǎng)物不包含抗生素抑制劑。在另一個實施方式中，血液培養(yǎng)物包含預定量的抗生素抑制劑。

本文描述的方法使用具有1∶1多至大約2∶1的較低的血液對肉湯比率的血液培養(yǎng)物。在其中布置血液培養(yǎng)物的血液培養(yǎng)瓶的體積和配置可以變化。例如，圖1圖解了血液培養(yǎng)瓶的兩種不同的配置。瓶11是銷售為BACTEC^TM Plus Aerobic瓶的80ml的瓶，其是包含30ml液體培養(yǎng)基和在大約2克至大約6克的范圍內的樹脂的80ml的瓶。BACTEC^TM是Becton Dickinson and Company的商標。瓶12是30ml的瓶，其提供有大約8ml的培養(yǎng)基和也在大約2克至大約6克的范圍內的樹脂。培養(yǎng)基體積可以在大約5ml至大約20ml的范圍內變化。瓶的實際體積主要地是設計選擇的問題，取決于因素，比如，瓶體積、液面上空間的配置，瓶將接收的血液和肉湯的總體積、傳感器類型、傳感器配置等。可選的瓶或管配置包括試管、鋼瓶、燒瓶等。

使用較低的血液對肉湯比率允許較小量的生長培養(yǎng)基和試劑，允許使用較小體積的血液培養(yǎng)瓶。較小體積的血液培養(yǎng)瓶可以具有減小的直徑、較低的高度或二者。減小的直徑的瓶還允許通過與較大的80ml的瓶相比更準確地指示的體積抽取的更精確量的血液。體積的減小還減少消耗品的成本，并且與當前的標準的80ml的瓶相比通過立刻允許更多待測試的小瓶而允許儀器足跡(footprint)的減少。

實施例1：使用標準比率/標準體積和低比率/低體積的多種微生物的檢測時間(TTD)的比較

比較大約1∶5的血液對培養(yǎng)基體積(即8ml的血液和40ml的培養(yǎng)基)的標準比率與1∶1的血液對培養(yǎng)基體積的檢測時間。使用不具有溶解性試劑的培養(yǎng)基(非溶解性培養(yǎng)基)和具有溶解性試劑的培養(yǎng)基(溶解性培養(yǎng)基)二者。非溶解性培養(yǎng)基是BACTEC^TM Aerobic培養(yǎng)基。對于1∶4比率的樣品，使用40ml的培養(yǎng)基。標準BACTEC Aerobic瓶包含40ml的培養(yǎng)基。因此對于1∶1比率的實施例，在樣品被引入瓶之前，從瓶中移除32ml的培養(yǎng)基。為了使培養(yǎng)基是溶解性的，將大約0.25％的皂苷添加至培養(yǎng)基。

如上所述，制備了四組樣品。兩組具有1∶4的標準血液對肉湯比率，并且兩組具有1∶1的比率。每種比率的兩組中的一個具有非溶解性培養(yǎng)基，并且另一組具有溶解性培養(yǎng)基。為了產生具有1∶1的血液對肉湯比率的樣品，取出了標準BACTEC Aerobic瓶中40ml的培養(yǎng)基中的32ml，僅留下剩余的8ml肉湯。為了使肉湯是溶解性的，溶解性試劑——皂苷——以在各自的標準比率和低比率樣品中產生0.25％的濃度的量被添加至剩余的肉湯(1∶4的比率為40ml且1∶1的比率為8ml)。將大約8ml的血液和10-100cfu的在下面的表1中列出的每種微生物接種入每個瓶。具有原始的40ml培養(yǎng)基的BACTEC Standard Aerobic瓶用于具有1∶4的血液對肉湯比率的那些樣品。將全部接種的瓶放置入BD BACTEC^TM FX儀器，并且在35℃下培養(yǎng)5天。結果顯示在下面的表1中鑒定的八種微生物的檢測時間是彼此相當的。因此，1∶1的血液對培養(yǎng)基比率支持血液培養(yǎng)中的微生物生長，即使低的1∶1比率的血液稀釋系數顯著地小于常規(guī)的1∶4。

表1：使用標準比率和體積以及低比率和體積的多種生物體的TTD

驚人地，具有1∶1比率(低比率/低體積)的樣品表現(xiàn)類似于具有1∶4比率(標準比率/標準體積)的樣品。而且，上面的表顯示，對于一些微生物，具有溶解性培養(yǎng)基的瓶的TTD低于具有非溶解性培養(yǎng)基的瓶的TTD。然而，對于測試的微生物中的一些，與具有非溶解性培養(yǎng)基的瓶相比，觀察到具有溶解性培養(yǎng)基的瓶的TTD的增加。由于樣品尺寸是小的，這些觀察結果未必指示具有非溶解性培養(yǎng)基的瓶與具有溶解性培養(yǎng)基的瓶相比TTD的實質性差異。

圖2圖解了使用較低的血液對肉湯比率測定不存在抗生素抑制劑的血液樣品中的微生物生長的方法。圖2A圖解了將8ml的血液201引入4ml的液體培養(yǎng)基202。血液201和液體培養(yǎng)基202在16ml無菌和加蓋的管203中結合，其產生了2∶1的血液對肉湯比率204。圖2B圖解了將8ml的血液201引入8ml的液體培養(yǎng)基206。血液201和液體培養(yǎng)基206在19ml無菌和加蓋的管205中結合，其產生了1∶1的血液對肉湯比率207。在圖2A和圖2B中，容器中的傳感器是固態(tài)熒光O₂傳感器。熒光信號改變解釋為指示微生物生長。圖2C圖解了將8ml的血液201引入30ml的液體培養(yǎng)基209。血液201和液體培養(yǎng)基209在商業(yè)上可獲得的BACTEC^TMStandard Aerobic產品(“StdAer”)中結合，其產生了至少1∶3的血液對肉湯比率210。

液體培養(yǎng)基是基于BACTEC Myco/F溶解性培養(yǎng)基使用額外的皂苷改進的培養(yǎng)基。樣品分別裝載(即加入(spike))10-100CFU的微生物211。測試的微生物是糞產堿桿菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、大腸桿菌、腦膜炎雙球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌(2種不同的菌株)、表皮鏈球菌(Streptococcus epdidermidis)、肺炎鏈球菌和釀膿鏈球菌。在管的底部上使用的傳感器212使用與如在BACTEC Myco/F溶解瓶中類似的配方制造。

對于每種微生物，血液培養(yǎng)瓶203、205、208在添加微生物211后立刻顛倒5次，并且然后裝載入BACTEC FX儀器。接頭(adaptor)用于支撐管，使得管穩(wěn)固地停留在位置中，并且位于用于檢測的適當位置。管和瓶培育5天，并且檢測來自培養(yǎng)瓶傳感器212的信號用于TTD分析。對每種微生物進行一式三份的培養(yǎng)。

步驟的結果描繪在下面的表2中。如表2中顯示的，與具有至少1∶3的血液對肉湯比率的商業(yè)上可獲得的BACTEC^TM Standard Aerobic瓶相比，具有1∶1的血液對肉湯比率207和2∶1的血液對肉湯比率204的血液培養(yǎng)瓶203、205(圖2)顯示了類似或甚至更短的TTD。

表2：低體積/低比率TTD與標準的1∶4比率的TTD的比較

具有1∶1的血液對肉湯比率207的制劑中的11種測試的微生物的平均TTD是11.7小時。具有更稀釋的至少1∶3的血液對肉湯比率210的BACTEC Standard Aerobic瓶208具有15.0小時的平均TTD，其比1∶1的樣品207長。類似地，具有2∶1的血液對肉湯比率204的16ml的瓶210的平均TTD是13.0小時。1∶1和2∶1的血液對肉湯比率207、204的較短的TTD相對于當前的更稀釋的血液對肉湯比率——如具有至少1∶3的血液對肉湯比率210的BACTEC Standard Aerobic瓶——是預料不到的結果和改進。

實施例2：在有抗生素的培養(yǎng)基抑制劑中的生長

圖3圖解了使用肉湯中較高濃度的血液(從而提供1∶1的較低的血液對肉湯比率)測定包含抗生素的血液樣品中的微生物生長的方法，所述抗生素將抑制至少一些微生物的生長。在抗生素存在的情況下，微生物生長的TTD可以在使用除生長培養(yǎng)基之外的樹脂以增強微生物的生長的樣品中縮短。樹脂的主要功能是中和或吸附患者血液中的抗生素。樹脂可以另外顯著地減小抗生素的抑制效應，并且使培養(yǎng)基體積減少變得可能。也已經認為血液培養(yǎng)基中的溶解性試劑有益于微生物恢復和縮短TTD。這潛在地是由于血細胞溶解，其轉而釋放吞噬的微生物并產生更好的恢復。顯示有效地溶解血細胞而不影響微生物的生存力和生長的通常使用的溶解性試劑的一個實例是皂苷——一種植物提取物。為了最小化微生物生長的TTD，在接種時，額外的皂苷可以添加至具有肉湯中較高濃度的血液的混合物。本領域技術人員知道其它溶解性試劑，并且本實用新型不限制使用任何一種溶解性試劑。

與至少1∶3的標準的稀釋的血液對肉湯比率相比，測試了在存在抑制性抗生素的情況下1∶1的血液對肉湯比率的表現(xiàn)。在下面描述了1∶1的血液對肉湯比率的兩種不同的樣品制劑。

圖3A圖解了低體積/低比率制劑，其在30ml的小瓶中用布置在單獨的室中的樹脂和溶解性培養(yǎng)基制備。制劑包含樹脂和8ml的總的溶解性培養(yǎng)基。容器中的傳感器是固態(tài)熒光O₂傳感器。熒光信號改變用于測定微生物生長。調整低體積/低比率制劑的尺寸以與大約8ml的血液樣品結合，其中血液對肉湯比率是大約1∶1。低體積/低比率制劑提供了1∶1的血液對肉湯比率。將總的8ml溶解性培養(yǎng)基分為兩部分。一部分的溶解性培養(yǎng)基與樹脂在30ml的瓶中，并且另一部分的溶解性培養(yǎng)基在單獨的裝置中，并且在瓶接種有血液樣品和微生物二者時，其中的培養(yǎng)基在無菌條件下添加入30ml的瓶。

圖3B圖解了確認為“PlusLytic”的第二樣品制劑。PlusLytic制劑使用商業(yè)上可獲得的BACTEC Plus Aerobic產品，其是80ml的瓶中的30ml的培養(yǎng)基。在測試時，8ml的血液、預定量的抗生素、10-100CFU的微生物、和額外的20mg的皂苷與瓶中的30ml的培養(yǎng)基結合。血液對培養(yǎng)基的比率是8∶30，其是大約一份血液對3.7份培養(yǎng)基。此比率通常稱為1∶4，即使培養(yǎng)基的體積不完全是樣品的量的4倍。

對照測試樣品制劑描繪在圖3C中，并且確認為“PlusAer”。PlusAer制劑使用商業(yè)上可獲得的BACTEC Plus Aerobic產品，而沒有任何額外的培養(yǎng)基組分。在測試時，8ml的血液、預定量的抗生素、和10-100CFU的微生物與BACTEC Plus Aerobic產品的內容物結合。因此，血液對肉湯比率略小于1∶4[即8ml血液∶30ml培養(yǎng)基]。

使用64種抗生素/微生物組合測試每種樣品制劑。測試的抗生素是慶大霉素、阿莫西林-克拉維酸、氨曲南、頭孢曲松、頭孢吡、亞胺培南、美洛培南、哌拉西林-三唑巴坦、萬古霉素、替加環(huán)素(Tigecycline)、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氟康唑。接種入每個測試瓶的藥物數量等于其在7ml的血液中的峰值血清水平下的藥物量。這些抗生素與它們通常治療的某些微生物組合。例如，阿莫西林-克拉維酸與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和糞腸球菌組合。在存在藥物的情況下，測試每種樣品的TTD和微生物的恢復二者。

彼此間隔幾分鐘，向培養(yǎng)基接種血液樣品、抗生素和皂苷。

在TTD測試中，對于環(huán)丙沙星(Ciprofloxicin)、哌拉西林/三唑巴坦、和替加環(huán)素，低體積/低比率樣品制劑具有與對照樣品制劑(1∶4的PlusAer)相似的表現(xiàn)。當使用萬古霉素、頭孢吡、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松和美洛培南測試時，與PlusAer制劑相比，低體積/低比率制劑具有更快的TTD。參見下面的表3。對于僅一種抗生素——慶大霉素，與PlusAer制劑相比，低體積/低比率制劑具有更短的TTD。表現(xiàn)驚人地給出了本領域中的常規(guī)的觀點：在低體積(即總的20ml或更少)下使用相對于肉湯較高量的血液(即較低的比率)(例如1∶1和2∶1的體積血液對體積培養(yǎng)基)不能實現(xiàn)可以接受的TTD。

表3：抗生素和微生物的不同組合的TTD/陽性的比較

關于藥物吸附效率，低體積低比率制劑證明具有更快的吸附速率。較低體積制劑中的總抗生素吸附效率類似于PlusAer制劑中的總抗生素吸附效率。

圖4在存在抗生素的情況下比較了PlusAer、PlusLytic和低體積/低比率樣品制劑中的微生物的恢復速率。在每次比較中，測試的64種抗生素/微生物組合對各個制劑中的微生物生長是陽性的或陰性的。

圖4A比較了包含1∶1的血液對肉湯制劑的低體積/低比率制劑與對照——其是PlusAer制劑(其具有1∶4比率的血液對肉湯)——的恢復速率。低體積/低比率制劑在47種情況中測試為陽性，而PlusAer對照制劑在43種情況中測試為陽性。PlusAer對照制劑在21種情況中測試為陰性，而低體積/低比率制劑在17種情況中測試為陰性。有差異的結果可顯示在2種情況中，其中對于相同的抗生素/微生物組合，低體積/低比率制劑測試為陰性，而PlusAer測試為陽性。有差異的結果在6種情況中獲得，其中對于相同的抗生素/微生物組合，PlusAer對照制劑測試為陰性，并且低體積/低比率制劑測試為陽性。低體積/低比率的總的恢復表現(xiàn)在統(tǒng)計學上等于PlusAer對照。

圖4B比較了包含1∶4的血液對肉湯比率的PlusLytic制劑與對照——PlusAer制劑(也是1∶4)——的恢復速率。PlusLytic制劑在47種情況中測試為陽性，而PlusAer對照制劑在43種情況中測試為陽性。PlusAer對照制劑在21種情況中測試為陰性，而PlusLytic制劑在17種情況中測試為陰性。有差異的結果可顯示在一種情況中，其中對于相同的抗生素/微生物組合，PlusLytic制劑測試為陰性，而PlusAer測試為陽性。有差異的結果還顯示在五種情況中，其中對于相同的抗生素/微生物組合，PlusAer對照制劑測試為陰性，并且PlusLytic制劑測試為陽性。因而，當與對照比較時，PlusAer(1∶4)和Pluslytic(1∶4)實質上表現(xiàn)相同。

圖4C比較了包含1∶1比率的血液對肉湯制劑的低體積/低比率制劑與PlusLytic制劑的恢復速率。低體積/低比率(1∶1)制劑和Plus Lytic制劑均在47種情況中測試為陽性。低體積/低比率(1∶1)制劑和Plus Lytic制劑均在17種情況中測試為陰性。有差異的結果可顯示在兩種情況中，其中對于相同的抗生素/微生物組合，低體積/低比率(1∶1)制劑測試為陰性，而PlusAer測試為陽性。有差異的結果還顯示在兩種情況中，其中對于相同的抗生素/微生物組合，PlusAer對照制劑測試為陰性，并且低體積/低比率(1∶1)制劑測試為陽性。

圖4A和4C的恢復速率比較指示了與具有1∶4的血液對肉湯比率的制劑相比，包含1∶1的血液對肉湯比率的制劑顯示了與對照大約相同的恢復速率，也就是圖4A的低體積/低比率制劑和圖4C的低體積/低比率(1∶1)制劑的比較。

雖然已經參照具體的實施方式描述了本文的實用新型，但是應當理解這些實施方式僅說明本實用新型的原理和應用。因此，應當理解可以對說明性實施方式做出眾多改進，并且可以設計其它布置，而不背離如所附的權利要求限定的本實用新型的精神和范圍。